专利名称：血清中肌酐的两步酶测定方法
技术领域：
本发明涉及一种测定肌酐含量的方法，属于医学检验测定技术领域。属于一种 包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的 方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中肌酐的两步酶测定方法。
背景技术：
肌酐(creatintee，Cr)是一种相对分子质量较小(Mr= 113.1188)的极性有机含氮化合物，熔点为255°C。肌酐别名甲基胍基乙酸内酰胺，分子式为C4H7N3O,肌酐是在 肌肉中肌酸和磷酸肌酸代谢的最终产物。它是由磷酸肌酸通过脱磷酸基，并闭合成环而 形成的内脱水物。人体内肌酐包括两部分外源性肌酐，由食物摄取；内源性肌酐由肌 肉组织代谢生成。肌酐具有水溶性(80.1g/L，16°C)。除非体重异常变化，在正常情况 下，人体内肌酐的含量基本稳定，一般维持在3 14mg/L。肌酐是肌肉组织代谢产生的 物质，它仅仅由肾小球排泄，不被肾小管重吸收，而且由于肌酐是小分子物质不与血浆 蛋白结合，所以血清肌酐浓度是评价肾小球滤过功能的重要指标。肌酐是肌肉组织代谢 产物的废物，它仅仅由肾小球排泄，不被肾小管重吸收。因此，测定血清肌酐浓度及根 据血清肌酐与尿酐浓度计算所得的肌酐清除率，是既简单又可靠的肾小球滤过功能的指 标，深受临床重视。
临床实验室对于血和尿中肌酐的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法)，Jaffe 法虽然试剂较便宜、重复性、准确性也较好，但易受血清中其他假性肌酐物质的干扰。 尤其是当血清胆红素值2165.5 μ mol/L时开始出现负偏差，而且血清胆红素越高偏差越 大。此外，Jaffe法受到酮体、乳糜血和溶血的严重干扰，头孢类和维生素C及多巴胺等 药物也使其结果出现较大干扰。
酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化 物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色)，在505nm波长下测定其吸 光度A，其A值的大小和样品中肌酐的含量成正比的原理而设计的。由于酶本身具有的 特异性及高效性，肌酐酰氨基水解酐在反应中针对肌酐而不受其他物质的干扰，这使测 定结果接近于真值。
目前国内试剂厂家生成的肌酐氧化酶法试剂盒虽然包括双色原物质、肌酸脒基 水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶、肌酐酰氨基水解酶，但由于它 们的组合方式不同，肌酐测定结果受内源性干扰不同。
存在的问题是目前方法中，不管是一步酶法和两步酶法测定肌酐，测定过程 中肌酐水解后产生的肌酸和内源性肌酸同时转化为醌亚胺，肌酐测定结果包括肌酐和肌 酸之和。正常男性血肌酐参考范围为53 106 μ mol/L，女性44 88 μ mol/L ；正常男 性血肌酸参考范围为15 45 μ mol/L，女性为30 80 μ mol/L，当发生急性肌损伤、饥 饿、糖尿病、营养不良、甲亢、发热时肌酸显著升高，对肌酐造成的偏差更显著。浙江 东瓯公司是以肌酐酰氨基水解酶、过氧化物酶和4-AAP为第二试剂，且在试剂I中加入过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的H2O2而被消除，但问题是过氧化氢酶是否分解第二步 反应中产生的H2O2，而影响测定结果。本发明方法是将肌酐氧化酶法试剂分为两部分，其中试剂II内仅含有肌酐酰 氨基水解酶，其余为试剂I，本发明方法虽与原有的两步酶法成分相同，只是仅将肌酐酰 氨基水解酶放入试剂II，由于试剂I中含有双色原物质，内源性肌酸和肌酐水解后产生的 肌酸先后转化为醌亚胺，肌酐的测定效果明显不同。第一种方法试剂I中含有双色原物质、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏 血酸氧化酶、过氧化物酶及适量防腐剂。第二种方法试剂I中含有ATP、肌酸激酶、 丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶。第三种方法试剂I中含有肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物 酶、双色原物质。第四种方法试剂I中含有肌酸酶、尿素酶、α-酮戊二酸、NADH、 谷氨酸脱氢酶。下面以第一种方法为例说明本专利的技术特点试剂I中含有4-氨基安替比林 (4-ΑΑΡ)和N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)、肌酸脒基水解 酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶(POD)及适量防腐剂，试剂II内仅含 有肌酐酰氨基水解酶。反应过程为
权利要求
1.一种血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂II内仅含有肌酐酰氨基水解 酶及适量防腐剂；其它酶有效成分及色原物质同在试剂I中；其测定方法为待测血清 样品先与试剂I于37°c温浴3 5分钟，血清中肌酸与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂 II于37°C温浴4 7分钟，肌酐经肌酐酰氨基水解酶水解后产生肌酸，经反应也生成醌亚 胺；仪器在600nm 610nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，从试剂II 反应产生的醌亚胺计算出肌酐的含量，计算公式为ODcr = OD2-OD1X [SV+RiVi) / (已乂+民义+艮乂公]肌酐浓度=FXODcr其中00^是肌酐产生的吸光度，OD1是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD2 是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂I的体积， R2V2是试剂II的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中双色原 物质一个为4-氨基安替比林，另一个选自2，4-二氯酚、4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐 和苯磺酸盐中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂I及试剂II 中防腐剂选自Proclin-300。
4.根据权利要求1所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中消除维 生素C的干扰选自抗坏血酸氧化酶。
5.根据权利要求1所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂I每升磷 酸盐缓冲液内含HDAOS 0.6 1.4mmol、4-氨基安替比林2.4 3.6mmol、抗坏血酸氧 化酶15 25KU、POD 40 60KU、肌氨酸氧化酶30 50KU、肌酸脒基水解酶30 50KU、Proclin-300 150 250 μ 1 ；试剂II每升磷酸盐缓冲液内含肌酐酰氨基水解酶 450 550KU、Proclin-300 150 ~ 250 μ L
6.根据权利要求5所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于试剂I和试剂II 中磷酸盐缓冲液的ρΗ值为7.7士0.2。
7.根据权利要求1所述的血清中肌酐的两步酶测定方法，其特征在于测定所用各物品 的体积比为样品试剂I 试剂II = 1 75 80 25 20。
全文摘要
本发明公开了一种血清中肌酐的两步酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是将试剂分为两部分，其中试剂II中仅有肌酐酰氨基水解酶有效组分，双色原物质及其它酶有效组分同在试剂I中；其测定方法为血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中肌酸与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II于37℃温浴4～7分钟，肌酐水解后生成肌酸，经反应生成醌亚胺。仪器在600nm～610nm波长处检测，以与试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出肌酐的含量。本发明检测时不受内源性肌酸影响，其使用方法和范围与原有两步酶法相同，采用本发明完全可以通过生化分析仪器测出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用，是一种快捷、准确性更高的肌酐检测方法。
文档编号G01N21/78GK102023158SQ201010510709
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者李立和 申请人:李立和