专利名称：一种介导基因转染的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学及生物工程学领域，涉及有关基因治疗的的基因运载体系技术。具体涉及一种介导基因转染的方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，治疗基因的选择已不再成为难题。基因治疗目前已成为恶性肿瘤及一些先天性疾病或慢性疾患的极具潜力的一种治疗方法。有关研究表明，基因治疗整个过程主要涉及目的基因，基因转移技术和受体细胞三方面。在受体细胞一定的情况下，基因转移技术是决定基因治疗效果的关键。基因转移技术平台的优劣又取决于外源基因能否高效、安全地进入组织细胞，且在组织细胞内稳定持久表达。
现有技术公开的基因转移技术分为病毒性和非病毒性载体两种。较常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)，其各有优缺点。逆转录病毒介导基因表达稳定持久，但对非分裂期细胞感染效果差，存在种属特异性，在人体使用的毒副作用较大。腺病毒虽能感染分裂期和非分裂期细胞，但反复转导会触发严重的机体体液及细胞免疫反应，无法用于临床试验。腺相关病毒较其他已有病毒载体安全性较好，迄今尚未发现野生型和重组型AAV与人类疾病有关；它能感染分裂及非分裂期细胞；它的内源性弱启动子对外源基因的调控无明显的干扰作用，而且启动的方向不指向宿主细胞的DNA ，因此插入突变的危险性相当低。但AAV迄今
应用范围不广，仅见在神经组织、视网膜组织、肝脏、心肌、骨骼肌、肺组织中报道，其主要原因之一是AAV制备滴度尚低，而达到理想表达效果的感染复数(multiplicityof infection, MOI) 一般较高，在1X 105 1 X 107(v. g. /cell)范围内;其二，AAV对组织细胞有一定的嗜向(tropism)特异性,对非嗜向性的组织细胞AAV转染效率低下。较绝大多数的病毒载体来说，非病毒性载体以安全性的优势日益受到学者们重视。其中，超声耙向破坏微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction,画D)是近年来一项新的快速发展的介导基因转染方法，现已有应用于实验动物多种实质器
官和疾病模型的基因转染研究，取得了安全的转染效果。这种转染方法的机制是以微泡作为空化核，在超声交变声压作用下，产生瞬间空化效应引起细胞膜通透性增加及产生非致死性可逆开闭的声孔，与微泡结合的基因通过声孔进入细胞发挥作用。UTMD技术较其他现有的非病毒载体技术(脂质体、电穿孔、纳米粒子)的显著优势在于①
可调节声孔效应的程度与超声辐照的声压、声强、频率、工作周期、照射时间及微泡剂量等因素有关，根据靶组织的不同来调节这些参数，可在转染效率提高的同时使
组织损伤减少到最小；②瞬间可逆增加体内屏障通透性UTMD技术可使细胞膜、血管壁及体内屏障产生瞬间可逆的通透性增加，所以可从血液内注射外源基因来进行转染;③超声辐照的靶向性超声辐照本身具有器官组织靶向性，可使辐照局部基因转染效率增加。
但UTMD有其应用缺陷， 一是转染效率仍较低，二是转染效果存在一过性。所以，为了使治疗基因实现在组织或细胞内的高效安全转染及长期稳定表达，有必要采取新的策略来改进已有的基因运载体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种介导基因转染的^"法，为基因治疗提供一种新型、安全、高效且能介导目的基因长期表达的基因转移技术方法。
本发明采用超声靶向破坏微泡(简称UTMD)技术联合腺相关病毒载体介导基因转染，特别使UTMD技术以合适的辐照剂量条件、时间及方式与腺相关病毒rAAV2载体联合共同介导基因转染，实现安全高效且基因长期表达的效果。
本发明所解决的主要问题是通过UTMD技术显著增加rAAV2载体进入靶细胞的数量即效率。其核心是通过选择合适时间，以一定剂量微泡吸附携带rAAV2载体，同时根据不同的细胞或组织来调控超声辐照条件，达到安全高效介导病毒载体进入细胞或组织的同时对细胞或组织的破坏最小。
本发明的技术方案通过以下方法和步骤实现
1. 确定UTMD联合AAV介导基因转染方法的实施方式，包括确定联合顺序、时间间隔以及微泡与病毒载体混合方式；
