专利名称：利用咀嚼肌和眼轮匝肌干细胞体外分化治疗心脏病的技术的制作方法
技术领域：
该发明属于成体干细胞和再生医学领域。涉及成体干细胞提取、体外扩增、诱导分化及干细胞移植技术。
背景技术：
在发达国家和中国等多数国家，心血管疾病已经成为致死的主要原因。应用干细胞治疗心肌梗塞及缺血性心脏病是当前心血管疾病治疗的新领域，最终会成为主流技术。现如今临床试验使用的干细胞种类包括骨髓干细胞、骨骼肌干细胞、外周及脐带血干细胞和脐带间质干细胞等。到目前为止，已完成临床三期试验的有骨髓干细胞和骨骼肌干细胞。虽然骨骼肌干细胞具有取材方便、可进行大量的体外扩增等优点，但不具有在体 内分化心肌细胞的能力和较差的电偶联作用，在临床应用受到极大限制。头面部肌肉咀嚼肌胚胎发育起源不同于躯干和四肢骨骼肌(躯干和四肢骨骼肌祖细胞来源于中胚层体节而咀嚼肌祖细胞起源于脏壁中胚层)。咀嚼肌祖细胞起源于脏壁中胚层鳃节肌与心脏祖细胞为同一起源。通过基因表达分析发现，在咀嚼肌干细胞心肌基因Nkx2. 5和Isll有不同程度的表达，在基因水平上这也证实，咀嚼肌干细胞具有心肌干细胞的特性。最近研究发现非编码小RNA (miRNA)对骨骼肌发育具有调节作用。从咀嚼肌及眼轮匝肌干细胞返祖并获得适当的干性(先祖心肌细胞)是一个全新的研究思路。而且咀嚼肌及眼轮匝肌干细胞在胚胎期与心肌细胞发育同源具有无可比拟的优势。咀嚼肌及眼轮匝肌的胞浆成分及表面标记物更接近心肌细胞，无免疫原性(若取材于同一病人)，并且无成瘤性。由于咀嚼肌及眼轮匝肌的独特成体干细胞特性，从咀嚼肌及眼轮匝肌分化到心肌细胞只需改变表观遗传学的特征既可。表观遗传学改变是基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，基因表达活性调控主要是通过染色质水平的化学修饰，形成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。表观遗传学信息本身不改变基因的序列，而是通过基因修饰，蛋白质与蛋白质，DNA和其他成份的相互作用，影响和调节基因的功能和特性。涉及到DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等。DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰形式，是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因釉组CPG 二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团，引起染色质构、DNA构象、稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，一般是起抑制效应。将已知的四个基因如0CT4、Sox2、KIf4、c-Myc转入，使体细胞变成iPSC，但内源性基因的四个因素被激活，一个重要的要求是DNA去甲基化。DNA甲基化主要是通过DNA甲基化转移酶(DNMT)家族催化完成。DNMT抑制0CT4的表达，而DNMT又受到一组micronRNA簇的调控。因此，为采用蛋白诱导技术将咀嚼肌及眼轮匝肌干细胞转化为心肌细胞提供了辖理论依据。此外，BMP4在诱导咀嚼肌及眼轮匝肌干细胞分化及发育为心肌细胞上也起到了关键作用。BMP4信号通路下游转录因子调控心肌相关基因(如MEF2a、GATA等)乙酰化激活细胞向心肌细胞分化，可进一步调控心肌细胞分化。另外，穿膜肽作为一个新技术可运载一系列包括多肽，蛋白、核酸和寡聚核苷酸等生物活性物质进入活细胞。本发明应用咀嚼肌干细胞具有心肌干细胞的特性，采用非编码小RNA体外改变咀嚼肌干细胞分化，促进分化心肌细胞，克服骨骼肌干细胞治疗心脏疾病的缺点，用于治疗心肌梗塞及缺血性心脏病。
