专利名称：测定钙的试剂和测定方法
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发明领域本发明涉及用于测定钙的试剂和测定方法。更具体地讲，本发明涉及用于测定钙的改进的试剂，和能够准确测定来自活体的样品中的钙的改进了的测定方法，并且特别适用于临床诊断，所述样品，如血液样品(例如，全血，血浆或血清)或来自活体的含水的液体样品(例如，脑脊髓液，淋巴，唾液或尿液)。另外，本发明涉及用于螯合的空白对照试剂和用于测定金属离子的产生颜色的试剂，包括让螯合和产生颜色的试剂与所述金属离子起反应。
相关技术的说明作为定量分析样品中钙离子的方法，采用螯合和产生颜色的试剂的比色方法，通常适用于临床实验室检测，并且适用于一般的化学分析领域。作为螯合和产生颜色的试剂，主要使用了o-甲酚酞络合酮(o-CPC)，它的pH值最适合在碱性pH范围内呈色，其中，它与钙结合，以便形成的螯合物是稳定的。具体地讲，pH10或以上的高pH范围，例如，在JP-A-54-36996中所披露的。还有一种通过将8-羟基喹啉掺入偶氮胂-III中获得的已知试剂，它被用作螯合和产生颜色试剂，以便稳定这种试剂，正如在日本专利申请公开号06-505560中所披露的。另外，还有一种已知的用于钙分析的集成型多层分析元件，它是将偶氮氯膦-III用作螯合和产生颜色的试剂而获得的，并且具有通过使用光反射颗粒扩大的测定范围，正如在JP-A-06-50976中所披露的。另外，JP-A-04-120464披露了通过将偶氮氯膦-III用作螯合和产生颜色的试剂能够同时对钙和镁进行定量。
不过，通过使用螯合和产生颜色的试剂获得的用于钙测定的每一种常规试剂都留有改进的空间。例如，通过使用o-CPC获得的用于测定的试剂应当改进，因为它的pH为10或更高。就是说，由于这种试剂具有高pH，在使用时，通过吸收空气中的碳酸气体使它的pH显著降低。另外，当所述试剂以溶液形式长时间保存时，它的pH会降低，使得测定值在某些场合下变得不准确。另一方面，通过使用偶氮胂-III获得的用于钙测定的试剂由于具有比使用o-CPC的方法更低的pH而是有利的。不过，偶氮胂-III是有机胂化合物，因此，无法避免由于处理这种试剂而导致的环境污染问题。对于偶氮氯膦-III来说，最适合它的颜色改变的pH范围是弱酸性的，并且偶氮氯膦-III是不含胂的试剂。因此，相对于由高pH和毒性导致的问题而言，偶氮氯膦-III是优选的。不过，用于钙分析的集成型多层分析元件不是液体试剂，并且不会使它能够处理大量的样品，以便在短时间内完成测定。另外，在同时定量镁和钙时，将偶氮氯膦-III添加到样品中，以便同时将镁和钙结合在它上面，并且产生颜色，然后添加EGTA以便将钙从它上面解离下来，并且导致颜色减弱，并且根据颜色减弱程度对钙进行定量。由于偶氮氯膦-III能产生高的空白值，它限制了可以进行测定的范围。
就是说，尽管业已提出了通过使用螯合和产生颜色的试剂获得的用于钙测定的若干种试剂，尚没有提供能够解决上述所有问题的试剂，即由高pH导致的碳酸气体的吸收问题，使用有毒的胂化合物的问题，不能在短时间内测定大量样品的问题，以及高空白值，并因此导致可测定的范围较窄的问题。
发明概述因此，本发明的目的是为了解决上述问题，并且提供在保存稳定性方面出色，不存在环境污染问题，并且能够以溶液形式进行精确的钙测定的试剂。
本发明人研究了用于钙测定的与所述问题相关的试剂，并因此意外地发现，在有钒酸盐离子的情况下，偶氮氯膦-III能大大降低空白值。结果，发现了在通过使用偶氮氯膦-III或与它类似的化合物作为螯合和产生颜色的试剂，在足以与体液中的钙起反应的量的条件下，并且在与钒酸盐离子组合使用时，能够很好地解决由于高空白值导致的窄的测定范围问题和低的测定精确度问题，这些问题是使用偶氮氯膦-III或类似化合物时的最大的缺陷，因此，扩大了要检测的物种的测定范围，并且能够以高的精确度进行测定。本发明正是基于这一发现。
