专利名称：草氨酸钠在制备fto酶抑制剂和减肥药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及草氨酸钠的新用途，具体设计草氨酸钠作为FTO酶抑制剂在减肥药物制备中的新用途。
背景技术：
近年来，全球肥胖人数不断增加，已经成为一个严重的社会问题和医学问题。不仅如此，肥胖还是II型糖尿病、心脏病、癌症等疾病的发病危险因素。目前常用的减肥方法有饮食控制、增加运动、服用减肥药物甚至手术治疗等，然而这些方法通常需要较多的时间投入，不易坚持，或者副作用较大，减肥效果不佳且易反弹，因此开发新型减肥药物一直是医学领域研究的热点(参见Haslay and Jaμ es，Obesity，2005)。许多科学研究表明，肥胖和基因存在着广泛的联系，其中一种名为“FTO” (fat mass and obesity associated)的基因在肥胖的发生中发挥着重要作用。Frayling等研究表明，FTO基因携带者其肥胖的发生几率比正常人高出70%之多(参见=Frayling,Timpson et al. Science, 2007)。FTO基因导致肥胖的机制可能与其抑制新陈代谢，降低能量消耗效率有关，另有报道FTO基因还可以引起病态的饥饿感，导致肥胖(参见=LardenCheung et al. Trends in Endocrinology &Metabolism，2011)。2009 年德国科学家 Julia Fischer 等在《自然》杂志上发表文章称，通过基因敲除抑制小鼠体内FTO基因的表达后，将这些小鼠与FTO基因正常的老鼠进行对比，结果发现虽然这些小鼠的饮食相对增加，且运动量也较少，但这些小鼠的体重和脂肪组织含量均明显低于正常小鼠(参见=Fischer Koch et al. Nature, 2009)(如图1 3所示，其中图1表示FTO基因抑制前后不同组织中FTO蛋白表达量的改变；图2表示FTO基因抑制前后对小鼠体重和脂肪分布的影响；图3表示FTO 基因抑制前后小鼠脂肪组织切片的病理变化)。不仅如此，研究表明抑制FTO肥胖基因还可以使代谢相关疾病如糖尿病、心血管疾病和某些肿瘤的发病率下降(参见Han Niu et al. Nature, 2010)。因此，抑制FTO基因的表达将有助于肥胖的控制。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种草氨酸钠的新用途，即草氨酸钠作为FTO酶抑制剂的应用以及草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂
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的应用，所述草氨酸钠的化学结构式为H』0O』a
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ο发明人通过体外细胞实验首次发现，草氨酸钠可以显著抑制FTO基因的表达；而 FTO基因表达受到抑制后，动物的体重和脂肪组织会明显下降，其作用机制与FTO基因调节机体食物摄入和控制能量代谢平衡有关。因此，本发明同时要求保护草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。
上述技术方案中，所述减肥药物除了包括主要成分草氨酸钠外，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充齐 、粘合齐 、湿润剂、崩解齐 、吸收促进齐 、表面活性齐 、吸附载体、润滑剂等；所述药物的剂型包括胶囊、片剂或注射剂，均可按照药学领域的常规方法制备。上述技术方案中，所述减肥药物适用的对象包括肥胖患者及体重超标者，尤其是 FTO基因携带者，可以有效地减轻体重和降低身体内脂肪组织含量。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点由于本发明采用草氨酸钠作为新的减肥药物，可以有效降低体重和脂肪组织，并且可预防肥胖相关疾病，如糖尿病、心血管疾病及相关肿瘤的发生。
图1为现有文献中FTO基因抑制前后不同组织中FTO表达量的改变；图2为现有文献中FTO基因抑制前后对小鼠体重和脂肪分布的影响；图3为现有文献中FTO基因抑制前后小鼠脂肪组织切片的病理变化；图4为实施例中不同浓度草氨酸钠对Α549细胞生长的影响；图5为实施例中不同浓度草氨酸钠对FTO基因mRNA的影响；图6为实施例中加入草氨酸钠(40mmol/L)后不同时间FTO的mRNA表达变化；图7为实施例中草氨酸钠对细胞内ATP浓度的影响。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一1. 1材料人A549细胞购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室保存和培养； D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30% Acry-Bis, "Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司。1. 2细胞培养A549细胞培养含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的D-MEM培养基。细胞置于5% C02，37°C培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。1. 3在A549细胞培养液中加入不同浓度草氨酸钠24h后，MTT法测定细胞的生长活性取对数期生长的A549细胞，用0. 25%的胰酶消化打勻细胞计数后，按每孔5 X IO3个细胞接种于96孔板中，每孔200 μ L，于C02培养箱中培养24h后，分别加入0、10、20、40、 80mmol/L的草氨酸钠，继续培养20h后，每孔加入20 μ L质量浓度为5mg/mL的MTT，继续处理4h后弃上清，加入150 μ L的DMS0，混勻IOmin后，在酶标仪上测量波长为570/630nm处的吸光度值(0D值)。结果如图4所示，随着草氨酸钠浓度的增加，细胞生长受到明显的抑制，其IC5tl(抑制50%细胞生长的浓度)为65mmol/L ；图4中，*与对照组比较，ρ < 0. 05 ；#与前一组比较，ρ < 0. 05。
