一种提高红霉素产量的方法

专利名称：一种提高红霉素产量的方法
技术领域：
本发明属于链霉菌技术领域，具体涉及高产红霉素菌株的选育、中间载体的构建和利用培育的突变菌株提高红霉素产量的方法。
背景技术：
自1943年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要成份都是从微生物的培养液中提取制造的。微生物培养液中产生抗生素浓度的多少很大程度上决定了该抗生素生产成本的高低。因此自从抗生素发现以来人们就一直不断地用各种方法筛选高产抗生素的菌种。目前，提高抗生素的产量的方法主要有两大类，一类是通过物理化学方法对菌种进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株；另一类是通过分子生物学的方法，对菌株进行直接的遗传改变，提高抗生素的产量。通过物理化学方法对菌种进行诱变有一定的肓目性， 筛选工作量大，但不需要对细胞的遗传背景有很深入的了解。这用来提高抗生素产量的广泛采取的方法，大部分抗生素工业生产应用的菌种都是通过这种方法得到的。这些高产菌株是人类社会劳动发展积累的宝贵财富。目前，随着细菌基因组研究的不断深入，对细菌基因功能认识的不断深刻，人们越来越倾向于用分子生物学的手段对菌株进行改造。用分子生物学的方法可以将功能已知的基因进行改造，增强了针对性，而且工作量大大降代，筛选时间也得到了缩短。然而，人类对微生物基因功能的研究，往往是基于抗生素产量很低的野生模式菌株。以这个菌株为背景得到抗生素合成调控或前体供应相关的信息用于自身菌株是能明显地提高野生模式菌株的产量。但把相关操作转移到工业应用生产的菌株之中，效果很多情况下并不明显。这是由于工业生产菌株经过一代又一代的随机诱变筛选后，遗传背景已经和模式菌株有很大的差别，在模式菌株得到的相关调控信息并不一定适用于生产菌株。而正是由于高产菌株遗传背景的多样性，在现实中很难找出一个抗生素高产的模式菌，能够代表所有高产菌株的特性而进行研究。因此这是对经随机诱变筛选产生的高产菌株进行基因工程改造提高产量的一个障碍。在已知的微生物所产生的抗生素中，约2/3由放线菌产生，而其中的80%来源于链霉菌。而链霉菌抗生素生物合成相关基因在染色体或质粒上往往成簇排列，构成基因簇。 其通常包括抗生素的生物合成基因，耐药基因，转运基因和调节基因。这些抗生素生物合成相关基因在染色体或质粒上成簇排列的特性为我们研究这些基因的结构，调控表达与进行基因克隆提供了方便。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种提高红霉素产量的方法。它利用红霉素生物合成的相关基因在染色体上成簇排列的特性，克隆红霉素生物合成整个基因簇的片段并再导入到亲本细胞中，使突变细胞红霉素合成基因的拷贝数增加，从而使这些基因在细胞中高于原始菌株所见的水平进行表达进而达到提高红色糖多孢菌中红霉素产量的目的。实践证明，本方法简便易行，不需要对抗生素合成的调控机理进行深入研究。即克服了物理化学诱变育种的盲目性和工作量的不足，又解决了在现有基因工程方法改造已经经过多轮诱变育种菌株的不确定性。不但能用于遗传背景清楚的模式菌，还可以用于遗传背景杂乱的高产诱变菌，是一种通用的提高抗生素产量的方法。本发明提供的在红色糖多孢菌中提高红霉素产量的方法流程图如图1所示，首先，从红霉素产生菌的基因组文库筛选出含有完整或部分红霉素生物合成基因簇的克隆。 第二步，将第一步得到的重组载体通过接合转移或其它方法转移到亲本菌株中。第三步，采用抗性筛选得到重组载体整合到亲本细胞染色体中的突变菌株。第四步，采用Southern杂交或PCR扩增，验证第三步得到的突变菌株。第五步，测试经第四步验证正确的突变菌株产红霉素的能力，得到红霉素高产的突变菌株。


图1利用在红色糖多孢菌中增加红霉素合成基因簇拷贝数来提高红霉素产量的流程图。图2表示表示一种示例性柯斯载体P0J436的结构，其包含OC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列及构建柯斯黏粒文库所必需的cos位点序列。图3表示实施例中黏粒C5所包含红霉素生物合成基因簇片段的结构示意图。图4表示对原始菌株S. erythraea HL3168 E3_attB和重组菌发酵液进行效价测
定结果。符号说明附图1中，Southern杂交为DNA杂交；PCR为聚合酶链式反应。附图 3 中，C5 cosmid 为黏粒 C5。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本方面的内容。实施例1利用增加红霉素生物合成基因簇内大部分基因的拷贝数，提高红色糖多孢菌(S. erythraea HL3168E3-attB)产红霉素的能力。涉及红霉素生物合成的基因簇约有561Λ的碱基对，而以柯斯载体为母体构建的基因文库只能容纳不超过501Λ碱基对的基因片段。本实施例中倍增了红霉素生物合成基因簇561Λ碱基对中的451Λ基因片段。本实施例采用柯斯载体p0J436作为构建基因文库
