专利名称：一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及一种木糖醇基因工程菌的构建及其用于混合转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。
背景技术：
木糖醇是一种五碳糖，其化学名称为1，2，3，4，5—戊醇，分子式为C5H12O5,是一种白色结晶或结晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同，可以作为蔗糖的替代品。木糖醇是一种具有较高营养价值的天然甜味物质，同时也是一种低能量甜味剂。木糖醇是人体糖类代谢的中间体，食用后不消耗胰岛素，并且木糖醇具有特殊的防龋功能，可作糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品，同时木糖醇还具有降低血糖 浓度、促进钙吸收等多种功能。目前，木糖醇工业生产主要采用化学酸化催化加氢法和利用微生物直接发酵半纤维素水解液生产木糖醇，这两种方法的原料多来源于富含多缩戊糖的玉米芯、甘蔗渣等农副产品，这些原料首先经过高温水解后成为含大量木糖的水解液，因此存在酸碱消耗高、环境污染严重、工艺复杂等问题。全生物法制备木糖醇的研究已经引起了全球的关注，但是在自然界中还没有发现直接发酵葡萄糖生产木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先报道了通过三步发酵将葡萄糖转化为木糖醇，首先利用Ostnophilic将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇,再利用Acetic acid bacteria将生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一种酵母还原为木糖醇，但是其转化率非常低，后续发酵过程复杂。我们利用氧化葡糖杆菌{Gluconobacter oxydans)将D-阿拉伯糖醇氧化还原为木糖醇，氧化葡糖杆菌购自中国微生物菌种保藏中心，编号=CGMCCl. 110，该菌同时具有D-阿拉伯糖醇脱氢酶(AraDH)和木糖醇脱氢酶(XDH)活力，能够将D-阿拉伯糖醇大部分氧化为木酮糖，而XDH的活力相对较低，木糖醇的生成量就远远小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇为目的产物，如何提高XDH的活力成为研究的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高木糖醇脱氢酶活力的基因工程菌大肠杆菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. M 2012207。本发明的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行
(I)挑取氧化葡糖杆菌ifluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28_37°C、
100-260 rpm 振荡培养 8-20h。(2)将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h。
(3)将(2)中的发酵液 6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体；
(4)转化液转化温度为28-37 V，100-260rpm振荡转化24_60h，4h取样，4h取样，转化液中得到木糖醇。本发明的另一个目的是提供一种具有高转化率的混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法。利用构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇，D-阿拉伯糖醇的转化率由29 %提高到91. 6 %。利用上述构建的基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，按照下述步骤进行
(I)挑取氧化葡糖杆菌ifluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28_37°C、
100-260 rpm 振荡培养 8-20h。 (2)将种子液以体积比1-10 %的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h。(3)将(2)中的发酵液 6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体；
(4)将上述基因工程菌疋coli WJl\-xdh06接种于LB-Amp (LB-氨苄青霉素)培养基中，37 1振荡培养过夜，次日以1-10 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37°C培养至菌体光密度值约为O. 6-0. 8时，加入IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度O. 5-1. 2mmol/L进行诱导表达5_15h左右。取一定体积工程菌液6000-12000 rpm,4°C离心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，菌体待用。(5)将(3)和(4)离心得到得菌体用适量的细胞转化液重悬菌体。(6)转化液转化温度为28-37 °C，100_260rpm振荡转化24_60h，4h取样，转化液中得到木糖醇。其中步骤(I)所述的种子液培养基组成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L;氧化葡糖杆菌斜面培养基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，琼脂 10-20 g/L，其余为水。其中步骤(2)所述的扩大培养基组成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸钙10-20.0 g/L，其余为水。其中步骤(3)所述的细胞转化液组成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。其中步骤(4)所述的LB-Amp培养基组成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L, Amp (氨苄青霉素)50 μ g/L (终浓度)，其余为水。其中步骤(5)所述的细胞转化液包组成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。
