专利名称：乙型肝炎病毒大蛋白前s区抗原检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种使用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区抗原制备出的单克隆抗体、含有该单克隆抗体的试剂盒、其制备方法及其应用。利用该试剂盒可以快速、准确地诊断人体内乙型肝炎病毒的复制情况。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的全球性传染病，据估计，全世界目前大约有3亿乙肝病毒携带者，且这一数字还在增加。其中，中国是乙型肝炎的高流行区，据我国70年代末和90年代初两次全国肝炎的流行病学调查的数据显示，我们国家感染过乙肝病毒的人有6.9亿，感染率是57.6％，长期携带乙肝病毒的人有1.2亿，乙肝病毒表面抗原的携带率9.75％，历年累积下来，现有慢性乙肝病人约两千多万。HBV属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生有密切的关系。目前尚无有效的抗病毒方法治疗乙型肝炎病毒慢性感染，因此病毒的预防和检测就是避免感染的重要手段，对病毒感染的动态监测也能为乙肝的发展、预后提供重要信息。
乙肝病毒表面抗原(HBsAg)是HBV的外膜蛋白，由HBV基因组的S区所编码，S区分为preS1、preS2和S基因3段，它们阅读框相位相同，连续串联排列，可以共用1个终止密码。这3个基因分别编码三种表面蛋白(1)主要表面蛋白简称主蛋白，由S基因编码，是病毒包膜及亚单位颗粒的主要成分，因其分子量小，因此称之为小蛋白，传统上HBsAg常指由S基因编码的蛋白；(2)中等分子S蛋白(M蛋白)，由S及Pre-S2基因区所编码；(3)大分子S蛋白(L蛋白)，由S、Pre-S1及Pre-S2基因区所编码。大蛋白(Large protein，LP)是三种蛋白中分子量最大的。大蛋白的前S1在前S2区的上游，前S1和前S2区段形成构象型的前S区蛋白，作为大蛋白的组成，位于病毒颗粒表面，在病毒感染、复制、刺激机体产生免疫反应方面以及对乙型肝炎患者的诊断、治疗和预后均有重要参考意义。
HBV感染者血清中有3种不同形态的病毒颗粒小球形颗粒(直径22nm)、管状颗粒(直径22nm、长度100-1000nm)、Dane颗粒。S、Pre-S1及Pre-S2这3种蛋白在不同颗粒表面存在的情况不同，Dane颗粒与管形颗粒的包膜蛋白组成相同，每个病毒含有300-400个分子的S蛋白与40-80个分子的M蛋白和L蛋白。小球形蛋白的包膜蛋白组成则随病毒是否复制而异在有病毒复制者中，小球形颗粒包膜上的M蛋白和S蛋白含量与Dane颗粒上的大致相同，存在L蛋白，但比例低于1/20；在无病毒复制者中，小球形颗粒的包膜蛋白几乎全部是S蛋白，无L蛋白，仅有1％的M蛋白。
乙肝感染者中，外膜颗粒在血流中的分布在感染者的病人血流中大多数为22nm的小球颗粒，仅仅由大蛋白或同时有约5％的中蛋白组成；病毒复制期病人同时有少数长短不一、直径22nm的管型颗粒，由主蛋白、2％-5％中蛋白和5％-10％大蛋白组成。在病毒非复制期，大蛋白在血清中很低和无，大量滞留在肝细胞中。因此可以根据检测血液中大蛋白的有无，来判断病毒携带者体内的HBV病毒是否在进行复制。
酶联免疫吸附技术是目前最常用的检测患者血清中乙型肝炎表面抗原的存在情况的技术，通常利用单克隆抗体检测HBsAg。单克隆抗体由于是针对一个抗原表位的抗体，具有很高特异性，可以特异性识别相应抗原。利用固相包被的单克隆抗体将血清中的HBsAg特异地结合下来，再吸附酶标记的抗HBsAg多克隆抗体，对底物反应显色，显色结果就能作为量化指标反映血清中HBsAg的含量，体现乙型肝炎病毒的感染水平。
在血清大蛋白的免疫检测中，目前都利用大蛋白特有的区段preS1做为免疫原，制备单克隆抗体构建诊断试剂。但是蛋白的免疫表位中有很重要的一部分是依赖蛋白空间折叠后形成的高级结构出现的，制作单克隆抗体时，如果获得的抗原是低级结构的，理论上再好的序列，也会在实际形成高级结构时，可能被折叠、蜷曲而失去暴露表位的机会；构成表位的某些肽段在缺少其他肽段的辅助折叠的情况下，形成的拓扑结构可能与生理状态下的不同。这样的抗原制作出来的单克隆抗体在实际应用中必然导致漏检，就象现在的前S1抗原诊断试剂盒，临床应用发现大量DNA阳性的标本试剂盒前S1检测是阴性。在乙肝病毒大蛋白上并不单独存在前S1区段，而是存在前S1和前S2区组成的构象型前S区，乙肝病毒中的LP大蛋白中的前S区是构象型蛋白，具有复杂的拓扑结构，只有针对此复杂结构的特异性单克隆抗体，才能真正捕捉到大蛋白的存在。
本发明的目的正是为了解决目前临床上用抗preS1单抗来作为乙型肝炎大蛋白指标检测手段的不足，利用针对大蛋白前S区构象型表位的单克隆抗体诊断乙型肝炎病毒的复制水平，并且提供了操作简便、准确灵敏的检测试剂盒和测定方法，从而可以提高乙型肝炎病毒大蛋白的检出率，以便临床从蛋白水平上观察病毒复制水平，能尽早采取有效的综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。
发明内容
本发明提供了诊断试剂盒及其制备方法，通过该试剂盒可以准确地诊断出乙型肝炎病毒的复制感染情况。由于使用了特异针对构象型乙型肝炎大蛋白的单克隆抗体，能真实地反应出血清中大蛋白的存在水平，没有交叉反应性，特异性良好，便于质量控制，也显示出极高的灵敏度。
一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，其特征在于，它是通过使用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白抗原免疫小鼠、筛选杂交瘤克隆而获得的。优选地，所述的单克隆抗体是由下述方法制备出的用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或从血清中提取的具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
另一方面，本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备用于检测乙型肝炎病毒复制情况的试剂盒中的应用。
另一方面，本发明提供了一种制备单克隆抗体的方法，其包括用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或从血清中提取的具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