因此，本发明提供了用于测定钙的试剂，它包括钒酸盐离子和偶氮氯膦-III或与它类似的化合物。
另外，本发明提供了用于测定样品中的钙的方法，其特征在于在有钒酸盐离子的条件下，让样品中的钙与偶氮氯膦-III或与它类似的化合物起反应，并且根据反应产物导致的光学变化测定所述样品中的钙。
另外，本发明提供了用于螯合和产生颜色的试剂的空白对照试剂，它被用于根据通过螯合和产生颜色的试剂与金属离子的反应导致的光学变化测定金属离子，该试剂包括作为活性成分的能够抑制所述螯合和产生颜色的试剂本身呈色的钒酸盐离子。
本发明的用于测定钙的试剂和测定方法在以下各个方面都是出色的它们不存在由于高pH值导致的吸收碳酸气体的问题；它们不存在使用含有胂酸盐的有毒试剂的问题；它们能够处理大量的样品，以便在短时间内完成测定，因为可将它们用在自动分析仪上，并且由于样品空白值低，它们能够测定宽的范围。
优选实施方案的说明本发明用于测定钙的试剂的特征是，包括钒酸盐离子和偶氮氯膦-III或与它类似的化合物。
在本发明的用于测定钙的试剂中，将2，7-双[(4-氯-2-磷酸苯基)偶氮]-4，5-二羟基-2，7-萘二磺酸二钠(偶氮氯膦-III)[1914-99-4]或与它类似的化合物用作能够结合钙离子以便发生可检测的光学变化的指示剂。偶氮氯膦-III是具有以下结构式的化合物或它的盐。作为盐，钠盐是优选的。
所述类似化合物没有特别的限制，只要它是，例如，具有以下构架的化合物或它的盐就行，它能与钙离子结合产生颜色。
在上述化合物中，迄今已知的化合物包括3-[(4-氯-2-磷酸苯基)偶氮]-4，5-二羟基-2，7-萘二磺酸二钠(偶氮氯膦-I)[1938-82-5]，3，3-[(乙酰苯基)偶氮]-6(4-氯-2-磷酸苯基)偶氮]-4，5-二羟基-2，7-萘二磺酸二钠(偶氮氯膦-mA)[86167-87-5]以及它的盐。作为盐，钠盐是优选的。
在本发明中，钒酸盐离子与偶氮氯膦-III或它的类似化合物同时使用。钒酸盐离子能够有效作用于作为空白对照试剂的偶氮氯膦-III或类似的化合物，即，它们能有效发挥作用，以便抑制偶氮氯膦-III本身或它的类似化合物呈色。
尽管用于本发明的测定钙的试剂中的钒酸盐离子没有特别的限制，只要它们适合本发明的目的就行，但包括诸如VO3-VO43-等的五价钒酸盐离子是优选的。当上述钒酸盐离子在实践中使用时，从溶解度角度看，优选以盐的形式使用它们，如与碱金属(例如，锂，钠，或钾)形成的盐，或铵盐等。
尽管任何样品都可以作为用本发明的用于测定钙的试剂进行测定的样品，但来自活体的样品是合适的，就是说，所述试剂适合测定来自活体的样品中的钙。来自活体的样品包括例如，血液样品(例如，全血，血浆和血清)，来自活体的含水液体样品(例如，脑脊髓液、淋巴，唾液，和尿液)，以及它们的稀释剂。在本发明中，即使在将诸如含有诸如EDTA的螯合剂的血清用作来自活体的样品时，也可以精确地测定所述样品中的钙。而在使用所述血清时，使用o-CPC的方法却不能精确测定。因此，本发明的用于测定钙的试剂，在可应用于各种样品方面同样是有利的。
本发明的用于测定钙的试剂没有特别的限制，只要它是包括钒酸盐离子和偶氮氯膦-III或它的类似化合物就行。作为所述试剂，包括两种试剂的试剂(下面，在某些场合下称之为“双试剂系统”)是优选的，因为可将它用于生物化学自动分析仪上。在本发明中，对于所述双试剂系统来说，它的第一种试剂优选包括常用的缓冲剂(例如，乙酸钠)和表面活性剂。所述双试剂系统的第二种试剂包括偶氮氯膦-III作为必需成分，优选包括常用的缓冲剂(例如，乙酸钠)和表面活性剂，并且可以包括盐(例如，氯化钠)和防腐剂(例如，叠氮化钠)。对于双试剂系统来说，从试剂的稳定性角度来看，优选将钒酸盐离子掺入诸如偶氮氯膦-III的第二种试剂。