具体实施例方式本发明的氧化葡糖杆菌{Gluconobacter oxydans)购自中国微生物菌种保藏中心编号CGMCC1. 110。本发明所述木糖醇脱氢酶基因为Christina Prus报道的序列GVatereBiotechnology 23(2)，195 - 200，2005，NC_006677. I)。通过常规的基因工程技术将木糖醇脱氢酶基因导入大肠杆菌得到含有所述木糖醇脱氢酶基因Ui*)的大肠杆菌。本发明的基因工程菌具有较高的木糖醇脱氢酶酶活力，酶活力达21U/mg，其酶活性提高了 10倍。包括以下步骤
I、培养氧化葡糖杆菌，提取菌株的总DNA，通过PCR扩增出目的片段。2、目的片段和表达载体通过酶切用T4连接酶连接构建重组质粒，将重组质粒导入宿主菌万.BL21 ο3、提取大肠杆菌质粒，通过PCR、双酶切和SDS-PAGE进行表达验证，证明重组菌构建成功。4、测定基因工程菌的木糖醇脱氢酶酶活力。具体过程见实施例I。实施例I、具有木糖醇脱氧闻酶活力的基因工程菌的获得
根据NCBI上发表氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶基因序列和表达载体PSE380上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成简并引物P1: 5 ; TACCATGGTTCACCACCATCACCATCATATGTCGAAGAAGTTTAAG3 ;(含 Afco I 酶切位点)；P2: 5 ; TGAAGCTTTCAACCGCCAGCAAT3丨(/含Hind III酶切位点)。以氧化葡糖杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。PCR反应参数预变性95 V 2min;变性94 V 30sec;复性55 V30sec ;延伸72 V lmin ;循环35个；终止延伸72 V IOmin ;最后16°C保温
PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，UNIQ-10试剂盒纯化回收片段大小约为O. 7-0. 9kb的PCR产物用于克隆表达。将PCR产物及载体PSE380分别用Afco I和Hind III双酶切，用T4DNA连接酶连接后转化感受态E. coli BL21。重组质粒通过PCR、酶切验证，通过PCR扩增应出现一条带，PCR反应参数
预变性95 V 2min ;变性94 V 30sec ;复性55 V 30sec ;延伸72 V
Imin ;循环30个；终止延伸-J2 V IOmin ;最后16°C保温。将重组质粒用III单酶切鉴定时应出现一条带，用Nco I和III双酶切鉴定时应出现两条带。结果表明重组菌构建成功，命名为大肠杆菌BL-xdh06Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. M 2012207。基因工程菌接种于3 ml LB-Amp培养基中，37 °C振荡培养过夜，次日以2 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37 °C培养至菌体光密度值(A_)约为O. 6时，加入IPTG至终浓度I mmol/L进行诱导表达10 h左右。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳观察目的蛋白的表达。结果表明外源蛋白获得高效表达。LB-Amp培养基胰化蛋白胨IOg/L,酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L, Amp 50 μ g/L (终浓度)。基因工程菌接种于3 ml LB-Amp培养基中，37 °C振荡培养过夜，次日以2 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37 °C培养至菌体光密度值(A6tltl)约为O. 6时，加入IPTG至终浓度I mmol/L进行诱导表达10 h左右。取适量菌液8000 r/min，4°C离心10 min,收集菌泥,用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸钾缓冲液洗漆两次,离心后用适量的磷酸钾缓冲液重悬菌体，冰浴中超声破碎(超3 s停3 S，全程时间10 min, 200 W)。之后于10000 rpm, 4 °C离心10 min,上清即为粗酶液。
利用粗酶液测定木糖醇脱氢酶的酶活力，结果表明重组菌具有基因克隆供体菌氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶活力，酶活力为21 U/ml，而且重组菌的木糖醇脱氢酶活力约为氧化葡糖杆菌的10倍。获得具有木糖醇脱氢酶高酶活力的基因工程菌。测定方法
木糖醇脱氢酶是一种氧化还原酶，它的催化活性是可逆的，木酮糖转化为木糖醇为其还原反应，需要辅酶NADH，木糖醇转化为木酮糖为其氧化反应，需要辅酶NAD+。反应如下
权利要求
1.一种木糖醇基因工程菌大肠杆菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,保藏编号为 CCTCC NO. M 2012207。