1. 4在A549细胞培养液中加入不同浓度的草氨酸钠处理24h后，收样后进行 RT-PCR分析；所述RT-PCR方法为1)提取总RNA 采用1 μ 1 Trizol试剂裂解待测细胞。加入200 μ 1氯仿，剧烈振摇1 后室温静置15分钟。离心收集上清，加入500 μ 1异丙醇并混勻，室温静置IOmin后离心获取RNA沉淀。以70%乙醇洗涤2次，真空干燥RNA沉淀，最后溶于2Q μ DEPC水中。 紫外分光光度计测定OD26tl值并计算RNA浓度。2)合成cDNA 进行cDNA合成的反应条件为总RNA 5μ g、oligo dT引物1 μ 1、逆转录酶1 μ 1、dNTP混合物2 μ ，RNaseA抑制剂1 μ 1，总反应体系为2Q μ ，剩余体积由无RNA 酶的ddH20补足；上述混合物于37°C反应60min，然后以70°C作用IOmin结束反应，置于冰
上待用。3) RT-PCR反应以合成的cDNA为模板，使用FTO引物和作为阳性对照的GAPDH引物扩增相应基因。其中FTO的引物为=SEQ ID No. 1上游引物5' -CTGTGA CGA TGT GGA CAA TGA T-3'，SEQ ID No. 2 下游引物 5' -ACC TCT GAGTTC TGA AAC GAT G-3'，共 460bp。 GAPDH 的引物为=SEQ ID No. 3 上游引物 5' -CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3'，SEQ ID No. 4 下游引物 5' -CAACCT GGT CCT CAG TGT AG-3'，共 724bp。PCR 反应总体系为 25μ 1 反应体系中，GoTaq Green Master Mix 反应缓冲液 12. 5 μ 1，cDNA 模板 0· 5 μ 1，正向、反向引物均为0. 5 μ 1 (10 μ Μ)，剩余体积以ddH20补足。4)PCR 反应条件94°C预变性 5min ；94°C变性 50s，50°C退火 40s，72°C延伸 45s， 共30个循环，最后于72°C延伸Smin结束反应。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，经 0. 5 μ g/ml溴乙锭染色后在凝胶成像分析仪上进行观察。结果如图5所示，随着草氨酸钠的浓度增加，FTO基因的mRNA水平逐渐下降，并且呈现剂量依赖性；图5中，*与对照组比较，ρ < 0. 05 ；#与前一组比较，ρ < 0. 05。结果如图6所示，结果提示FTO的表达存在着时间依赖性，当加入草氨酸钠4h后， FTO的mRNA水平开始显著下降；图6中，*与对照组比较，ρ < 0. 05 与前一组比较，ρ < 0. 05。1. 5为进一步探讨草氨酸钠对细胞内能量代谢的影响，采用ATP检测试剂盒对加入不同浓度草氨酸钠后细胞内ATP的含量进行测定，ATP浓度的测量方法为采用碧云天 ATP检测试剂盒检测，取处于对数生长期的细胞加入不同浓度草氨酸钠24h后，按照说明书加入活细胞裂解液并放置在冰上裂解lOmin，在每个检测孔内加入100 μ 1的ATP检测试剂， 然后每孔加上100 μ 1样品，迅速混勻，立即用luminometer测定RLU值。最后与标准曲线比对，计算出细胞内ATP浓度。为消除检测时细胞总数对结果的影响，对细胞进行MTT检测细胞活性和BCA测量蛋白质浓度，取两者平均值对ATP浓度进行校正，最终以细胞个数为 IXlO6个计算ATP浓度。结果如图7所示，随着草氨酸钠的浓度增加，细胞内的ATP浓度逐渐下降；图7中， *与对照组比较，ρ < 0. 05 ；#与前一组比较，P < 0. 05。1.6统计学处理所有实验均重复3次，取平均值，结果用^± χ表示。灰度值采用 Bandscan 5. 0计算，每个条带重复3次。所有数据分析采用SAS 8. 0统计软件，两组均数比较应用t检验，多组均数比较应用方差分析，ρ < 0. 05认为差异有统计学意义。
权利要求
1.草氨酸钠在制备FTO酶抑制剂中的应用。
2.草氨酸钠在制备减肥药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及草氨酸钠的新用途，具体设计草氨酸钠作为FTO酶抑制剂在减肥药物制备中的新用途。发明人通过体外细胞实验首次发现，草氨酸钠可以显著抑制FTO基因的表达；而FTO基因表达受到抑制后，动物的体重和脂肪组织会明显下降，其作用机制与FTO基因调节机体食物摄入和控制能量代谢平衡有关。由于本发明采用草氨酸钠作为新的减肥药物，可以有效降低体重和脂肪组织，并且可预防肥胖相关疾病，如糖尿病、心血管疾病及相关肿瘤的发生。
文档编号A61P3/04GK102552231SQ20111043934
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者徐加英, 杨洋, 樊赛军, 秦立强 申请人:苏州大学