另一方面，本发明提供了乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白酶联免疫测定试剂盒，它含有单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是通过使用构象型乙肝病毒表面抗原大蛋白对动物免疫、筛选杂交瘤克隆而获得的。优选地，所述的单克隆抗体是由下述方法制备出的用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或从血清中提取的具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
上述的本发明的试剂盒还可以含有LP阳性、阴性对照、酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体、辅助试剂，其中，所述的单克隆抗体是包被在酶标板上。
另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的制作方法，其包括LP阳性、阴性对照的制备、单克隆抗体包被板的制作、酶标多克隆抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
本发明试剂盒中的LP阳性、阴性对照是从人血清中制备的。一种制备步骤包括收集乙型肝炎急性期病人血清和健康正常人血清，高温灭活，过滤除菌、分装，即获得LP阳性、阴性对照。
本发明试剂盒中的单克隆抗体包被板是用HBV-LP蛋白纯品对小鼠免疫而获得的鼠抗人单克隆抗体包被酶标板而制作的。酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12X4可拆条板。一种单克隆抗体包被酶标板的制作步骤如下
1)制备单克隆抗体用乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或血清中提取的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品，按常规对Balb/c小鼠进行免疫后，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水经重组proteinG预装层析柱纯化后即获得抗LP单克隆抗体。
2)包被将上述单克隆抗体用0.05M碳酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。
本发明试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记HBsAg多克隆抗体而制备的。一种酶标多克隆抗体的制备步骤如下a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml。
b)多克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。
c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗HBsAg多克隆抗体。
本发明试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，一种配制辅助试剂的方法如下a)底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；b)显色液B四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；c)反应终止液2mol/L硫酸；d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
另一方面，本发明还提供了检测乙型肝炎病毒的复制情况的方法，其中包括使上述试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
更具体地，本发明的检测方法包括下述步骤
a)抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入50μl阳性、阴性对照血清，或待测血清样品，将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔50μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。
b)显色反应每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
c)比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
d)结果判断A.阳性质控血清OD值在2.0以上，阴性质控血清OD值在0.05以下时，本次测定有效。
B.待测样品OD值大于0.105时判为乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白阳性。
另一方面，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白定量酶联免疫测定试剂盒，它含有LP标准品、单克隆抗体、酶标板、辣根过氧化物酶标记多克隆抗体、辅助试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体是通过使用构象型乙肝病毒表面抗原大蛋白对动物免疫、筛选杂交瘤克隆而获得的，且包被在所述的酶标板上。优选地，所述的单克隆抗体是由下述方法制备出的用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或从血清中提取的具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的制作方法，其包括标准品的制备、单克隆抗体包被板的制作、酶标多克隆抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
本发明试剂盒中的LP标准品是通过基因工程、分子生物学和生物化学的手段重组表达制备的。一种制备步骤包括用杆状病毒表达乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白，利用融合表达的蛋白标签做亲和纯化，即获得LP标准品。
