专利名称：对虾补体1q结合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾补体结合蛋白的基因序列，更具体涉及一种从斑节对虾肝胰腺cDNA文库中同源克隆出来一个补体Iq结合蛋白基因的序列、氨基酸序列、时空表达图谱，本发明还涉及该基因的用途。
背景技术：
补体系统的主要生理功能是促进吞噬和溶解靶细胞，消除外来抗原的侵害，是机体免疫防御机制的重要组成部分。补体被外来抗原激活通过两个途径(1)经典途径，被 IgM和IgG复合物或碳水化合物激活；和( 替代途径，被非已表面分子或细菌内毒素激活。两个途径终极效果，是通过在细胞表面形成膜攻击复合物，从而导致补体的激活。补体 Clq是经典激活途径中的起始成分之一，是各种补体分子中分子量最大GlOkDa)的γ球蛋白。Clq通过其胶原区的肽链相互聚合，从而增强B细胞产生Ig的作用。另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系统的活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞的损伤。现已研究证明，补体的过度激活将导致多种疾病，例如急性胰腺炎、阿尔茨海默病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、 中风、心肌梗死、溶血性贫血、血液透析、多系统器官衰竭等(Sahu，LambriS et al.，2000)。 因此抑制过度激活的补体级联反应，调节机能恢复动态平衡，对患此疾病获症状的人有所裨益。补体Iq结合蛋白是一种高度糖基化的蛋白，其特异性结合Clq胶原样结构域，调控补体Iq的活性，从而抑制补体系统过度激活。同时，ClqBP是丝裂原蛋白酶的底物，是 MAPK激酶级联反应的一部分，与细胞多种生理过程，如细胞生长、发育、分裂、死亡等密切相关。此外，某些病毒在进化过程中演变出利用补体Iq进入宿主细胞的侵染策略。因此，对补体Iq结合蛋白的研究，将有助于了解多种生理活动。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种对虾补体Iq结合蛋白的cDNA及由其编码的氨基酸。本发明的第二个目的在于提供含有上述对虾补体Iq结合蛋白的cDNA的表达载体。本发明的第三个目的在于提供一种制备重组对虾补体Iq结合蛋白的方法及由该方法制备的重组对虾补体Iq结合蛋白。本发明的第四个目的在于提供一种能与上述重组对虾补体Iq结合蛋白特异性结合的抗体。本发明的最后一个目的在于提供上述能与重组对虾补体Iq结合蛋白特异性结合的抗体在制备虾类抗病或增强虾类免疫力药物中的应用及其在制备虾类生殖调控药物中的应用。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种对虾补体Iq结合蛋白的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述对虾补体Iq结合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其核苷酸和氨基酸序列的对照如SEQ ID NO. 3所示。本发明上述对虾补体Iq结合蛋白(以下简称ClqBP)的cDNA，其具体通过如下方法获得通过以近源物种ClqBP基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾ClqBP基因的全表达序列。ClqBP又称p32，它与补体分子Clq的胶原样区结合，调控补体系统的经典途径。斑节对虾ClqBP基因包括120bp 5’-非翻译区序列，401bp 3’-非翻译区序列。该基因编码263个氨基酸组成的蛋白，分子量为 29kd0该基因在卵巢和免疫器官中高表达，并被外源刺激诱导表达，可在制备虾类抗菌抗病毒，以及卵巢发育和生殖调控药物中的应用。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种表达载体，所述的表达载体包含上述对虾补体Iq结合蛋白的cDNA。本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的一种制备重组对虾补体Iq 结合蛋白的方法，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的对虾补体Iq
结合蛋白ο其中，本发明所述的寄主细胞是原核或真核细胞。优选为大肠杆菌。本发明提供的一种重组对虾补体Iq结合蛋白，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的对虾补体Iq结合蛋白的步骤的方法制备获得。本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的一种能与上述重组对虾补体 Iq结合蛋白特异性结合的抗体。包括将上述DNA序列表达的原核或真核表达的重组蛋白， 免疫鼠、鸡等实验动物获得多克隆或单克隆抗体。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的重组对虾补体Iq结合蛋白在制备虾类抗病毒或增强虾类免疫力药物中的应用。或上述重组对虾补体Iq结合蛋白在制备虾类生殖调控药物中的应用。本发明的有益效果是本发明从对虾样品中得到一个新的对虾补体Iq结合蛋白的cDNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在真核或原核细胞中可以高效表达；本发明还将上述对虾补体Iq结合蛋白的cDNA序列克隆到原核或真核表达载体上， 转化大肠杆菌感受态细胞，通过阳性克隆子的诱导表达得到其重组蛋白，研究其性质发现， ClqBP基因在卵巢中特异性高表达，并受LPS刺激后上调，其多克隆抗体对白班综合症病毒具有阻断作用，揭示其可以作为虾类抗病或增强虾类免疫力药物使用，还对虾类的生殖调控具有良好作用。
