专利名称：调控玉米叶夹角的主效qtl的分子标记及其方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种调控玉米叶夹角的主效QTL紧密连锁的分子标记及其方法与应用。
背景技术：
玉米是我国第二大农作物。玉米既是高产粮食作物，又是重要的多元经济作物，在粮食作物中产业链最长，增值效益最高。玉米的产量、质量关系到饲料工业、食品工业、化工工业及能源产业。我国近年来玉米消费量持续增加，已经形成了以玉米生产为基础的产业格局链条。提高单产、增加总产、发展玉米生产，对于社会经济发展具有重要的基础支撑作用，对于实现由农业大国走向农业强国、实现农业增产增效、农民增收等均具有重要的战略意义。从发展趋势看，国内玉米供求将出现偏紧格局。由于我国耕地资源非常有限，耕地资源减少的趋势难以逆转，增加玉米总产量主要依靠提高单产水平。在过去几十年里美国玉米杂交种的单株生产力没有明显提高而提高生产力的主要原因是增强了种植密度和抗逆性。所以，伴随着耕地面积逐渐减少，在未来几年内，依靠增加种植密度提高单产将仍然是育种家选择的主要目标。然而在很大程度上，玉米株型决定种植密度并影响冠层光截获率、 抗病性和抗倒性，所以，株型改良是现代育种目标的重要组成部分，也是进一步提高玉米产量的有效途径之一。因此，研究玉米株型相关性状的遗传规律对促进玉米耐密型新品种选育具有重要的理论和实践意义。玉米叶夹角是影响玉米株型的一个重要因素。从密植观点来看，具有相对较大叶夹角的玉米植株影响了玉米冠层内光分布，增大了冠层对下层叶片的遮阴，进而降低了光合效率；而叶夹角相对较小的玉米植株玉米冠层内光分布较合理，减少了冠层对下层叶片的遮阴，进而改善了光的有效截取数量，提高了群体生产力。叶夹角与种植密度对产量的影响已被广泛研究，在密植条件下，含有无叶舌基因的liguleleSS2杂交种与正常杂交种相比平均亩产高41. 2% (Pendleton et al. 1968)；叶夹角大的杂交种B14X0h43禾口 0h43XR177与叶夹角小的杂交种Iigulelessl和liguleless2在不同的密度下种植，结果表明liguleleSS2在75，000和90，000株/公顷的种植密度下产量显著高于玉米杂交种 B14X0h43 和 0h43XR177(Lambert and Johnson 1978)。此外，Childs 在 2002 年美国玉米高产竞赛中，用先锋杂交种;34N44创造了 1850公斤/亩的高产记录，种植密度达到72M株 /亩，最高种植密度达到8237株/亩；李登海于2005年用杂交种DH3719创下1290公斤/ 亩的夏玉米高产纪录，其密度接近7000株/亩。这些事实说明，紧凑型玉米杂交种能够最大限度增加种植密度进而提高玉米单位面积群体产量。近年来玉米产量提高的主要原因不是单株杂种优势的提高，而是通过单位面积种植更多的株数即群体杂种优势和抗逆性的提高。目前我国玉米种植密度比较低，进一步提高产量的最大潜力就在于创造叶夹角适宜的株型提高种植密度
发明内容
本发明的目的提供一种调控玉米叶夹角的主效QTL紧密连锁的分子标记及其方法与应用。本发明的技术方案是一种调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记，由 p-bnlgl484和LA25两对引物组成，所述引物p_bnlgl484的序列为Fl 5' -GTAAAAGACGACGACATTCCG-3‘Rl 5' -GACGTGCACTCCGTTTAACA-3‘；所述弓丨物LA25的序列为F2 5' -AAAGTCTCTCGTCCTCCAG-3‘R2 5' -GAACACTAACAAACATCGC-3‘。 所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记的方法以玉米总DNA为模板，用引物对p-bnlgl484和LA25进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为220和270的DNA片段。所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在玉米叶夹角的早期预测和筛选中的应用。所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在耐密型玉米的选育的应用。本发明的有益效果是本发明通过SSR分子标记和QTL分析，在第一染色体上位于标记bnlgl484与LA5025之间存在一个调控叶夹角大小的QTL，它位于第一染色体的1. 02 位点，介于标记bnlgl484和标记LA25之间，贡献率为20. 4%。分析表明该标记的有无直接关系到植株叶夹角的大小，能够用于种植材料叶夹角大小的预测。以此标记对玉米总DNA进行PCR扩增后，使用凝胶电泳分离得到长度分别为220 和270的DNA片段。该标记的有无直接关系到该植株叶夹角大小。在玉米育种和资源鉴定或对玉米植株叶夹角大小的早期预测和筛选中，该分子标记能克服环境影响，对种植材料的早代筛选，淘汰叶夹角大的植株，提高育种和选择效率。将其应用于玉米叶夹角大小鉴定中，能对不同种质材料叶夹角大小进行预测。
