专利名称：一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一株碘普罗胺降解菌株-假单胞菌(Pseudomonas sp.)的碘普罗胺
酶活性测定方法。
背景技术：
碘普罗胺是碘化造影剂的一种，用于血管造影、肾动脉造影、尿路造影、CT的对比增强检查、体腔显示。该类物质具有极强的生化稳定性，人体注射后，80%的药物都不经新陈代谢而随尿液直接排出，同一些未处理而直接丢弃的过期或者失效的碘普罗胺直接排入城市污水管网。城市污水处理厂从成本和运营便捷性上考虑，一般采用生物法，但是由于碘普罗胺结构复杂，且被研发出来的时间不长，普通活性污泥通常会以结构更加简单、存在时间较长的污染物作为初级基质进行代谢，导致碘普罗胺的去除率极低，最终又进入水体，对环境系统造成潜在影响，因此成为目前国际上研究较多的痕量污染物——药品及个人护理用品(PPCPs)之一。目前，国内外对于PPCPs的降解与去除研究仍旧属于黑箱模型范畴，通常考虑的是外因条件变化所导致的不同去除率，然而如何更加有效地从根源上了解最佳去除模式还需更深入的研究。假单胞菌(Pseudomonas sp.)对于碘普罗胺的去除率最高可达99%,从环境中去除碘普罗胺不仅要考虑降解效率，更要考察菌体对于目标污染物的代谢过程，该细菌对目标污染物的去除实质上是其胞内酶的代谢作用，因此研究其酶活性所受环境生态因子的影响是迈出进入灰箱模型的第一步，其中酶活性的测定方法为之后的所有实验奠定了研究基石。
发明内容
本发明的目的在于建立一种检测结果稳定且便捷的碘普罗胺降解菌酶活性测定方法，为PPCPs的基础研究做前期准备。为了达到上述目的，本发明提供了一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，其特征在于，具体步骤为步骤a.标准曲线制作准确称量O. 3g碘普罗胺标准品加入IOOmL蒸馏水中，配成3g/L的碘普罗胺溶液，逐级稀释到3、6、9、12、15、18、2411^/1，在24211111波长下测其吸光度，绘制标准曲线；步骤b.样品的采集与制备配制含有30mg/L碘普罗胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL无机盐培养基，将本实验室分离得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)以10wt%的接种量接种到所述的无机盐培养基中，将其置于30°C摇床中在180r/min条件下避光振荡培养，Id后菌种生长量达到较为活跃的对数期，所得菌液即可作为待测样品；步骤c.样品浓缩将上步所得的待测样品取40mL装入50mL离心管内，以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，加入4mL pH7. I的Tris-HCl缓冲液清洗菌体，再以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，重复清洗一次，以20 30mL Tris-HCl缓冲液混匀沉淀物，放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所获溶液即为粗酶液；步骤d.样品培养向6只IOmL具塞试管中分别加入3mLpH7. I的Tris-HCl缓冲液、lmL15mg/L的碘普罗胺溶液以及ImL粗酶液，混合均匀后将3只试管作为样品管置于30°C恒温水浴锅培养2小时，另外3只作为空白对照管在80 90°C水浴放置IOmin灭活；步骤e.终止酶反应将样品管在80 90°C水浴中放置IOmin灭活,将样品管和空白对照管分别倒入IOmL离心管中，以12000rpm离心20min ；步骤f.吸光度分析将步骤e中离心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可见光分光光度计在242nm波长下测定吸光度，计算空白对照管与样品管的吸光度之差，比对碘普罗胺标准曲线，计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性，取三组数据的平均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解I μ mol碘普罗胺所需要的酶量。优选地，所述的步骤b中的无机盐培养基包括以下组份=K2HPO4 O. 435g、 KH2PO4O. 17g、NH4Cl O. 21g、CaCl2 · 2H20 0. 003g、FeSO4 · 7H20 0. OOlg、MgSO4 0. 02g、MnSO40. 005g、蒸馏水lOOmL，调节pH值为6. 8 7. 2。本发明的碘普罗胺酶活性测定方法解决了 PPCPs领域降解菌酶活性测定方法的空白，为此领域进一步研究奠定了技术上的基础，该方法选择通过底物即碘普罗胺浓度的减少量考察酶活性，并将停止酶反应的水浴温度控制在80 90°C，避免碘普罗胺因高温分解导致最终结果偏大的问题，与此同时，选择将空白样中同时添加酶液并高温灭活，可避免对照组因离心不够完全而出现吸光度偏高，两组对比样不在同一水平比较的情况。本方法检测简便、效果稳定，具有极高的实用价值，利于推广应用。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，具体步骤为a.标准曲线制作准确称量0. 3g碘普罗胺标准品加入IOOmL蒸馏水中，配成3g/L的碘普罗胺溶液，逐级稀释到3、6、9、12、15、18、24mg/L，在242nm波长下测其吸光度，绘制标准曲线，得出标线为y = 0. 0427x+0. 0062,R2 = 0. 9985，其中，y为吸光度，x为碘普罗胺浓度(mg/L) οb.样品的采集与制备配制含有30mg/L碘普罗胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL无机盐培养基(K2HPO4 0. 435g、KH2PO4 0. 17g、NH4Cl 0. 21g、CaCl2 · 2H20 0. 003g、FeSO4 · 7H200. 001g、MgSO4 0. 