本发明试剂盒中的单克隆抗体包被板是用HBV-LP蛋白纯品对小鼠免疫而获得的鼠抗人单克隆抗体包被酶标板而制作的。酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12X4可拆条板。一种单克隆抗体包被酶标板的制作步骤如下1)制备单克隆抗体用乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或血清中提取的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白纯品按常规对Balb/c小鼠进行免疫后，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水经重组proteinG预装层析柱纯化后即获得抗LP单克隆抗体。
2)包被将上述单克隆抗体用0.05M碳酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。
本发明试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记HBsAg多克隆抗体而制备的。一种酶标多克隆抗体的制备步骤如下a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml。
b)多克隆抗体和HRP在碱性CB缓冲液中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。
c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗HBsAg多克隆抗体。
本发明试剂盒中的辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，一种配制辅助试剂的方法如下a)底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；b)显色液B四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；c)反应终止液2mol/L硫酸；
d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
另一方面，本发明还提供了检测乙型肝炎病毒的复制情况的方法，其中包括使上述试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
更具体地，本发明的检测方法包括下述步骤a)抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入50μl已稀释好的不同浓度的标准品，或待测血清样品，将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔50μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。
b)显色反应每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
c)比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
d)结果计算A制作标准曲线以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.98时本次测定有效；B计算待测血清样品浓度根据待测样品的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的LP浓度。
与已有的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白检测指标preS1试剂相比较，本发明试剂盒具有以下优点a)本发明试剂盒以preS1+preS2段形成的构象型抗原免疫获得的单克隆抗体作为乙型肝炎病毒感染复制水平的诊断指标，克服了以往检测试剂仅用preS1免疫获得抗体进行检测的低检出率，与PCR检测结果达到96％以上的吻合。
b)大蛋白单克隆抗体对S蛋白没有反应，对preS的构象型表位有高度特异性，能有效反映出血清中大蛋白的存在水平，提高复制状态的HBV的检出率。
c)试剂盒配套用的标准品，能够定量计算出血样标本中所含的乙肝病毒大蛋白的含量，而以往的前S1试剂只是定性。
具体实施例方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1LP定性酶联免疫检测试剂盒的制作一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白酶联免疫检测试剂盒(96人份)，其组成包括LP阴性、阳性对照各1瓶；LP单克隆抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的HBsAg多克隆抗体1瓶，6ml/瓶；底物溶液A、显色液B各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体操作如下1.制备LP阴性、阳性对照1)收集血清从医院或血站获得健康正常人、健康产妇胎盘血清和急性期乙型肝炎患者血清，于-70℃保存备用；2)分装LP阳性对照血清急性期乙型肝炎患者血清，经检定为LP阳性，经60℃1小时处理后过滤除菌，在无菌条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
LP阴性对照血清健康产妇胎盘血清或其他正常人血清，经检定为LP阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌在无菌的条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作LP单克隆抗体包被板
1)LP单克隆抗体制备a)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原的构建(免疫原)在乙型肝炎病毒表面抗原编码区中，preS1区段是大蛋白独有的区段，是检测LP的必然选择。为获得该区段的构象型表位，选取preS1和preS2编码序列的全段，在杆状病毒中与亲和纯化标签his-tag融合表达，经镍柱亲和层析，获得纯化的构象型乙型肝炎表面抗原大蛋白preS抗原。
b)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的制备(免疫原)以a)亲和纯化的preS抗原免疫兔。产生的多克隆抗体利用PreS偶联的sepharose 4B做纯化。随后亲和纯化的多克隆抗体再偶联到sepharose 4B上，得到亲和柱，用于纯化来自急性HBV感染病人的天然的HBV preS抗原，获得HBV表面抗原大蛋白纯品。