图1为玉米回交系连锁群及其QTL位置图。
具体实施例方式实施例一种调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记，由p-bnlgl484和LA25两对引物组成，所述引物P_bnlgl484的序列为Fl 5' -GTAAAAGACGACGACATTCCG-3‘Rl 5' -GACGTGCACTCCGTTTAACA-3‘；所述引物LA25的序列为F2 5' -AAAGTCTCTCGTCCTCCAG-3‘R2 5' -GAACACTAACAA ACATCGC-3‘。所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记的方法以玉米总DNA为模板，用引物对p-bnlgl484和LA25进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为220和270的DNA片段。所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在玉米叶夹角的早期预测和筛选中的应用。所述调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在耐密型玉米的选育的应用。图1为玉米回交系连锁群及其QTL位置图，其中，图左侧为标记距离(单位厘摩)；右侧为标记名称。
QTL染色体LOD值标记区间贡献率(％)qLAl18. 6LA502538. 6一种获得调控玉米叶夹角主效QTL的分子标记的方法的详细步骤如下(1)玉米叶夹角BC3F2和BC3F2 3家系性状鉴定群体的构建及叶夹角的度量选用叶夹角小、株型紧凑的玉米自交系豫82为亲本I(Pl)与叶夹角大、株型松散的玉米自交系沈137为亲本2 (P》进行杂交，得到杂交一代杂种(Fl).由杂种一代Fl与沈 37连续杂交3次，获得回交三代(BC3F1)。BC3F1自交获得BC3F2分离群体，BC3F2分离群体单株自交授粉获得杂种三代家系(BC3F2:3)的性状鉴定家系。当年春季在河南农业大学科教园区种植P1、P2、F1和BC3F2。其中，BC3F2群体种植300株。当植株生长到5-7片叶时取PI、P2、Fl和300株BC3F2单株的2片幼嫩叶片提取总DNA。提取总DNA的300株BC3F2单株开花期套袋单株自交，配制BC3F2家系。提取总 DNA的具体方法为改良的SDS法。当年冬季在海南三亚种植Pl、P2和255个有足够种子量的BC3F2:3家系。种植采用随机区组设计，具体为单行区，行距0. 70米，行长为4米，每行15株，随机区组排列，3次重复。田间管理常规操作保证各处理栽培条件的一致性。在开花后10天调查叶夹角。叶夹角是茎与所要调查叶片腹面的叶脉的夹角。在每个BC3F2 3家系中，从中间随机取连续的5个单株度量穗上部的所有叶片的叶夹角，以每株所有度量叶片夹角的平均值代表调查的单株叶夹角，再以每个小区所有度量单株的平均值代表每个家系的叶夹角值。以提取的玉米总DNA为模板进行PCR扩增后得到的长度分别为220和270的DNA 片段，其步骤如下(1)玉米总DNA的提取在玉米5-10片叶时取1片幼嫩适量叶片用液氮磨碎后用于总DNA的提取。采用改良的SDS法提取总DNA。具体步骤如下①取5g新鲜的玉米叶片在液氮中研成粉末，装入50ml的离心管中；②在离心管中加入预热至65°C的SDS提取液15ml，再加入30 μ 1 β-巯基乙醇混勻，在水浴锅中65°C水浴40 60min ；③取出加入5M KAC 5mL，冰水浴IOmin ；④加入15ml氯仿异戊醇04 1)充分混勻，缓慢摇动至呈墨绿色，室温下静置 IOmin, 4°C，12000r/min 离心 15min ；⑤；取上清液，加入约15ml预冷(_20°C )的异丙醇，旋转混勻，置于4°C冰箱中， DNA呈絮状析出，用玻璃针将DNA钩出，置于7ml离心管中，加IOnMMMMAC的76%乙醇中浸泡2h ；