4的母体。P0J436除了包含噬菌体包装蛋白所识别的cos位点外，其质粒骨架上已经包含有 OC31整合酶及对应attP序列，并含有属间接合转移元件oriT (图幻。由其构建的黏粒可直接通过OC31介导的位点特异性重组整合进基因组中的attB靶序列中。1.包含有红霉素生物合成基因簇大部分片段载体C5的构建首先限制性内切酶Sau3AI部份酶切红色糖多孢菌总DNA，然后把总DNA经蔗糖梯度离心，得到的DNA片段略大于401Λ，脱磷。p0J436先用BglII从两个cos序列中间切开并脱磷，然后再从多克隆位点处用BamHI切开，获得两个臂，与制备的401Λ的DNA片段连接过夜。取连接产物与噬菌体包装蛋白包装，转染大肠杆菌E. coli印i300，得到文库。通过文库筛选，获得包含有红霉素生物合成基因簇内约451Λ片段大小的黏粒C5。 黏粒C5包含有红霉素聚酮合成酶(1 完整的基因序列及部分负责糖合成和后修饰的相关基因序列，右侧以糖基转移酶基因eryCIII为边界，左侧以甲基化酶基因eryK之外的两个ORF为边界。其基因结构图见图3，其详细序列信息见SEQ ID NO :1。2.将重组载体黏粒C5通过接合转移的方法导入红色糖多孢菌 S. erythraeaHL3168E3-attB(见中国专利，申请号 200910194419. 4)中。培养含有黏粒C5 的 E. coli ET12567 (pUZ8002)至 OD600 = 0. 5-0. 6，25mL 培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。 取适量冻存于_80°C的S. erythraea HL3168E3的20%甘油孢子悬液500 μ L，用等体积的 TES buffer洗两次，重悬于等体积的TES buffer，50°C热激IOmin使孢子萌发。再加等体积的TSB，37°C温育2Hir。离心重悬于0. 5-lmL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100 μ L与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有IOmMMgCl2的MS平板上，30°C 培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为50ng/yL)和相应抗生素的ImL无菌水。30°C培养5天以上挑取接合子。筛选含有阿普拉抗性的接合子。3.提取含有阿普拉抗性的接合子染色体DNA，采用PCR验证。PCR验证引物为引物对1 上游5-GACGCTGTTCCACTCCTACGCC-3(SEQID NO 2)下游5-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3(SEQID NO 3)引物对 2 上游5-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3(SEQID NO 4)下游5，-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3(SEQ ID NO 5)分别把经引物对1和2扩增的PCR产物连接T载体，进行核酸测序，测序结果与预期相符，证明黏粒C5定向插入至染色体细菌附着位点attB中。4.将重组菌株和对照菌株接种到摇瓶发酵，通过抑菌圈法测定红霉素发酵液生物效价。摇瓶发酵条件如下红霉素工业生产菌株HL3168E3和它的重组菌株在斜面培养基[/L :10g玉米淀粉， IOml玉米浆，3g氯化钠，3g硫酸铵，5g碳酸钙，pH 7. 0，2g琼脂粉]，34°C培养7天生长孢子，作为液体发酵的种子。液体发酵时，从斜面培养基上取Icm2大小方块接入50ml发酵种子培养基[/L :50g 玉米淀粉，18g黄豆饼粉，13ml玉米浆，3g氯化钠，1. 2g硫酸铵，1. 2g硝酸铵，5ml豆油，6g碳酸钙，pH 6. 8 7. 0]，在34°C，250rpm培养2天。然后将5ml的种子培养液转接到50ml发酵培养基[/L:40g玉米淀粉，30g黄豆饼粉，30g糊精，2g硫酸铵，IOml豆油，6g碳酸钙，pH 自然]，在34°C，250rpm培养6天。接种24小时后补加0. 5ml的正丙醇。生物效价测定如下取直径约90mm，高16_17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均勻摊布，放置水平台上使凝固，作为底层，另取培养基适量加热融化后，放冷至 48-50°C，加入短小芽孢杆菌菌悬液适量，摇勻，在每一双碟中分别加入5ml，使在底层上均勻摊布，作为上层含菌层。放置水平台上冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管 (内径6. Omm士0. 1_，高1.0士0. 1_，外径7.8士0. Imm)四个，用瓦盖覆盖备用。将样品分成高低两个浓度以磷酸缓冲液进行适当稀释后加入牛津杯。高低浓度的稀释倍数为2 1 或4 1，二剂量法标准溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18-22mm以内，抗生素浓度范围为5-20单位/ml。