c)免疫和细胞融合如b)制备的免疫原(乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白)与弗氏完全佐剂混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/C小鼠(CLEAJapan的产品，6周龄雄性)的背部位点。第一次免疫7天或14天后增强免疫，然后在细胞融合前3天，腹膜内施用0.2毫升上述免疫原。最后一次增强3天后，从各小鼠上切下脾脏细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14株，RikenGeneBank)以10∶1混合，用50％聚乙二醇4000融合。在HAT培养基(Gibco的产品)上选择性培养杂交瘤。
d)杂交瘤选择在融合后第12天，用ELISA法测定各培养上清液中的抗体活性。各取200微升的融合细胞的培养上清液加到96孔ELISA板Coaster的产品)的孔中，其中每孔固定有10微克/毫升的抗原，分别是杆状病毒表达的不同区段HBV表面抗原前S区重组抗原，包括preS1、preS2和preS1+preS2抗原。反应在37℃进行1小时，然后用含0.05％Tween 20的PBS(洗液)洗涤，在各孔中加入200微升过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Cappel产品，1∶20,000)。反应在37℃进行1小时后，用上述洗液洗涤板。然后在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M联苯二胺和0.012％过氧化氢水溶液)，使反应在室温下进行15分钟。然后，在各孔中加入50微升3.5mol硫酸终止酶反应，测量492纳米的吸光度，选择能与preS1和preS1+preS2抗原产生反应而不与preS2产生反应的抗体，并收获吸光度不低于0.15的杂交瘤克隆。用限制稀释法对各克隆进行两次克隆。克隆后的杂交瘤移植到BALB/C小鼠中，结果发现32个杂交瘤克隆产生各种可作为腹水回收的单克隆抗体。
2)包被酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板。将步骤1)所获单克隆抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。
3.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HBsAg多克隆抗体1)酶的氧化(全过程避光)a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解。
b)称取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度。
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟。
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌。
f)室温静置30分钟。
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)多克隆抗体的准备及标记(避光)a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次。
b)将多克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次。
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗HBsAg多克隆抗体a)完成标记的多克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3。
b)4℃静置1小时。
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮。
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀。
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀。
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀。
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度。
h)提纯的HRP-多克隆抗体对PBS透析过夜。
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗HBsAg多克隆抗体。
4)组装用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗HBsAg多克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.配制底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装。
5.配制显色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装。
6.配制反应终止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装。
7.配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
应用本发明技术制备LP定性酶联免疫检测试剂盒的质量检测1)准确性15份LP阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。10份LP阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。对系列稀释阳性参考品检测的阳性终点均不低于1∶8。
2)精密度随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份LP阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV＜＜15％。