02g、MnSO4 0. 005g、蒸馏水 IOOmL, pH = 6. 8 7. 2。)，将本实验室分离得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)以IOwt %的接种量接种到所述的无机盐培养基中，将其置于30°C摇床中在180r/min条件下避光振荡培养，Id后菌种生长量达到较为活跃的对数期，所得菌液即可作为待测样品；c.样品浓缩将上步待测样品取40mL装入50mL离心管内，以8000rpm的速度离心30min,弃去上清液,加入4mL pH7. I的Tris-HCl缓冲液清洗菌体，以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，重复清洗一次，以25mL Tris-HCl缓冲液混匀沉淀物，放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所获溶液即为粗酶液；
d.样品培养向六只IOmL具塞试管中分别加入3mL ρΗ7· I的Tris-HCl缓冲液、lmL15mg/L的碘普罗胺溶液以及ImL粗酶液，混合均匀后将三只试管作为样品管置于30°C恒温水浴锅培养2小时，以便碘普罗胺按酶充分与底物反应，另外三只作为空白对照管在80°C水浴中放置IOmin灭活；e.终止酶反应将样品管在80°C水浴中放置IOmin灭活，将样品管和空白对照管分别倒入IOmL离心管中，以12000rpm离心2Omin ；f.吸光度分析将步骤e中离心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可见光分光光度计在242nm波长下测定吸光度，计算空白对照管与样品管的吸光度之差，比对碘普罗胺标准曲线，计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性，取三组数据的平均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解Iymol碘普罗胺所需要的酶量(IU =I μ mol/min) 0酶活力计算公式为
权利要求
1.一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，其特征在于，具体步骤为 步骤a.标准曲线制作准确称量0. 3g碘普罗胺标准品加入IOOmL蒸懼水中，配成3g/L的碘普罗胺溶液，逐级稀释到3、6、9、12、15、18、24mg/L，在242nm波长下测其吸光度，绘制标准曲线； 步骤b.样品的采集与制备配制含有30mg/L碘普罗胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL无机盐培养基，将本实验室分离得到的假单胞菌以IOwt%的接种量接种到所述的无机盐培养基中，将其置于30°C摇床中在180r/min条件下避光振荡培养，Id后菌种生长量达到较为活跃的对数期，所得菌液即可作为待测样品； 步骤c.样品浓缩将上步所得的待测样品取40mL装入50mL离心管内，以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，加入4mL pH7. I的Tris-HCl缓冲液清洗菌体，再以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，重复清洗一次，以20 30mL Tris-HCl缓冲液混匀沉淀物，放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所获溶液即为粗酶液； 步骤d.样品培养向6只IOmL具塞试管中分别加入3mL pH7. I的Tris-HCl缓冲液、ImL 15mg/L的碘普罗胺溶液以及ImL粗酶液，混合均匀后将3只试管作为样品管置于30°C恒温水浴锅培养2小时，另外3只作为空白对照管在80 90°C水浴放置IOmin灭活； 步骤e.终止酶反应将样品管在80 90°C水浴中放置IOmin灭活，将样品管和空白对照管分别倒入IOmL离心管中，以12000rpm离心20min ； 步骤f.吸光度分析将步骤e中离心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可见光分光光度计在242nm波长下测定吸光度，计算空白对照管与样品管的吸光度之差，比对碘普罗胺标准曲线，计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性，取三组数据的平均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解I U mol碘普罗胺所需要的酶量。
2.根据权利要求I所述的一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，其特征在于，所述的步骤b中的无机盐培养基包括以下组份=K2HPO4 0. 435g、KH2PO4 0. 17g、NH4Cl 0. 21g、CaCl2 2H20 0. 003g、FeSO4 7H20 0. OOlg、MgSO4 0. 02g、MnSO4 0. 005g、蒸馏水lOOmL，调节pH值为6. 8 7. 2。
全文摘要
本发明提供了一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，包括如下操作步骤a.标准曲线制作，b.样品的采集与制备，c.样品浓缩，d.样品培养，e.终止酶反应，f.吸光度分析。本发明的方法补充了PPCPs研究过程中酶测定方法的缺失，它的检测结果稳定，具有较高的实用价值，同时可用作其他降解菌酶活性的测定，利于推广应用。
文档编号C12Q1/25GK102758001SQ201210209199
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月22日 优先权日2012年6月22日
发明者何梦琦, 侍宽, 刘亚男, 刘振鸿, 刘畅, 张丹丹, 徐冰洁, 曾昊, 李珊珊, 桂梦瑶, 梅述芳, 毛菲菲, 王鹏, 程镜润, 薛罡, 金舒怡, 顾熙磊, 高品 申请人:东华大学