37°C培养14-16小时后，测量抑菌圈大小。[稀释缓冲液磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g加水至1000ml，过滤，115°C 灭菌 30min。pH = 7. 8]效价的计算标准品(S)试验品(T) AT是T的估计效价效价PT生物检定将T和其S在相同的试验条件下同时对生物或离体器官等的作用进行比较，通过对比计算出它们的等反应效呈比值(R)，以测得T的效价PTR是S和T的等反应剂呈(dS，dT)的比值，即R = dS/dTM是S和T的对数等反应剂呈(XS, XT)之差，即M = IgdS-IgdT = XS-XTR = ant i IgMPT是通过检定测得T的效价含量，称T的测得效价，是将效价比值(R)用T的估计效价AT校正之后而得，即PT = AT*R或试验品效价=Q*估计效价Q = Iog-I[(T2+T1-S2-S1)*I/(T2+S2-T1-S1)I为高剂呈与低剂呈之比，I为4 1时IogI = 0. 6021 2 1时IogI = 0. 3010S2 高剂呈标准品的抑菌圈半径Sl 低剂呈标准品的抑菌圈半径T2 高剂呈试验品的抑菌圈半径Tl 低剂呈试验品的抑菌圈半径]分析测定发酵液中红霉素的效价如图4所示，在所述摇瓶条件下，整合了 C5黏粒即增加了红霉素聚酮合成酶一个拷贝数的菌株产生比其原始对照菌株多近40%的红霉素。
SEQ ID NO 1
<110>中国科学院上海有机化学研究所，华东理工大学
<120> 一种提高红霉素产量的方法
<130>
<160>13
<170>Patent In version 3.3
6<210>1
<211>
<212>DNA
<213> 红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea HL 3168 E3) <400>1
tctgcgttgcagcgactgcggatggatcgagaagaactcacgcaagagccaagctgagtt60CgtCtgCgtgtcctgcggtttcacctgcaacgctgacctgaacgcctcgatcaacgtcgc120ggcaggacatgccggagggacaacaacgacccctggtcgttcacgtgtccgtgaacctca180actcgccctccggtgagttggaatcccccgcctccaggcgagggaggatgtcaaatccag240aagacaccggtggtcttcgacggggagctgacgctgctgcccatggggcagtacctgcac300cgcgccctcggcggcgactacgtcgccctcgccgccacgcacaccggcaccagcgccccc360gagatagagctcgacgacagcagcgacagcggcttcgccgttcgggaggtggatctgccc420gcaccggaggacggaagcatcgaggccgcggccgtcgcggcgcgcatcggaacgggcctc480gtcgacctgcgcgcgcaagctcccggcctggaccggatccgctcccagagcacgtggatg540cggacgccgctgcgcgacgcgttcgacgccgtgctcactgttcccaccgccaccgcggaa600gtctcgacacCCCgtCCggCgcgcgactaagctcaagatcgcgacgcgtgttcgccgacg660tggaaacgacCtgCtgCgCgaggagaacgttgaccaccatcgacgaagttcccggcatgg720ccgacgaaaccgcactcctcgactggctgggcacgatgcgcgagaagcagCCggtgtggC780aggaccggtaCggCgtgtggcacgtcttccgccacgccgacgtccagacggtgttgcgcg840acaccgccacgttctcctccgacccgacccgcgtcatcgagggcgcgagcccgacgccgg900gcatgatccacgagatcgacccgccggagcaccgcgccctgcgcaaggtcgtcagcagcg960ccttcaccccgcgcaccatctccgacctcgaaccccgcatccgcgacgtcacccgctcgc1020tgctggccgatgccggcgagagcttcgacctcgtcgacgtgctcgcgttcCCgCtgCCgg1080tcacgatcgtcgcggagctgCtgggCCtgCcgccgatggaccacgagcagttcggcgact1140ggtcgggtgccctggtcgacatccagatggacgacccgaccgacccggcgctggccgaac1200ggatcgcggatgtgctcaacccgctcaccgcgtacctgaaggcccgctgcgccgagcgcc1260gcgccgatcccggcgacgacctgatctcccgccttgtcctggccgaggtcgacgggcgcg1320cgctcgacgacgaggaggcggccaacttctccaccgcgctgctgctggccggccacatca1380ccacgaccgtcctgctcggcaacatcgtgcgcaccctcgacgagcacccggcccactggg1440acgccgccgccgaggaccccggccggatcccggcgatcgtcgaggaggtcctgcgctacc1500ggccgccgttcccgcagatgcagcgcacgacgaccaaggccaccgaggtcgcgggcgtgc1560ccatcccggccgacgtcatggtcaacacctgggtgctctcggccaaccgcgactccgacg1620cccacgacgaccccgaccggttcgacccgtcgcgcaagtcCggCggCgCCgcgcagctct1680ccttcggccacggcgtgcacttctgcctcggcgcgcccctggcccggctggagaaccgcg1740tggcgctggaggagatcatcgcccggttcgggcggctcaccgtcgaccgcgacgacgagc1800gcctgcgccacttcgaacagatcgtgctcgggacccgtcaCCtgCCggtgctggcgggct1860cctcgccgaggcagtcggcgtagtcgggcagcatccctcgCCgCCtggCggtctccaggt1920ccacggccacCgtgtCgCggtcggagagcacgacctccaggtccgcgggccacggcagac1980ccagcgcggggtcgaacgggtcgatcgcctgctcgtactcggccacgtacggcgtgctga2040ccaggtacgacatcagggtgtcgtcctcaagcgcgaggaaggcgtgcgcggtgcccctgg2100ggaagtagaccgcccggaagtgctcggtgtccatctccaccgcgtcccacttcccgaacg2160tcggcgagccgacccggatgtcgacgatgacgtcgagcgcCCggCCgCgCgcgcagtaga2220cgtacttgcaCtgCCCCggCggggtggtggtgaagtgcagcccgcgcagcacgccccggg2280cggagacgatgtggttcatctgggcgacggggaaccgatggcccaccgcgcccacgaacg2340cctcgtcctgcagcggagacacgaacaggcCCCgCCggtCCtgCttCgggtcgggggtga2400actcgaaaccgcccgccaccgccagctcacgtactcgcaactccggttcaccttccgcgc2460aggaagccgcggtggtcctcccacccgtcggcgatgtctcgttcgagctggttgagccgt2520gcggtcaccgactggtcgaagccgtcgaggaagtactcgtCgCCggggCggggctgcacg2580ccctcgttctccagcacgaagttctccaccacctcgcgcaggctggtcgacggggtgacc2640cggcccgcgatgtagcgggtggcgccctccagctccgggaagcccgcctcgcggtagagg2700tagacgtcgccgagcaggtcgatctgcaccgcgacctgggggtgcgcggtgggacgcatc2760gtctccggccggatgcgcagcagctcggcgtccacaccccgccgcaggctctccagggcg2820tagcccaggtcgatgtgcatgcccggggtcCgCtCggCggcgtagtcgacgaaccgcacc2880aggccctcgcgcagctcgttgcgctcggagtccgacagccggccgtcgtcgcggccgctg2940tagtcctcgcgcaccgtcacgaagtccagcggccgttgcgggctggactcgttgagctcg3000gcgatgaagtcgacgaggtcggtgagccggtcggcccgtcccggcaggatgatgtggttg3060aagccgagccggatcggcgcgtcccgctcggcgcgcatccgcaggaagccctgcaggttc3120ttcttgacgcgttcgaaagcgccgcgcttgCCggtggtCgtctcgtactcgtcgttgttc3180agcccgtagagggacgtgcggatcgcgcccagctcccacaggccgggctggcggttcagc3240gtctgctcggtgagggcgaaggcgttggtgtagacggtgaggtcgaaaccgcgcccggcg3300gcgtgcgacaccagctcgccgagaccggggttggtcagcggctcgagcccgcccgacatg3360tacatcgccttcgggttgtccgtgggcacctcgtcgatgatcgcggccagcgtctcgttg3420cccgccgggaccgatgcggcctcgtagcgggcaccggtcacccgcacgcagaagtggcag3480cggaacatgcacgtcggcccggggtacaggccgacgctgtaggggaaggcaggcttgcgg3540tagaccgccgcgtccagtgcgcctgcggcgtccagcggcttgatcgtgttggaccagtac3600ttgcccgccggaccgtgctccaccgcggtgcccaggtccgggatgcggccgaacaggtcg3660agcaggtgggcgaactccgcgcggtccaggccgagccgcgcacgcgtctgctccagcggc3720gtgaacgggtgcgccccgtagtgcgcggcgaggtcggcgagccgggcggcctgcacgtcg3780gcgtcaccgtcaccggcgccggtgacgcgggagacctccgagctcagcgcccgcacgacc3840gcccgccggtcgacgtccgggcgcgccgcgtcggcgacccccgcttcctgggcggttgcc3900gtacgagttgtgttcatcggggagcgaacctcctggcacttgtggcgcaggtcgtcacga3960accgttgcgcgtcctctggtcccattgcgcgttgatcagctcgccgctggtggcggcgag4020ccggatgatgtcgcacacccgccggatgtcctcgctggacaccgcggggccggtgggcag4080cgcgagcacccggtcggagagctgttcggtgttctccagccgcagcggcggctcggtccg4140gtacggctgcatctggtggcacccgggggagaagtagggttgtgccacaaccttctccgc4200tcgcaggatcgcctgcaactggtcgcggtcgatgccggtggccgcggagtccaccgagat4260gatcacgtactggtagttgttctgctcgccaggatcgaacgcgtgcacggatatgccgcg4320cacgtcgcggagctcgtcggagtagagcgcgtggttgaggcggttgtgcaccctggtctc4380
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权利要求
1.一种用于提高红霉素产量的方法，该方法包括将红霉素生物合成相关的部分或者全部基因导入亲本菌株的基因组，使突变菌株基因组中有至少两个拷贝的编码红霉素生物合成基因序列；在有助于合成红霉素的条件下培养亲本菌株和突变菌株时，突变菌株红霉素的产量比亲本菌株更高。
2.如权利要求1所述的方法，其特征所述的菌株为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)0
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的编码红霉素生物合成基因特指涉及红霉素次级代谢生物合成基因簇的相关之基因。
4.如权利要求1所述的提高红霉素产量的方法，具体步骤如下(a)从红霉素产生菌的基因组文库筛选出有完整或部分红霉素生物合成基因簇的克隆，从而得到有红霉素生物合成基因簇片段的重组载体；(b)将(a)步骤得到的重组载体通过属间接合转移转移到该红霉素产生的亲本菌株中；(c)抗性筛选得到重组载体整合到亲本细胞染色体中的突变菌株；(d)采用Southern杂交或PCR扩增，验证(c)步骤得到的突变菌株；(e)测定(d)步骤中验证正确的突变菌株的产红霉素能力，得到红霉素高产的突变菌株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是步骤(a)中所述的有红霉素生物合成基因簇片段的重组载体，此重组载体除采用文库筛选得到外，还包括通过PCR扩增克隆或噬菌体介导的基因重组的方法得到。
6.一种如权利要求5所述的方法，其特征是步骤(b)中所述的将重组载体转移到亲本菌株的方法，除了采用属间接合转移外，还包括用原生质体融合和电穿孔的方法。
全文摘要
本发明公开了一种在红色糖多孢菌中提高红霉素产量的方法。本发明通过在红色糖多孢菌染色体中增加一个或多个与红霉素生物合成相关基因簇的拷贝数，从而使这些基因在细胞中高于原始菌株所见的水平进行表达进而提高红霉素的产量。
文档编号C12N15/63GK102234674SQ20101015446
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者刘 文, 吴杰群, 张嗣良, 张庆林, 邓玮 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 华东理工大学