⑥倒掉酒精，将DNA干燥2h，加入适量TE溶解DNA，DNA溶解后，加40-50 μ 1 RNase(10mg/ml)，37°C保温lh，加入等体积酚氯仿异戊醇05 24 1)混合液，轻轻摇动 IOmin, 8000r/min 离心 IOmin ；⑦取上清液于另一 7ml离心管中，加入等体积氯仿异戊醇04 1)，轻轻摇动 IOmin, 8000r/min 离心 IOmin ；⑧取上清液于50ml离心管中，加入200%体积的(预冷为_20°C )异丙醇，置于 4°C冰箱中lOmin，DNA缓慢析出；⑨钩出DNA至1.5ml离心管中，加入适量76 %乙醇浸泡30min，8000r/min离心 2min，常温干燥6 12h ；⑩加入300-500 μ 1 TE溶解，充分溶解DNA，置于_20°C冰箱中保存。(2) PCR 扩增所述PCR总体积为15 μ 1，反应体系为10Xbuffer(含 Mgcl2) 1. 5μ 10. 5mmol/l dNTP0. 3 μ 1Taq 酶(IU)0. 1 μ 120ng/yl 弓I物1. 5μ 1ddH208· 6 μ 120ng/ μ 1 模板 DNA3. O μ 1将各反应组分混勻后，加入20 μ 1矿物油覆盖，在PTC-200型PCR仪上扩增。PCR反应程序Stepl 95°C 2minSt印2 95 "C Imin乂印3 65"C Imin ;_1 /cycle乂印4 72 "C 1. 5minStep5 goto step 2，7 timesSt印6 95 °C Imin乂印7 58 °C Imin乂印8 72 °C 1. 5minStep9 goto step 6,28 times乂印10 72 °C 5minStepll :4°C 保存扩增产物的检测①扩增DNA变性在扩增产物中加入6μ1 loading buffer，95°C变性6min。立即置于冰水混合物Loading buffer :98% 甲酰胺49ml (100%), IOmM EDTA(PH = 8. 0) Iml (0· 5M PH = 8. 0),0. 25%溴酚兰 0. 125g，0. 25%二甲苯青 0. 125g。②电泳准备玻璃板的准备用洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用酒精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2%的R印el Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另一块平板涂上0. 5%的 Bingding Silane0操作过程中，防止两块玻璃板相互污染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。玻璃板的组装将大板平放，小板压放到大板上(涂有硅烷的两面向里)，中间用压条隔开，放好后用大夹子夹紧固定。聚丙烯酰胺胶的配制6% PA胶50ml，10%过硫酸铵250 μ 1，TEMED 50 μ 1。摇勻后灌胶。灌胶将配置好的聚丙烯酰胺凝胶沿玻璃板凹槽边轻轻敲打，边轻轻灌进，一定要均勻，防止出现气泡。待胶流动到底部，在灌胶口插入梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。 用一个有力的大夹子将梳子夹紧，使其固定，以避免产生胶膜，影响点样。若有漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置室温让其聚合至少30min。③扩增产物的电泳待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽(阴极)装入电极缓冲液，将聚合的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入IXTBE(用 10 X TBE稀释)的电极缓冲液。预电泳恒定功率40W，预电泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。电泳用移液枪加入经变性的扩增样品4 6 μ 1，接上电源，电泳。参数为恒定功率50W，电泳至溴酚蓝到达电泳槽底部，切断电源。(视SSR扩增产物分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间)。电泳结束后，放去上层电泳缓冲液，卸下玻璃板，取下梳子，小心分开两块玻璃板， 变性胶紧贴在涂有Binding Silane的玻璃板上。④扩增产物的银染检测脱色和固定电泳后将凝胶放入固定液(900ml蒸馏水+IOOml乙醇+5ml冰乙酸) 中，轻轻摇动15 20min至指示剂无色。水洗用IOOOml蒸馏水洗!3min。银染放入染色液QgAgN03+1000ml蒸馏水)中，轻轻摇动约30min。漂洗将染色后的凝胶放入双蒸水中2 3s，迅速取出并竖起控水。显影把胶板放入显影液(1000ml蒸馏水+15gNa0H+5ml甲醛)中摇动至DNA带显示。终止显影将胶板取出放入终止液(0. 75%的Na2CO3溶液)中，终止显影。洗涤蒸馏水浸泡洗凝胶lOmin，捞出凉干，在室温下自然干燥保存。保存统计带型，照相或扫描。利用该方法染色，胶的背景为棕色，一般情况下胶先出现棕色，然后DNA的带型逐渐成棕红色出现。该方法不存在染色过头出现背景深的现象。附6%PA胶的配制Acrilamide 57g,Bis-acrilamide 3g, IOXTBE 50ml，尿素 420g。搅拌溶解后，加蒸馏水至1000ml，过滤后置于室温备用IOXTBE 的配制