优选对本发明的用于测定钙的试剂进行调节，以便用于使样品与偶氮氯膦-III起反应的液体的pH，例如，当本发明的试剂由两种试剂组合时，通过将第一种试剂和第二种试剂混合获得的液体的pH可以优选为3.5-7.5，更优选4.5-6.5，特别优选4.8-6.2。当该液体的pH低于3.5时，在测定钙时，样品中的蛋白和偶氮氯膦-III倾向于彼此结合，因此难于精确地测定钙。当所述液体的pH超过7.5时，获得了高的试剂空白值，或对镁产生了影响。因此，在某些场合下不能够精确测定。所述双试剂系统的第一种试剂和第二种试剂优选分别具有2.0-9.0的pH。同样在这种情况下，通过混合第一种试剂和第二种试剂获得的液体的pH优选为3.5-7.5。从偶氮氯膦-III和钒酸盐离子的稳定性角度考虑，第二种试剂的pH更优选为7.5-9.0，特别是，7.7-8.5的pH。
当在本发明中通过使用由两种试剂，即第一种试剂和第二种试剂组成的用于测定的试剂测定钙时，所使用的样品，第一种试剂和第二种试剂之间的体积比例优选为例如1∶(10-100)∶(2-25)。尽管它是根据所使用的自动分析仪等而改变的。
下面，将解释本发明的测定方法。本发明的用于测定钙的方法的特征是，在有钒酸盐离子的条件下，让样品中的钙与偶氮氯膦-III或它的类似化合物起反应。
在本发明中，作为在与钙起反应时的浓度(下面在某些场合下称之为“最终浓度”)，偶氮氯膦-III的最终浓度优选为，例如0.01-10mM，更优选0.05-2mM，特别优选0.1-0.7mM，不过，可以根据所使用的样品的量等对该浓度进行调整。当所述浓度不够时，在某些场合下偶氮氯膦-III不容易结合钙。当所述浓度太高时，获得了高的空白值，因此，准确测定是困难的。
对于钒酸盐离子的浓度(mM)来说，它们的最终浓度优选为偶氮氯膦-III的浓度的1-300倍，更优选3-200倍，特别优选5-100倍。当钒酸盐离子的浓度太低时，在某些场合下获得了高的空白值。
下面披露了通过使用用于测定钙的由两种试剂，即第一种试剂和第二种试剂组成的本发明的试剂测定血浆中钙的具体例子。
将含有缓冲剂的第一种试剂和来自活体的样品在特定温度，优选25-37℃下混合特定时间，例如，5分钟。向所得到的液体中添加含有偶氮氯膦-III和钒酸盐离子的第二种试剂，并且在特定温度下，优选25-37℃，将它们混合特定的时间，例如5分钟，以便完成样品中的钙与偶氮氯膦-III的呈色反应。测定了在由于偶氮氯膦-III而呈色之前和之后反应溶液的吸光度值，并且计算由于着色而导致的吸光度值的改变。例如，来自活体的样品中的钙的浓度，可以通过与标准曲线比较吸光度值的改变而测定。所述吸光度值通常可以在660nm波长下测定。
当通过使用用于本发明测定的试剂测定钙时，可以使用生物化学自动分析仪，如日立公司Model 7150，日立Model 7170S，或类似仪器。
下面将说明本发明的用于螯合和产生颜色的试剂的空白控试剂。本发明的空白控试剂以含有钒酸盐离子为特征。
偶氮氯膦-III等能结合诸如钙离子的各种金属离子，并因此能够测定金属离子。不过，偶氮氯膦-III的溶液本身是高度有色的溶液，并因此在测定金属离子时产生高的样品空白值。结果，存在窄的金属离子测定范围的问题。钒酸盐离子能将偶氮氯膦-III溶液的着色有效抑制在对照空白值上。因此，在通过使用偶氮氯膦-III或它的类似物测定诸如钙离子的金属离子时，可以将钒酸盐离子用作偶氮氯膦-III或类似化合物的空白控试剂。