图1显示ClqBP的blastP结果，含有MAM33亚家族结构域；图加是雄性斑节对虾ClqBP的半定量分析，M :marker ；1.肝胰腺；2.肠；3.鳃； 4.淋巴；5.神经；6.胃；7.精巢；8.血细胞；图沘是雌性斑节对虾ClqBP的半定量分析。M :marker ；1.肝胰腺；2.肠；3.鳃； 4.淋巴；5.神经；6.胃；7.卵巢；8.血细胞；
图3是ClqBP mRNA在斑节对虾性腺不同发育阶段中的表达，其中1.无节幼体; 2.蚤状幼体；3.糠虾幼体；4.籽虾；5. 7-8cm雌虾卵巢；6. 10-12cm雌虾卵巢；7. I期卵巢； 8. II期卵巢；9. III期卵巢；10. IV期卵巢；11. V期卵巢；12. 7-8cm雄虾精巢；13. 10-12cm 雄虾精巢；14. 14-15cm雄虾精巢；15. 15_16cm雄虾精巢；16. 18_20cm雄虾精巢；17. 20cm雄虾精巢；图4是斑节对虾ClqBP基因在LPS刺激下的表达特征分析；图5是ClqBP在大肠杆菌中的融合表达蛋白，其中M 蛋白marker ； 1. pET-ClqBP 的E. coliBL21重组菌株，IPTG诱导表达；2. pET_32a(+)空载体的E. coli BL21菌株，IPTG 诱导表达；图6是Ni-NTA树脂亲和纯化的ClqBP原核表达蛋白，其中M:蛋白marker ； l.pET-32a(+)空载体的Ε. coli BL21菌株，IPTG诱导表达；2. Ni-NTA树脂亲和纯化的 pET-ClqBP，第二收集管；3. Ni-NTA树脂亲和纯化的pET_ClqBP，第三收集管；图7是ClqBP原核蛋白的免疫印迹结果，使用pET_ClqBP多克隆抗体进行免疫印迹；图8是重组ClqBP (5mg/ml)以及重组ClqBP抗体对对虾的阻断效果图。
具体实施例方式下面通过以下具体实施方式
对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。1.总RNA的提取和肝胰腺全长cDNA文库构建1. 1总RNA的提取取鲜活健康斑节对虾(体重约150g)在实验室内暂养3d后(水温约，气泵充气)，解剖虾体取出肝胰腺约lOOmg，放入ImL RLT Buffer (Qiagen, USA)中进行低温研磨， 按照Qiagen Mini试剂盒使用说明提取总RNA，并使用DNase消化除去基因组。1. 2肝胰腺全长cDNA模板的制备按照GeneRacer kit (Invitrogen, USA)制备全长 cDNA 模板。取 3 μ g 总 RNA 经过小牛碱性磷酸酶(CIP)反应去除RNA 5’磷酸基团，经过烟草焦磷酸酶(TAP)去除RNA 5’ 帽子结构，利用RNA连接酶连上GeneRacer RNA Oligo，再利用GeneRacer OligodT引物在逆转录酶Superscript III的作用下50°C反应60min，从而获得全长cDNA的模板。2.补体Iq结合蛋白基因cDNA全序列的克隆2. 1兼并引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、小鼠、斑马鱼、果蝇等)ClqBP同源基因⑶S序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物。引物设计后采用乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成，得到以下引物序列F 5' -GCCDCCCNGA CKCGVACT-3，R 5' -CTGANCGTAHAAAGMATNCTBGTA-3。2. 2ClqBP基因片段的获取以近源物种ClqBP基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为 819bp。
GCCGCCCGGACTCGCACTCCTCTAATTCAAACAGTTTCCAGGACCAATTACCTGCGACTA60
TGAGTGCCATCAGCCGTGCTATGTACCGCCTTCAAGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATGG120
GCATCCGGGGTGTCGTGGCGCCGTCCCGAAACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGCT180
CCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTGTGCTCCTGCGGCT240
GCGGGATCCACGGCATGCACACGAGAGGAGATAGAGAGTTGGTAGAATTTCTACAAGAGG300
AMTATTGGCTGAGAAGAAAACAATGGCCAGTGGTGTTCCTTCACATATAGATGATTTCA360
AAGTTAGTGTTAATGATGCAGAGGTTACTCTTACMAGAACTTCCATGATGAGGTCATTG420
CCATCAGCCTCAACGTGAATCACACAGTAGACACTGAAGCCCCTGCTGAGTTGAGCCAAG480
ACCAGTCTGAAGGAGAGCTCMGAGTCGTCCCAGCTTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCT540
CGAAAACCCTGTCCTTCACGTGCTCTTACTCAGGACCAAGTGACATTACAGAAGGTCAAG600