3)检测灵敏度根据LP重组表达抗原梯度稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为2.4ng/ml。
4)特异性取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。
实施例2LP定性酶联免疫检测试剂盒的使用1.清洗缓冲液配制将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释。
2.抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入50μl阳性或阴性质控血清，或待测血清样品，将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔50ul，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作5次，每次3分钟。
3.显色反应每孔依次加入底物溶液A、TMB显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50ul反应终止液结束反应。
4.酶联反应将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温60分钟。重复洗板操作4次，每次3分钟。
5.比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均值；记录各孔吸光值；计算双孔阳性、阴性质控血清OD值的平均值。
6.结果判断阳性质控血清OD值在2.0以上，阴性质控血清OD值在0.05以下时，本次实验有效。待测样品OD值大于0.105时判为乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白阳性。
实施例3LP定量酶联免疫检测试剂盒的制作一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白酶联免疫定量检测试剂盒(96人份)，其组成包括LP标准品1瓶；LP单克隆抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的HBsAg多克隆抗体1瓶，6ml/瓶；底物溶液A、显色液B各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液瓶1，5ml/瓶；清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体操作如下1.制备LP标准品1)LP重组表达PCR获得preS1、preS2和S编码的HBV大蛋白全长序列，插入杆状病毒表达载体中，利用杆状病毒表达系统表达构相型LP蛋白，再利用融合表达的His标签做亲和纯化；2)HBV表面抗原大蛋白纯品按试剂盒说明书中标准曲线第一点所需要浓度分装(75ng/ml)、冷冻干燥、贮存于4℃。
2.制作LP单克隆抗体包被板1)LP单克隆抗体制备a)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原的构建(免疫原)在乙型肝炎病毒表面抗原编码区中，preS1区段是大蛋白独有的区段，是检测LP的必然选择。为获得该区段的构象型表位，选取preS1和preS2编码序列的全段，在杆状病毒中与亲和纯化标签his-tag融合表达，经镍柱亲和层析，获得纯化的构象型乙型肝炎表面抗原大蛋白preS抗原。
b)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的制备(免疫原)以a)亲和纯化的preS抗原免疫兔。产生的多克隆抗体利用PreS偶联的sepharose 4B做纯化。随后亲和纯化的多克隆抗体再偶联到sepharose 4B上，得到亲和柱，用于纯化来自急性HBV感染病人的天然的HBV preS抗原，获得HBV表面抗原大蛋白纯品。
c)免疫和细胞融合如b)制备的免疫原(乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白)与弗氏完全佐剂混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/C小鼠(CLEAJapan的产品，6周龄雄性)的背部位点。第一次免疫7天或14天后增强免疫，然后在细胞融合前3天，腹膜内施用0.2毫升上述免疫原。最后一次增强3天后，从各小鼠上切下脾脏细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14株，RikenGeneBank)以10∶1混合，用50％聚乙二醇4000融合。在HAT培养基(Gibco的产品)上选择性培养杂交瘤。
d)杂交瘤选择在融合后第12天，用ELISA法测定各培养上清液中的抗体活性。各取200微升的融合细胞的培养上清液加到96孔ELISA板Coaster的产品)的孔中，其中每孔固定有10微克/毫升的抗原，分别是杆状病毒表达的不同区段HBV表面抗原前S区重组抗原，包括preS 1、preS2和preS1+preS2抗原。反应在37℃进行1小时，然后用含0.05％Tween 20的PBS(洗液)洗涤，在各孔中加入200微升过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Cappel产品，1∶20,000)。反应在37℃进行1小时后，用上述洗液洗涤板。然后在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M联苯二胺和0.012％过氧化氢水溶液)，使反应在室温下进行15分钟。然后，在各孔中加入50微升3.5mol硫酸终止酶反应，测量492纳米的吸光度，选择能与preS1和preS1+preS2抗原产生反应而不与preS2产生反应的抗体，并收获吸光度不低于0.15的杂交瘤克隆。用限制稀释法对各克隆进行两次克隆。克隆后的杂交瘤移植到BALB/C小鼠中，结果发现32个杂交瘤克隆产生各种可作为腹水回收的单克隆抗体。
2)包被酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板。将步骤1)所获单克隆抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。
3.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HBsAg多克隆抗体1)酶的氧化(全过程避光)a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解。