发明内容
技术方法体外扩增咀嚼肌干细胞并诱导分化成心肌细胞用于治疗心脏疾病，其步骤如下
I无创活检方法收集咀嚼肌样品。2利用胶原酶消化处理咀嚼肌样品。 3悬浮培养酶消化处理后的咀嚼肌组织，单一咀嚼肌干细胞增殖逐渐形成球状细胞体。4扩增咀嚼肌干细胞通过处理球状细胞体使之分成单一细胞，重复悬浮细胞培养。5诱导分化成心肌细胞细胞贴壁培养，培养液加入非编码小RNA及BMP4。6通过流体细胞仪纯化心肌细胞。7通过冠状动脉导管注射及细胞膜片技术进行心肌细胞移植治疗心肌梗塞及缺血性心脏疾病。8采用NG-reagent技术介导Nanog、0ct4及Sox2蛋白进入咀嚼肌及眼轮阻肌祖细胞使其反祖为iPSC，将现有的iPSC转变成心肌细胞的转换率大幅度提高。9采用NG-reagent技术介导GATA4、MEF2c及Tbx5蛋白进入咀嚼肌及眼轮匝肌祖细胞，直接诱导分化为心肌细胞。10在心肌细胞特异性启动子(NCXl)引导下，结合慢病毒载体，荧光素酶，嘌啉霉素基因用于跟踪、纯化来自咀嚼肌及眼轮匝肌祖细胞的心肌细胞。
具体实施方案材料和方法
咀嚼肌样品处理和咀嚼肌干细胞生长培养
首先消毒，在无菌条件经皮下活检获得咀嚼肌组织。将组织放入PBS溶液置于冰上(在这种条件下可保存到12小时)。使用消毒镊子和剪刀就咀嚼肌组织剪切成(T5 mm3碎片，用II型胶原酶(lmg/ml) 3(T40°C消化25 40分钟。消化后咀嚼肌组织离心，使用移液管将组织细胞团块轻轻散开，放入培养液(containing 15% heat-inactivated fetalcalf serum, 100 Units/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin, 2 mmol/IL-glutamine, and 0. I mmol / I 2-mercaptoethanol in DMEM)。在 30 4CTC 5% CO2 培养箱内悬浮培养。咀嚼肌干细胞扩增和液氮冻存
经过悬浮培养一天后，可发现单一咀嚼肌干细胞或数位细胞体形成。三到四天后可见球状细胞体。六天后收集球状细胞体，II型胶原酶(I mg/ml) 3(T40°C消化5 25分钟，使球状细胞体分散成单一细胞或小细胞块，继续悬浮培养。以上过程可重复多次直到获得足够数量咀嚼肌干细胞。在此过程中取部分细胞液氮冻存备用。诱导分化心肌细胞
球状细胞体经II型胶原酶(I mg/ml) 3(T40°C°C消化5 20分钟分散成单一细胞或小细胞块，细胞贴壁培养，应用BMP刺激及用病毒方式转染心肌细胞关联因子或敲除非心肌细胞关联因子促使咀嚼肌干细胞分化心肌细胞。采用NG-reagent负载蛋白
I含跨膜肽的膜状结构组装。跨膜肽溶于水或模拟生理介质中，将改构葡聚糖熔于DMS0，然后滴加到跨膜肽溶液中分散，自组装得到稳定的跨膜肽/葡聚糖片状悬液。采用原子力显微镜(AFM)，ZETA电位仪表征悬液的分散稳定性、采用解组装/高效液相检测跨膜肽的组装量。
2含蛋白纳米微囊的组装。将待转染蛋白溶于PBS中，NaCl调节盐浓度，与上述悬液混合，组装成5(Tl00nm微囊。透析膜分离未组装的蛋白以及其它非盐分子。采用上述检测方法测试蛋白纳米微囊的大小，包装差异和稳定性等。3纳米微囊的转染效率纳米微囊同时负载荧光标记蛋白(GFP)，将纯化负载蛋白纳米微囊过0.22 pm滤膜除菌。与咀嚼肌及眼轮匝肌干细胞共培养，48小时内检测细胞GFP的特异性表达，确定转染效率。通过慢病毒载体技术纯化心肌细胞