2.利用权利要求I所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)挑取氧化葡糖杆菌{Gluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28-37°C、100-260 rpm 振荡培养 8_20h ； (2)将种子液以体积比1-10%的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h ； (3)将(2)中的发酵液6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体； (4)将基因工程菌万.co7iBL21-xdh06接种于LB-氨苄青霉素培养基中，37 °C振荡培养过夜，次日以1-10 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Amp培养基中，37 °C培养至菌体光密度值约为O. 6-0. 8时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度O. 5-1. 2mmol/L进行诱导表达5-15h ； 取一定体积工程菌液6000-12000 rpm，4°C离心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH6. 8的磷酸钾缓冲液洗涤，菌体待用； (5)将(3)和(4)离心得到得菌体用适量的细胞转化液重悬菌体； (6)转化液转化温度为28-37V，100-260rpm振荡转化24_60h，4h取样，转化液中得到木糖醇。
3.利用氧化葡糖杆菌静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)挑取氧化葡糖杆菌{Gluconobacter斜面菌落于种子液培养基,28-37°C、100-260 rpm 振荡培养 8_20h ； (2)将种子液以体积比1-10%的接种量接种到扩大培养基，28-37°C、100-260 rpm振荡培养48-96h ； (3)将(2)中的发酵液6000-12000 rpm，4°C离心 5-20 min，收集菌泥，用 0. I mol/L pH6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，离心后用适量的细胞转化液重悬菌体； (4)转化液转化温度为28-37°C，100-260rpm振荡转化24-60h，间隔4h取样，4h取样，转化液中得到木糖醇。
4.根据权利要求2所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，其特征在于其中步骤(I)所述的种子液培养基组成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L ;氧化葡糖杆菌斜面培养基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，琼脂10-20 g/L，其余为水; 其中步骤(2)所述的扩大培养基组成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L,胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸钙10-20.0 g/L，其余为水； 其中步骤(3)所述的细胞转化液组成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L,乙醇 3-8% (V/V)，其余为水； 其中步骤(4)所述的LB-Amp培养基组成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,氨苄青霉素终浓度50 μ g/L,其余为水；其中步骤(5)所述的细胞转化液包组成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。
5.根据权利要求3所述的利用氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法，其特征在于其中步骤(I)所述的种子液培养基组成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L ;氧化葡糖杆菌斜面培养基葡萄糖20-40. O g/L,胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，琼脂10-20 g/L，其余为水; 其中步骤(2)所述的扩大培养基组成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0 g/L,胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸钙10-20.0 g/L，其余为水； 其中步骤(3)所述的细胞转化液组成如下D-阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸钙10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余为水。
全文摘要
本发明涉及一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法，涉及生物技术领域。本发明提出构建一种木糖醇基因工程菌E.coliBL21-xdh06，该工程菌是通过PCR方法，从氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)获得木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase，XDH)基因xdh，将其克隆并在宿主菌E.coliBL21进行稳定高效表达。该基因工程菌表达的木糖醇脱氢酶，其酶活性提高了10倍，利用该基因工程菌和氧化葡糖杆菌混合静止转化D-阿拉伯糖醇生产木糖醇，D-阿拉伯糖醇的转化率由29%提高到91.6%。
文档编号C12P19/02GK102936576SQ201210209060
公开日2013年2月20日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者齐向辉, 郭齐, 王飞, 邓文颖, 王亮, 孙文敬, 陈华友, 蒙健宗, 张云光 申请人:江苏大学