Tris 108g，硼酸(Boric Acid) 55g，Na2EDTA. 2H20 7. 44g。2% Repel Silane 490ml氯仿(分析纯)，加入IOml Repel Silane，混合后室温保存。0. 5% Binding Silane 3ml 95% 的乙醇加入 15 μ 1 冰乙酸和 15ul Binding Silane。10%过硫酸铵(Ammonium Persu Lphate)过硫酸铵2g，超纯水18ml，溶解后，分装于1. 5ml的离心管中，_20°C保存。⑤基因型记录F2:3家系群体每个位点上主要有3种带型来源于母本豫82的带型、父本沈137 的带型、杂合型。(2)遗传图谱构建及QTL分析选取在两个亲本间具有多态性的标记，对255个BC3F2:3家系叶夹角性状进行分析，分离BC3F2群体的每个单株玉米叶片的总DNA，采用微卫星(simplesequence repeat, SSR)分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶上分离后，获得分子标记多态性数据，先进行两点分析，用“GROUP”指令，推测可能的连锁群，LOD值大于3. 0。 LOD = 3.0，是判断两个标记是否连锁的重要域值。参照部分已定位标记序列，利用三点和多点分析构建连锁群的框架结构，然后用“C0MPARE”、“TRY”和“RIPPLE”指令确定各连锁群标记的排列顺序。通过多点分析相邻两标记间的重组值，利用Kosambi函数将重组值转换成图距单位(cM)，用“Mapdraw”构建连锁图谱。综合遗传图谱数据和叶夹角鉴定数据，利用WinQTLCartV2. 5软件复合区间作图(Composite Interval Mapping, CIM)法进行QTL定位和效应估计，每2cM 对各性状进行全基因组扫描，以确定各性状QTL数目及其在染色体上的位置，根据 Churchill and Doerge (1994)的方法，permutation 1000 次，设定 QTL 的显著性水平为 0. 05 (Chromosome-wise Type I error rate = 0. 05)，根据排列测验的 LOD 阈值(设定为 2. 5)，当LOD大于2. 5时，说明该区间存在一个QTL连锁位点。经过CIM分析发现位于第一染色体上1. 02区域内存在一个QTL介于标记bnlgl484与LA5025之间，该QTL减小叶夹角等位基因来自叶夹角小的亲本豫82，并可用于种植材料叶夹角大小的预测。本发明所述植物的自交系来源如下所述的“豫82”来源于豫综5号C3改良群体(Reid血缘)，从该群体选择优良单株通过多代自交选育而成。本发明中所用的该自交系来自于河南农业大学。所述的“沈137”来源于美国种质6JK1118中选育而成。本发明中所用的该自交系来自于沈阳市农业科学院。
权利要求
1.一种调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记，其特征在于由p-bnlgl484和LA25两对引物组成，所述引物P_bnlgl484的序列为Fl 5' -GTAAAAGACGACGACATTCCG-3‘ Rl 5' -GACGTGCACTCCGTTTAACA-3‘； 所述引物LA25的序列为 F2 5' -AAAGTCTCTCGTCCTCCAG-3‘ R2 5' -GAACACTAACAAACATCGC-3‘。
2.如权利要求1所述的调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记的方法，其特征在于 以玉米总DNA为模板，用引物对p-bnlgl484和LA25进行PCR扩增，经凝胶电泳得到长度分别为220和270的DNA片段。
3.如权利要求1所述的调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在玉米叶夹角的早期预测和筛选中的应用。
4.如权利要求1所述的调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记在耐密型玉米的选育的应用。
全文摘要
本发明公开了一种调控玉米叶夹角的主效QTL的分子标记，由p-bnlg1484和LA25两对引物组成，本发明通过SSR分子标记和QTL分析，在第一染色体上位于标记bnlg1484与LA5025之间存在一个调控叶夹角大小的QTL，它位于第一染色体的1.02位点，介于标记bnlg1484和标记LA25之间，贡献率为20.4％。分析表明该标记的有无直接关系到植株叶夹角的大小，能够用于种植材料叶夹角大小的预测。
文档编号C12N15/11GK102234642SQ20101015409
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者库丽霞, 陈彦惠 申请人:河南农业大学