在心肌细胞特异性启动子(NCX1)引导下，用慢病毒载体，结合荧光素酶，嘌啉霉素基因用于跟踪、纯化心肌细胞。NCXl promoter driving firefly luciferase (pLVX-NCXl-Fluc-PuroR-IRES-ZsGreenl)分化，生长的心肌细胞含有上述结构特点后，体内、外给予嘌啉霉素可杀死心肌细胞以外的各种细胞。通过生物体发光影相仪(Xenogen IVIS-200 System)可监测细胞生长，繁殖及移行情况。通过流体细胞仪纯化心肌细胞
用BMP刺激后，使咀嚼肌干细胞及先祖细胞分化为心肌细胞。来自咀嚼肌干细胞及先祖细胞将会用含有特异性心肌细胞起动子，绿色荧光蛋白的慢病毒载体转染。指定朝心肌细胞分化的先祖细胞含有绿色荧光，用流体细胞仪筛选出更纯化的心肌细胞。心肌梗塞模型和细胞移植
在麻醉的前提下，将大鼠心脏左前降支冠状动脉结扎。将含有来自咀嚼肌干细胞及先祖细胞分化心肌细胞用冠状动脉导管注射或细胞膜片技术(将细胞膜片放到心肌梗塞组织的表面)进行心肌细胞移植，关闭胸腔。一月后观察新分化心肌细胞的生长及心脏功能改变状况。免疫组织学
分离的心肌组织用10% (v/v)甲醛水溶液固定，石蜡包埋，切成5 厚标本。用免疫组化的方法进行各种染色，确定分化，新生的心肌细胞，血管内皮细胞及血管形成。
权利要求
1.运用了咀嚼肌干、眼轮匝肌干细胞具有心肌干细胞的特性，采用非编码小RNA体外改变并促进咀嚼肌、眼轮匝肌干细胞分化成心肌细胞，可用于治疗心肌梗塞及缺血性心脏病。
2.权利要求I的方法，其中包括无创活检方法收集咀嚼肌或眼轮匝肌样品。
3.权利要求I的方法，其中包括利用胶原酶消化处理咀嚼肌样品。
4.权利要求I的方法，其中包括悬浮培养酶消化处理后的咀嚼肌组织，单一咀嚼肌干细胞增殖逐渐形成球状细胞体。
5.权利要求I的方法，其中包括扩增咀嚼肌干细胞通过处理球状细胞体使之分成单一细胞，重复悬浮细胞培养。
6.权利要求I的方法，其中包括诱导分化成心肌细胞细胞贴壁培养，培养液加入非编码小RNA。
7.权利要求I的方法,其中包括通过流体细胞仪纯化心肌细胞。
8.权利要求I的方法，其中包括通过冠状动脉导管注射和细胞膜片技术进行心肌细胞移植治疗心肌梗塞及缺血性心脏疾病。
9.权利要求I的方法，其中包括采用NG-reagent技术介导Nanog、0ct4及Sox2蛋白进入咀嚼肌及眼轮匝肌祖细胞使其返祖为iPSC，将现有的iPSC转变成心肌细胞的转换率大幅度提高或采用NG-reagent技术介导GATA4、MEF2c及Tbx5蛋白进入咀嚼肌及眼轮匝肌祖细胞，直接诱导分化为心肌细胞。
10.权利要求I的方法，其中包括在心肌细胞特异性启动子(NCX1，acardiacsodium-calcium exchanger)引导下，结合慢病毒载体,绿色突光蛋白，嘌啉霉素基因用于跟踪、纯化来自咀嚼肌及眼轮匝肌祖细胞的心肌细胞。
全文摘要
该发明属于成体干细胞和再生医学领域。涉及成体干细胞提取、体外扩增、分化诱导及干细胞移植技术。依据头面部肌肉咀嚼肌与心脏祖细胞同一起源的理论基础。基因表达分析发现，在咀嚼肌干细胞中的心肌基因Nkx2.5和Isl1有不同程度的表达。本发明应用了咀嚼肌干细胞具有心肌干细胞的这一特性，采用无创活检方法收集咀嚼肌样品，经悬浮培养方法体外扩增咀嚼肌干细胞；采用非编码小RNA体外改变和促进咀嚼肌干细胞分化成心肌细胞并纯化。将已纯化的心肌细胞经冠状动脉导管注射或细胞膜片技术(将细胞膜片放到心肌梗塞组织的表面)进行心肌细胞移植至心肌梗塞部位，可用于治疗心肌梗塞及缺血性心脏病。
文档编号C12N5/071GK102703382SQ20121020821
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者滕国奇, 王义刚, 赵柏松 申请人:吉林省霍普金斯药物研究院有限责任公司