b)称取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度。
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟。
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌。
f)室温静置30分钟。
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)多克隆抗体的准备及标记(避光)a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次。
b)将多克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次。
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗HBsAg多克隆抗体a)完成标记的多克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3。
b)4℃静置1小时。
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮。
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀。
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀。
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀。
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度。提纯的HRP-多克隆抗体对PBS透析过夜。
h)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗HBsAg多克隆抗体。
4)组装用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗HBsAg多克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.配制底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装。
5.配制显色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装。
6.配制反应终止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装。
7.配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
应用本发明技术制备LP定量酶联免疫检测试剂盒的质量检测1)准确性取三份待测样品混合后分为三份混合血清标本，每份1ml。分别加入0、20、100ng的LP纯品，制成回收试验血清标本#1、#2、#3。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按回收率计算公式计算回收率。标本#2、#3的回收率分别为96.4％和98.7％，平均回收率为97.5％，即试剂盒的比例偏差为2.5％，准确性为97.5％。
2)精密度随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份待测样本体按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15％3)线性范围用LP纯品稀释成一系列不同浓度的纯品溶液300ng、15ong、75ng、37.5ng、18.8ng、9.5ng、4.8ng、2.4ng、1.2ng。按照说明书操作步骤进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。线性范围内最高检测上限值为150ng/ml，最低检测下限值为2.4ng/ml。试剂盒的线性范围为2.4～75ng/ml。
4)检测灵敏度根据上述线性范围测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为2.4ng/ml。
5)特异性取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(P1asmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。
实施例4LP定量酶联免疫检测试剂盒的使用1.清洗缓冲液配制将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释。
2.将试剂盒提供的标准品第一点冻干粉(浓度75ng/ml)用500ul清洗缓冲液溶解，然后进行倍比稀释5次。试剂盒中的标准曲线由6个不同浓度的LP标准品组成，标准曲线各点浓度分别为75ng/ml、37.5ng/ml、18.8ng/ml、9.5ng/ml、4.8ng/ml、2.4ng/ml。
3.抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl已稀释好的不同浓度的标准品，或待测血清样品，37℃水浴保温60分钟。然后用清洗缓冲液重复洗板4次，每次3分钟。
4.酶联反应将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温60分钟。重复洗板操作4次，每次3分钟。
5.显色反应每孔依次加入底物溶液A、TMB显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
6.比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均值；记录各孔吸光值；计算双孔标准品OD值的平均值。
7.结果计算1)标准曲线的绘制以标准品浓度为横坐标、标准品测定的平均OD值为纵坐标，绘制本次测定的标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.98时本次实验有效。
2)计算待测样品浓度当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品中的LP浓度。