2. 优化UTMD联合AAV转染方法介导基因转染效果，包括调控超声声强、辐照时间、微泡剂量、重复超声辐照的时间间隔及辐照剂量；
3. UTMD联合AAV在体内、外实验中介导基因转染，包括在不同肿瘤细胞、正常细胞及动物模型。
本发明所述的联合转染方法，可用于AAV携带不同治疗基因进行基因治疗的实验研究，在AAV加入同时实施单次UTMD或之后重复UTMD的方法，提高AAV的转染效率。
本发明所述的联合转染方法，可用于非AAV嗜向性细胞或组织的基因转染研究，显著提高AAV在这些细胞或组织中的转染效率。
本发明所述的联合转染方法，可与血液循环注入AAV载体的靶向基因治疗结合，通过超声定位辐照破坏微泡后显著增加辐照部位的AAV载体转染率。
本发明所述的联合转染方法，可与其他病毒载体方法结合，在减少病毒载体感染复数，降低毒副作用的同时达到安全高效基因转染效果。
本发明将超声靶向破坏微泡的非病毒载体技术与腺相关病毒载体技术合理结合，能实现优势互补，使目的基因更为安全高效进入细胞，同时实现基因长期稳定表达。
本发明中所述的方法可用于AAV携带不同目的基因进行基因治疗的体内外实验研究，尤其是在非AAV嗜向性细胞或组织中，它可安全地提高AAV携带基因的转染效率、加速基因在体表达、增加了转染的靶向性、同时降低病毒用量，减少了毒副作用。
图1是不同声强UTMD技术联合rAAV2感染人肾癌细胞后的EGFP基因拷贝倍数，其中，横坐标为不同超声辐照参数，纵坐标为EGFP的基因组DNA拷贝倍数，以单独rAAV2为对照组，拷贝倍数为l;
AAV+MBs表示AAV载体与微泡混合注入细胞孔，不进行超声辐照；AAV+US alone表示AAV载体不与微泡混合加入细胞孔即刻超声辐照；AAV+UT1D表示AAV载体加入细胞孔同时实施UTMD技术。
图2是不同声强的UTMD技术联合rAAV2感染人肾癌细胞的效率，其中，0.5， 1， 2W/cn^为超声辐照声强；每对图片左边为光镜照片,放大倍数XIOO，右边为对应的荧光显微镜照片，放大倍数XIOO，曝光时间6000ms。
图3是UTMD联合rAAV2感染大鼠视网膜，持续观察到2月时的感染效果，其中，A:单独rAAV2感染大鼠视网膜，
B: UTMD联合rAAV2感染大鼠视网膜，放大倍数为X24。
具体实施例方式
实施例1确定UTMD联合AAV介导基因转染方法的实施方式1) UTMD预辐照rAAV2
UTMD介导基因转染的机制主要与瞬间空化效应有关，即在较高超声声压辐照下，微泡快速膨胀及收缩，以至崩溃，随之在微泡周围产生较强的冲击波、声学射流以及大量自由基等。这些效应增加到一定程度可对蛋白质和基因的性能产生影响。
本实施例中，将rAAV2-EGFP在未加入细胞孔前用一定剂量UTMD :超声强度〈2W/cm2，辐照时间〈120secondsand微泡〈60u 1，频率lMHz，占空比50%,脉冲重复频率100Hz，预辐照，结果显示，其感染人肾癌细胞(786-0)的效率与未预辐照组无明显差异，证实UTMD在有效介导基因转染的剂量范围内不会破坏rAAV2载体的感染活性。
2) UTMD与rAAV2联合实施顺序及时间间隔
现有技术的UTMD技术介导基因转染实验中，外源基因多使用裸DNA或质粒DNA，它们不具有主动进入细胞的性能；rAAV2作为一种病毒载体，其病毒包壳表面有多种与其嗜向性细胞的胞膜结合的受体蛋白，在30min到lh间rAAV2可与这些受体结合。为确定UTMD以怎样的顺序及时间间隔与rAAV2联合，本发明采用先后不同顺序联合rAAV2和UTMD，以及不同时间段联合两者的方法来进行比较，结果显示rAAV2载体加入细胞同时实施UTMD，以及rAAV2加入细胞lh后再实施UTMD的两种方式介导的EGFP转染效率显著高于其他实验组，其中又以前者的效率更高。
3) rAAV2与微泡的配制方法
微泡是UTMD技术产生生物学效应的阈值决定因素之一。本发明选用SonoVue微泡，是单层磷脂包裹六氟化硫惰性气体的微泡，其性质十分稳定，利用微泡表面带有电荷特性，与经培养基稀释后的rAAV2载体混合，震荡，室温静置10min后，取上层混浊白色液体(即吸附了病毒载体的微泡)进行实验，与未经该方式混合处理的，即病毒与微泡同时加入细胞孔中的方法比较，结果表明病毒与微泡吸附后介导的转染效率要明显提高。