ACCAGGTTGAGGATGCTTTTGGTATCMCGMCTTACCATGTATGAGGGCGAATGGAATG660
AAGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGATGTATGATCTTTTAATGA720
ACATGTTGGAAGAGAGAGGAGTCACMATGAGTTTGCAGAGAAATTGAGCAATCTCTGCT780
CTGACTACGAGCATTCTTTATACGTTCAGTTACTTCAAA819ClqBP基因的部分序列以上述合成的cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10x PCR反应缓冲液 5μ L，25mmol/L MgCl23 μ L, 10mmol/L dNTP 2 μ L，10nmol/L 弓丨物 F 禾口 R 各 2 μ L， Taq酶1. 25U，用超纯水将反应体系补充至50 μ L。反应条件为1个循环，94°C变性5min ； 35个循环:94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s ； 1个循环，72°C延伸IOmin ；4°C保温。 所扩增的PCR产物用的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)中，转化大肠杆菌DH-5 α感受态细胞， 挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经兼并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用Μ13 通用引物进行测序。2. 3ClqBP 全长 cDNA 的获得根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)技术对目的基因的3'和5'末端进行PCR扩增。
依据序列合成 5，RACE 引物 5，-CGCCCTCATACATGGTAAGTTCGT-3，和 3，-RACE 弓丨物5’ -CTCCGGTCTTCCACGCTGTGCT-3’，采用上述合成的全长cDNA为模板，按照GeneRacer Kit(Invitrogen, USA)进行5’ RACE PCR扩增。第一次反应体积为20 μ 1，反应条件为个 94°C变性anin ；5个循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸Imin ；25个循环94°C变性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 Imin ；1 个循环，72°C延伸 IOmin ；4°C保温。利用 5，RACE 巢式引物 5’ -AGCCGCAGGAGCACAGCGTGGAA-3’ 和 3’ RACE 巢式引物 5’ -CTGCTGAGTTGAGCCAA GACCAGTCTGA-3，进行巢式PCR，反应体积为50 μ 1，反应条件为94°C变性^iin ；30个循环 94°C变性 30s，68°C退火 30s，72°C延伸 Imin ； 1 个循环，72°C 延伸 IOmin ;4°C保温。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分离，亚克隆PGEM-T载体，T7、SP6进行测序反应获得约5’ RACE 片段301bp (图2)以及3，RACE片段787bp的核酸序列(图3)，拼接后获得全长cDNA为 1310bp(图 5)。TTTTTGGGTA TTTATTTAGG ACATCGTGTG CATCTCACGT GTACGAGAGG TTACAGGGAC 60CGCCGCCCGT ACTCGCACTC CTCTAATTCA AACAGTTTCC AGGACCAATT ACCTGCGACT 1200064]ATGAGTGCCATCAGCCGTGCTATGTACCGCCTTCMGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATG180[
GGCATCCGGGGTGTCGTGGCGCCGTCCCGA AACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGC240
TCCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTGTGCTCCTGCGGC300
T301
5，RACE获得序列
CTGCTGAGTTGAGCCAAGACCAGTCTGAAGGAGAGCTCAAGAGTCGTCCCAGCTTTGAAG60
TTGATATCAAGGTTGGCTCGMAACCCTGTCCTTCACGTGCTCTTACTCAGGACCAAGTG120
ACATTACAGAAGGTCMGACCAGGTTGAGGATGCTTTTGGTATCMCGAACTTACCATGT180
ATGAGGGCGAATGGAATGAAGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGA240
TGTATGATCTTTTAATGAACATGTTGGAAGAGAGAGGAGTCACAMTGARTTTGCAGAGA300
AATTGAGCAATCTCTGCTCTGACTACGAGCATTCTTTATACGTTCAGTTACTTCAAAAAG360
TGCAGGACTTCGTCAAGAGGMATAAGTGAGAAACTCTTGAACTGACAACAAATCACCAC420