实施例5本发明LP定性酶联免疫检测试剂盒对HBV-DNA阳性样品的检测为判断本发明LP定性酶联免疫检测试剂盒与HBV-DNA PCR检测结果的符合率，取本发明LP定性酶联免疫检测试剂盒与同类型阿尔法前S1酶联免疫试剂进行比较。地坛医院临床研究数据200份已知HBV-DNA阳性标本，100份体检健康血清，100份丙型肝炎血清。分别用LP定性酶联免疫检测试剂盒及阿尔法前S1试剂盒检测和判断，结果见表1。
表1.不同检测方法的HBV检出率比较
理论上研究，乙肝病毒大蛋白与病毒复制密切相关，因此与病毒DNA的存在应该高度符合，本实验结果表明，本发明对于HBV-DNA的符合率高达96％，比原来依靠前S1的检测符合率明显提高很多。
实施例6本发明LP定性酶联免疫检测试剂盒对乙肝大三阳标本和小三阳标本的检测LP检测结果与乙肝五项指标的检测结果对照，对判断HBV病毒在体内的发展和治疗情况的预后有重要的指导意义。依据病毒学原理，乙肝大三阳患者其血清中HBV表面抗原大蛋白必定是阳性；而在小三阳患者中，LP阳性显示病毒正处于复制状态，发展成肝炎的几率很大。以本发明LP定性酶联免疫检测试剂盒分别检测乙肝大三阳和小三阳标本，取同类型阿尔法前S1试剂盒做参照，结果分别见表2和表3。
表2.不同检测方法对乙肝大三阳样品的检测结果。
参考试剂大三阳阿尔法前S1本发明1 0.419 0.3952 2.18 2.66430.00962.6874 0.428 2.7255 2.288 2.5396 0.904 2.7997 2.229 2.647 2.103 2.7248 1.874 2.5979 0.645 2.862100.824 2.874112.165 2.74412-A 2.05 2.47112-B 2.199 2.5212-C 2.161 2.306130.644 2.708141.505 1.281152.249 2.66116-A 0.192 2.65416-B0.08 2.658170.012 0.034
结果显示，大部分乙肝大三阳样品两种试剂检测结果均为阳性。针对16-A和16-B在两种检测试剂中完全不同的测定结果，再以PCR法确定，发现两标本均为PCR阳性，本发明LP酶联免疫检测试剂盒检测结果与之相符，但是阿尔法前S1试剂漏检。
表3.不同检测方法对乙肝小三阳样品的检测结果。
小三阳阿尔法本发明1 0.128 0.9520.403 0.0923 0.958 0.354 0.025 0.0155 2.077 1.7146 2.234 1.9577 0.025 0.02880.103 1.5849 2.241 2.03310 2.113 1.151110.024 0.14912 0.028 0.07213 1.974 0.80614 1.015 0.51315 0.965 0.438160.021 0.169170.078 0.06218 0.988 2.41519 0.016 0.04720 0.009 0.022210.013 1.02722 0.022 0.01723 0.296 1.55224 0.341 0.12825 0.216 1.347结果显示，本发明LP酶联免疫检测试剂在25个小三阳标本中检出216个阳性，阳性率64％，阿尔法前S1试剂仅有60％的阳性率，参照本发明LP酶联免疫检测试剂与HBV-DNA PCR检测的高符合率，阿尔法前S1试剂漏检的标本仍存在病毒大量复制的高度可能性。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区酶联免疫测定试剂盒，其特征在于，它含有使用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区抗原免疫小鼠、筛选杂交瘤克隆而获得的单克隆抗体。
2.一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区酶联免疫测定试剂盒，其特征在于，它含有通过下述方法制备出的单克隆抗体用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区重组抗原或从血清中提取的具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选LP特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，它还含有LP阳性、阴性对照、酶标板、辣根过氧化物酶标记多克隆抗体、辅助试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体是包被在酶标板上。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，它还含有LP标准品、酶标板、辣根过氧化物酶标记多克隆抗体、辅助试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体是包被在酶标板上。
5.一种制作权利要求3所述的试剂盒的方法，其包括LP阳性、阴性对照的制备、单克隆抗体包被板的制作、酶标多克隆抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
6.一种制作权利要求4所述的试剂盒的方法，其包括LP标准品的制备、单克隆抗体包被板的制作、酶标多克隆抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
7.一种检测乙型肝炎病毒复制情况的方法，其中包括使权利要求1-6中的任一项所述的试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
全文摘要
本发明提供了一种单克隆抗体，它是通过使用具有构象型表位的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区抗原免疫动物、筛选杂交瘤克隆而获得的。本发明还提供了含有该单克隆抗体的试剂盒、其制备方法及其应用。该试剂盒可用于乙型肝炎病毒的发展水平、预后诊断，可作为早期诊断乙肝病毒感染的指标，判断被病毒感染后的个体是否具有传染性，根据对乙肝大蛋白表达水平的监测还能确定患者的预后水平及引发肝硬化和肝癌的几率，为乙型肝炎的预防、诊断、治疗提供最直接的支持。
文档编号G01N33/577GK1700010SQ20051007745
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者林长青 申请人:北京热景生物技术有限公司