实施例2优化UTMD联合AAV介导基因转染方法的效果A.不同声强辐照由于UTMD引发的空化效应与细胞转染率呈正相关，但与细胞生存率呈负相关，在体内外的实验过程中，需对其影响因素进行优化，以达到最高转染效率的同时保证细胞破坏最小。UTMD介导基因转染效果的主要因素包括超声辐照条件及微泡剂量。超声交变声压的大小与微泡震荡的振幅成正比，即当辐照声强增加，微泡非线性震荡加剧，以至微泡更易破裂，产生更强冲击波、微射流及切应力等，增加了声孔产生的可能性。在频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz、照射时间60s的超声及30ul微泡的固定条件下，本发明对比研究了不同声强(0.5， 1， 2W/cm2)的超声联合2.5乂10物1的rAAV2在人肾癌细胞的感染效率，结果表明1 W/cm2声强的超声联合的rAAV2的转染效率高且细胞未出现明显坏死。
B. 不同辐照时间
超声辐照时间的长短同样也是影响空化效应的一个重要因素，在声强1W/cra2、频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz的超声及30 u 1微泡的固定条件下，本发明对比研究了不同辐照时间(30， 60， 90seconds))联合2. 5X 104MOI的rAAV2在人肾癌细胞的感染效率，结果表明60s的超声辐照可明显提高rAAV2转染效率的同时保证细胞无明显坏死。
C. 不同的SonoVue微泡剂量
在声强lW/cm2、频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz、照射时间60s的脉冲超声固定条件下，本发明对比研究了不同SonoVue微泡剂量(6, 15， 30， 60ul)联合2.5X104M01的rAAV2在人肾癌细胞的感染效率，结果表明随着微泡剂量的增加，转染率相应提高，在30u 1的剂量条件下rAAV2转染效率明显提高且细胞无明显坏死。
D. rAAV2-EGFP基因组DNA
为了研究联合UTMD技术后，rAAV2在肾癌细胞转染率提高的机制，本发明采用realtime PCR定量分析了以最优辐照条件的UTMD (声强1W/cm2、微泡30 u 1、辐照时间60s、频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz)联合rAAV2感染人肾癌细胞后的EGFP基因组DNA拷贝数，结果表明，在最优辐照条件实施的UTMD联合rAAV2感染人肾癌细胞组，其EGFP基因组DNA较单独rAAV2感染组提高约9倍，此结果证实了UTMD提高rAAV2效率的原因在于使这种病毒载体进入细胞的量显著增多。
E. 重复超声辐照及UTMD技术
UTMD技术具有良好的安全性，因为其机制在于使细胞膜表面通透性可逆增加，及
7在细胞膜表面产生瞬间可逆开闭的声孔，当停止超声辐照后，声孔闭合，细胞膜表面 恢复原状。本发明利用UTMD这种安全的性质，采用重复实施UTMD技术的方法使细胞 外的rAAV2更多的进入细胞，对比了不同的时间间隔重复UTMD实验后，确定以单次UTMD 实施后的lh重复UTMD辐照可使rAAV2的转染率进一步提高。
实施例3
UTMD联合AAV介导基因转染方法的体内外研究应用
A. 体外实验
A) .人肾癌细胞
肾癌细胞为rAAV2非嗜向性细胞。人肾癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院 细胞资源中心。本发明以不同MOI的rAAV2(lXl()4 5X106MOI)感染人肾癌(786-0) 细胞，48h后检测EGFP转染率，结果rAAV2对786-0细胞感染效率较低，平均为 (14. 31 ±2. 50) %。以最优的UTMD辐照条件(声强1W/cm2、微泡30 u 1、辐照时间60s、 频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz)联合rAAV2后，感染效率平均提高200 %—300%。
B) .人肝癌细人肝癌细胞(H印3B)由上海第一人民医院中心实验室提供。本发明采用较低MOI 即1X104的rAAV2来联合感染人肝癌细胞,感染效率平均为，优化UTMD辐照条件后， 同样得到声强1W/cm2、微泡30p 1、辐照时间60s、频率lMHz、占空比50%、脉冲重 复频率100Hz为最佳条件，以此条件联合rAAV2，感染效率较单独rAAV2组提高30% —40%。