本发明的空白控试剂包括作为活性成分的钒酸盐离子，当诸如镁，钡，或钙离子等的金属离子在通过使用除了偶氮氯膦-III或它的类似化合物之外的螯合和产生颜色的试剂进行测定时也可以使用，如二甲基砜偶氮(dimethylsulfonazo)-3，或偶氮胂-I等。为了在实践中使用本发明的空白对照试剂，在本发明的用于测定钙的上述方法中，在所述螯合和产生颜色的试剂与金属离子起反应时，添加钒酸盐离子就足够了。
实施例1和比较实施例1-4在有钒酸盐离子的情况下用偶氮氯膦-III进行钙测定1.方法进行实验，以便判断在有钒酸盐离子的情况下，来自活体样品中的钙是否能用偶氮氯膦-III(在某些场合下称之为CPZ-3)精确地测定。将在有钒酸盐离子的情况下获得的测定结果，与在有钨酸钠，硫酸锰(II)，硫酸铜(II)和没有金属离子的情况下获得的测定结果进行比较。
作为样品，第一种试剂和第二种试剂，使用了以下样品和试剂。
样品样品来自活体，并且含有7.9mg/dL的钙(通过使用o-CPC方法测定的值)。
第一种试剂磷酸二氢钠50mM，pH6.0表面活性剂1.0％第二种试剂偶氮氯膦-III(CPZ-3)1.25mM氯化钠150mM钒酸铵40mM表面活性剂1.0％比较实施例如下。在比较实施例1中没有添加金属离子。在比较实施例2中，添加了40mM的钨酸钠。在比较实施例3中，添加了40mM的硫酸锰(II)。在比较实施例4中，添加了40mM的硫酸铜(II)。
测定方法如下。使用自动分析仪日立Model 7170S，在37℃下混合2.5μl的样品和200μl的第一种试剂5分钟，向得到的液体中添加50μl的第二种试剂，并且在相同温度下进行5分钟的着色反应。在660nm的显性波长下，测定着色反应之前和之后的吸光度值差异。通过以下公式计算钙浓度 公式1EAbs测定的吸光度值E空白空白溶液的吸光度值ESTD标准溶液的吸光度值STD浓度标准溶液的浓度2.结果表1表示所获得的结果。
表1
根据表1中的结果，发现在有钒酸盐离子的条件下，来自活体的样品中的钙能够通过与CPZ-3起反应精确地测定。还发现，当所述测定是通过不添加金属或者在有其它金属而不是钒离子的情况下进行时，不能够精确地测定钙。在有钒酸盐离子的情况下，CPZ-3与钒酸盐离子形成了螯合复合物，以便改变接近660nm波长下的吸光度值。由此形成的CPZ-3和钒酸盐离子的螯合复合物，抑制了CPZ-3与蛋白的非专一性反应。另外，由于CPZ-3对Ca的专一性，比对钒酸盐离子的专一性高，CPZ-3能够在有钒酸盐离子的情况下精确地测定Ca。另一方面，在不添加金属离子的情况下，在测定来自活体的样品中的钙时，会发生CPZ-3与来自活体的样品中的蛋白的非专一性反应，因此提高了吸光度值，从而导致阳性误差。在有任何其他添加的金属的情况下，CPZ-3和添加的金属的螯合复合物抑制了Ca与CPZ-3的反应，因此，不能够计算准确的钙含量。以上事实表明，CPZ-3与每一种成分的结合强度如下Cu2+＞Ca2+＞VO3-＞蛋白＞WO42-，Mn2+例2研究反应溶液中的pH通过在有钒酸盐离子的条件下将发生螯合反应的液体调整到各种不同的pH(pH4.0，5.0和6.0)，测定血清中的钙。作为样品，第一种试剂和第二种试剂，使用了以下成分样品样品来自活体，并且含有7.6mg/dL的钙。
第一种试剂甘氨酸100mM(当pH4.0时)或乙酸钠100mM(当pH5.0或6.0时)表面活性剂1.0％第二种试剂CPZ-3 1.25mM氯化钠 150mM钒酸铵 40mM表面活性剂1.0％表2表示所获得的结果表2
根据表2所示出的结果，发现特别是在pH5.0或6.0的条件下进行所述反应，对于钙的测定来说是特别优选的。
例3和比较实施方案5-7测定来自活体的并且含有EDTA的样品中的钙进行实验，以便判断来自活体并且含有EDTA(螯合剂)的样品中的钙是否能够在有钒酸盐离子的条件下，通过它与一种螯合和产生颜色的试剂-CPZ-3起反应而精确地测定。
