专利名称：水体致突变性检测的Ames实验微量波动法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水体致突变性检测的Ames实验微量波动法，属于微生物技术领 域。
背景技术：
一般认为，85 % -90 %的化学致癌物为致突变物。由于Ames试验的重现性好，预测 已经在啮齿类动物中发现致癌作用的准确性较高。因而，Ames试验作为任何致突变筛选计 划中不可缺少的一部分。1976年Green [1]发明的波动试验和传统致畸变检测Ames试验均以细菌回变作为 检测终点，且在已知诱变剂的测试中，发现它能在更低的浓度下获得阳性反应结果。后来， Gatehouse将波动试验改良为微量法，这一创举不仅大大减轻了工作量，而且进一步提高了 波动法的灵敏性。国内有关于微量波动法实验体系组氨酸浓度，细菌浓度，生物素浓度的报 道[2]。上述方法在鼠伤寒沙门氏菌不同菌株间无通用性，并且存在待测物处理繁琐等问 题。参考文献1. Green, MHL, WJ M. Mutagen testing using trp+reversion in Escherichia coli.Mutat Res 38(3) :32，1976.2.胡长灯，詹卓玲.微量波动试验的影响因素及灵敏度研究.卫生毒理学4 (2) 115-116，1990.
发明内容
本发明的目的在于克服现有微量波动法检测方法的不足，而提供一种通用于鼠伤 寒沙门氏菌不同菌株的测试体系，并使待测物处理变得简单的水体致突变性检测的Ames 实验微量波动法。本发明方法是在现有微量波动法检测方法基础上的改进。本发明方法阐述了 TA97、TA98、TA100, TA102系列菌株的最佳反应条件。具体通过采用鼠伤寒沙门氏菌TA98 菌株为测试菌株，二氨基芴为阳性物，通过实验设计，分析体系中不同菌液浓度、不同S9浓 度，不同阳性物浓度的实验结果，确定了该方法的最佳反应剂量，并通过对TA97，TA100, TA102菌株反应情况分析，验证了反应体系的通用性。本发明相对于现有微量波动法检测方法改进点有如下几个方面1、生长培养液生物素0.8ug/ml，组氨酸0. 2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于 Vogel-Bonner 缓冲液。2、溴甲酚紫(BCP) 0. 15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bormer缓冲液，制得5ug/ml 的溴甲酚紫指示剂，微孔滤膜过滤除菌备用。3、反应体系中细菌浓度10ul/ml，S9浓度为40ul/ml。4、采用待测物暴露细菌24小时，加入 色剂继续培养48或72小时后观察结果，即阳性孔数。5、以浓度为横坐标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，采用常规的线性回归分拟合 直线，通过常规的线性方程的计算，以斜率为依据判定待测物致畸变强度，斜率越大，即相 对致突变能力越强。本发明的方法用于水质及食品等的致突变性检测，具有快速、操作简便的优点，有 良好的应用前景。
图1为不同剂量阳性物反应结果示意图。图2为不同反应时间下反应结果示意图。图3为不同菌浓度条件下反应结果示意图。具体实施方法1、菌株用鼠伤寒沙门氏菌M0LT0X标准菌株TA98，TA97，TA100, TA102,培养至菌浓度为 108。2、S9辅助因子混合液制备方法依照中华人民共和国国家标准-鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验。3,10% S-9混合液(活化系统)每10ml含无菌的0. 2mol/l磷酸盐缓冲液(PH6. 4)6. 0ml, 1. 65mol/l氯化钾溶液 0. 2ml,0. 4mol/l 氯化镁溶液 0. 2ml,0. 05mol/l 葡萄糖-6-磷酸盐溶液 1. 0ml,0. 025mol/l 辅酶-II溶液1. 6ml和大鼠肝勻浆液(S-9) 1. 0ml，混勻。4、溶液Vogel-Bonner缓冲液贮备液(50倍)磷酸氢钠按16. 5g，柠檬酸10. 0g,磷酸氢二 钾50. 0g，硫酸镁1. 0g，加蒸馏水至100ml，溶解后灭菌。5、生长培养液生物素0. 8ug/ml，组氨酸0. 2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于上述VB buffer。6、溴甲酚紫(BCP)0. 15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bormer缓冲液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示剂， 微孔滤膜过滤除菌备用。7、阳性物二氨基芴。8、反应体系中菌浓度10ul/ml，S9浓度为40ul/ml。9、将上述反应体系分别用生长培养液配置12ml体系，加到96孔板中，每个样品的 每个浓度为48孔。37°孵育24h。然后每孔加入溴甲酚紫(BCP)20ul，继续培养72h，观察 阳性孔数。10、孔内培养物由紫色变为黄色为阳性，即为阳性反应，计算每种菌种每个浓度阳 性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，采用常规的线性回归分拟合直 线，通过常规线性方程的计算，以斜率为依据判定待测物致畸变强度。斜率越大，即相对致 突变能力越强。
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图1显示阳性物浓度升高，阳性结果孔数增多，这个现象在不同S9浓度下皆有一 致的结果，从三条直线的斜率得出我们的结论，斜率越高，致突变能力越强。图2显示采用待测物暴露细菌24小时之后，加入显色剂继续培养48小时后观察 结果。对于不同的待测物依据time-course图设置不同的反应时间。图3显示不同菌浓度对反应结果的影响，当菌浓度取lOul/ml时，反应结果比较 好，即便于区分不同阳性物致突变强度情况。通过实验证明，上述实验体系适合鼠伤寒沙门氏菌的TA97、TA98、TA100、TA102。
权利要求
一种水体致突变性检测的Ames实验微量波动法，在现有微量波动法检测方法基础上改进而成，其特征在于a.生长培养液生物素0.8ug/ml，组氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于Vogel-Bonner缓冲液；b.溴甲酚紫(BCP)0.15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bonner缓冲液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示剂，微孔滤膜过滤除菌备用；c.反应体系中细菌浓度10ul/ml，S9浓度为40ul/ml；d.采用待测物暴露细菌24小时，加入显色剂继续培养48或72小时后观察结果，即阳性孔数；e.以浓度为横坐标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，采用线性回归分拟合直线，通过线性方程的计算，以斜率为依据判定待测物致畸变强度，斜率越大，即相对致突变能力越强。
全文摘要
本发明涉及一种水体致突变性检测的Ames实验微量波动法，属于微生物技术领域。本发明方法是在现有微量波动法检测方法基础上的改进。本发明方法在TA97、TA98、TA100，TA102系列菌株的最佳反应条件下，采用鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株为测试菌株，二氨基芴为阳性物，通过实验设计，分析体系中不同菌液浓度、不同S9浓度，不同阳性物浓度的实验结果，确定了该方法的最佳反应剂量，并通过对TA97，TA100，TA102菌株反应情况分析，验证了反应体系的通用性。本发明的方法用于水质及食品等的致突变性检测，具有快速、操作简便的优点，有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/02GK101851659SQ20101015411
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者倪红梅, 夭建华, 杨叶昆, 米其利, 胡明阳, 魏云林 申请人:云南烟草科学研究院