C) .人视网膜细胞
人视网膜细胞(hRPE)(由上海第一人民医院眼科实验室提供)。本发明采用低MOI 即1X1。3的rAAV2来联合感染hRPE,感染效率平均为(17.25±4.80) %，优化UTMD 辐照条件后，得到声强lW/cm2、微泡50ul、辐照时间60s、频率lMHz、占空比50%、 脉冲重复频率100Hz为最佳条件，以此条件联合rAAV2，感染效率较单独rAAV2组提高 100%—200%。
B. 体内实验
在正常大鼠视网膜下注射3nlrAAV2与lpl微泡混合转染液，以2W/cm2、 5min超声 条件进行辐照，用荧光体视镜监测绿色荧光蛋白的表达情况，结果表明UTMD联合rAAV2较单独rAAV2感染方法能使绿色荧光表达时间提前，5周后EGFP表达达峰，UTMD联合 rAAV2组EGFP的表达水平较rAAV2单独感染显著提高，这种差异到持续观察4月仍存 在。
权利要求
1、一种介导基因转染的方法，其特征是采用超声靶向破坏微泡技术联合腺相关病毒载体介导基因转染，使目的基因长期表达。
2、 按权利要求1所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的方法包括下 述步骤1) 确定超声靶向破坏微泡联合腺相关病毒介导基因转染的方式 所述的方式包括联合顺序、时间间隔以及微泡与病毒载体混合方式；2) 优化超声靶向破坏微泡联合腺相关病毒介导基因转染的方式， 所述的方式包括调控超声声强、辐照时间、微泡剂量、重复超声辐照的时间间隔及辐照剂量；3) 超声靶向破坏微泡联合腺相关病毒介导基因转染实验， 所述的转染实验包括不同肿瘤细胞、正常细胞及动物模型的转染实验。
3、 按权利要求2所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的步骤l)的介 导基因转染的方式其中腺相关病毒载体加入细胞同时实施超声靶向破坏微泡， 或，腺相关病毒载体加入细胞lh后实施超声靶向破坏微泡的方式。
4、 按权利要求1或2所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的微泡是 单层磷脂包裹六氟化硫惰性气体的微泡，其吸附了病毒载体。
5、 按权利要求2所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的步骤2)的介 导基因转染的方式其中超声频率lMHz、占空比50%、脉冲重复频率100Hz、 照射时间60s微泡剂量30yl，超声声强为1 W/cm2，联合的腺相关病毒为 2. 5X104M0I。
6、 按权利要求2所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的步骤2)的介 导基因转染的方式其中采用单次超声靶向破坏微泡实施后lh再重复辐照。
7、 按权利要求2所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的肿瘤细胞是 人肾癌细胞、人肝癌细胞或人视网膜细胞。
8、 按权利要求1所述的介导基因转染的方法，其特征是所述的腺相关病毒 载体是rAAV2载体。
全文摘要
本发明属生物医学及生物工程学领域，涉及有关基因治疗的基因运载体系技术。具体涉及一种介导基因转染的方法。本发明将超声靶向破坏微泡技术与腺相关病毒载体技术以合适的时间、方式条件相联合，实现优势互补，使目的基因更为安全高效进入组织细胞，实现目的基因长期稳定表达。本发明所述的方法可用于AAV携带不同目的基因进行基因治疗的体内外实验研究，尤其是在非AAV嗜向性细胞或组织中，它可安全地提高AAV携带基因的转染效率、加速基因在体表达、增加了转染的靶向性、同时降低病毒用量，减少了毒副作用。
文档编号C12N15/87GK101475962SQ200910044959
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者瑛 伍, 史秋生, 凡 李, 李红丽, 杜联芳, 王慧萍, 郑孝志 申请人:上海市第一人民医院