在比较实施例5中，所述测定是在有钨酸盐离子的情况下进行的。在比较实施例6中，所述测定是在没有添加金属离子的条件下进行的。作为比较实施例7，检验了使用甲酚肽络合酮(o-CPC)并且不添加金属离子的方法，它是用于测定钙的一般方法。用于测定的第一种试剂和第二种试剂的组成如下样品样品来自活体并且含有EDTA(0，7.5或15mM)，并且钙的含量为7.6mg/dL。
第一种试剂磷酸二氢钠 50mM pH5.0表面活性剂 1.0％第二种试剂CPZ-3 1.25mM氯化钠 150mM各种类型的金属离子 40mM表面活性剂 1.0％表3示出了所获得的结果，即钙的测定值和相对值[(测定值×100)/实际含量]表3通过添加EDTA测定钙浓度(确切含量7.6mg/dL)
从表3中的结果可以看出，在有钒酸盐离子的情况下，来自活体的并且含有EDTA的样品中的钙可以通过它与CPZ-3的反应精确地测定。另一方面，发现在用钨酸盐离子取代钒酸盐离子的情况下，不能够精确地测定钙。另外，在不添加钒酸盐离子的情况下，通过采用CPZ-3的方法和采用o-CPC的方法(常规方法)不能测定钙。
本发明的用于测定钙的试剂和测定方法具有以下优点所述试剂即使是在长时间保存时也是稳定的，并且不会出现毒性问题，并且所述试剂和方法能够准确并且快速地测定大量样品中的钙，在用于临床实验室检测的诊断药物领域是非常有效的。
权利要求
1.一种用于测定钙的试剂，包括钒酸盐离子和偶氮氯膦-III或与它类似的化合物。
2.如权利要求1的用于测定钙的试剂，它是用于测定来自活体的样品中的钙的试剂，它可能含有螯合剂。
3.如权利要求1或2的用于测定钙的试剂，对它进行调整，以便所述试剂与样品起反应的反应溶液的pH可以为3.5-7.5。
4.如权利要求1-3中任意一项的用于测定钙的试剂，它是双试剂系统，由包括缓冲剂和选择性地包括表面活性剂的第一种试剂，和包括钒酸盐离子和偶氮氯膦-III或与它类似的化合物的第二种试剂组成。
5.如权利要求4的用于测定钙的试剂，对它进行调整，以便通过混合所述第一种试剂和第二种试剂所获得的液体的pH可以为3.5-7.5。
6.一种用于测定样品中的钙的方法，其特征在于在有钒酸盐离子的情况下，让所述样品中的钙与偶氮氯膦-III或与它类似的化合物起反应，并且根据由于所述反应产物导致的光学变化测定所述样品中的钙。
7.如权利要求6的测定方法，其中，所述样品是来自活体的样品，它可能含有螯合剂。
8.如权利要求6或7的测定方法，其中，所述样品中的钙与偶氮氯膦-III或与它类似的化合物起反应时的pH为3.5-7.5。
9.一种用于螯合和产生颜色的试剂的空白对照试剂，其被用于根据由螯合和产生颜色的试剂与金属离子的反应所导致的光学变化测定金属离子，该试剂包括能够抑制所述螯合和产生颜色的试剂本身着色的作为活性成分的钒酸盐离子。
10.如权利要求9的空白对照试剂，其中，所述螯合和产生颜色的试剂是偶氮氯膦-III或与它类似的化合物。
11.如权利要求9或10的空白对照试剂，它被用于测定钙。
全文摘要
一种用于测定来自活体的样品中的钙的方法，包括在有钒酸盐离子的条件下，让所述样品中的钙与偶氮氯膦－III或与它类似的化合物起反应，然后根据由所述反应产物导致的光学变化，测定所述样品中的钙，该方法在以下各个方面都是出色的它不存在由于高pH导致的吸收碳酸气体的问题；它不存在使用含有胂的有毒试剂的问题；它能够在短时间内对大量样品进行测定，因为可将它应用在自动分析仪上；并且它具有大的测定范围，因为具有低的样品空白值。
文档编号G01N33/50GK1719235SQ200510083250
公开日2006年1月11日 申请日期2005年7月7日 优先权日2004年7月8日
发明者野田健太, 小岛良, 片山胜博 申请人:日东纺绩株式会社