AGTATCATCAAGCCCMGATTTCAAGTGAATGGATGGTCTGCCTTGCAAAAGTMCCATT480
TATGTTCCATTCTGAGTAGAMTGTMCAGATATTTCTTGTATTGGATATATCTAGGGCT540
GTTCATTTTCTTTTTTTCTTTTTTATATATAGTTACATAAAAATGAAGATTTTGATCATT600
AATAAAMATTGCTAACTTTTTATATGTTTACAGTTTGTTCTGTTGTATAGCTTATAATA660
TTTATCACTTMTGGTATCGTCTTTGCAAAAGGCAAGACACTGTMGTAATATGTACAGA720
AGAAGTCTAGGTTGAATGGCCTTGACTATCTCTTMTATATAACMAGATGGAMAAAM780
AAAAAM787
3，RACE获得序列
2. 4ClqBP的生物信息学分析
Accession
Description
Total E_ score value
XP 002400595.
202 3e-50
complement component [Aedes aegypti] >gb|ABF18301.1| complement component 1 q XP 001661410.1 subcomponent binding protein-like protein [Aedes aegypti] >gb|EAT36844.1| complement 235 5e-60 component [Aedes aegypti]
ABD36320.1 mitochondrial matrix protein p32 [Bombyx mori]224 6e-57
glycoprotein gClqBP, putative [Ixodes scapularis] >gb|EEC11284.1| glycoprotein gClqBP, putative [Ixodes scapularis]
complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial [Mus musculus] >gb|AAL77246.1 |AF300619_1 p32-RACK [Mus musculus] >gb|AAH38075.1| Complement component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >emb|CAI26064.1| complement —component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >emb|CAM46325.1|
complement component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >gb|EDL12635.1| complement component 1, q subcomponent binding protein, isoform CRA_b [Mus musculus] CAA04531.1 glycoprotein gClqBP [Rattus norvegicus]125 5e-27ClqBP 的 blast 分析结果用Blast (http: //www, ncbi. nim. nih. gov/)进行同源性分析，结果如图 4 所示， 该基因与伊蚊、蜱虫、小鼠等的ClqBP蛋白有高度同源性，揭示该基因是ClqBP基因。禾Ij用 DNAstar等工具进行生物信息学分析，揭示起始密码ATG位于121_口3核苷酸，终止密码子
NP 031599.2
134 le-29位于907-909核苷酸，开放读码框为789个核苷酸，推测编码一个263个氨基酸的蛋白(图 5)。5，UTR为120bp，3，UTR为388bp，3，UTR存在典型的加尾信号AATAAA(图5)。利用 SignalIP 软件(http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)分析该蛋白在 1-22 氨基酸为信号肽序列，并且在78-159氨基酉S存在典型的MAM33结构域(附图1)，揭示其属于线粒体基质蛋白家族成员。
TTTTTGGGTATTTATTTAGGACATCGTGTGCATCTCACGTGTACGAGA48
GGTTACAGGGACCGCCGCCCGTACTCGCACTCCTCTAATTCAAACAGT96
TTCCAGGACCAATTACCTGCGACTATGAGTGCCATCAGCCGTGCTATG144
MetSerAlalieSerArgAlaMet
5
TACCGCCTTCAAGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATGGGCATCCGGGGT192
TryArgLeuGlnGlySerLeuLeuProGlyValMetGlylieArgGly
101520
GTCGTGGCGCCGTCCCGAAACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGC240
ValValAlaProSerArgAsnLeuThrArgAsnLeuValValMetCys
25303540
TCCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTG288
SerAsnAlaGlyThrGlyArgArgThrProLeuArgSerSerThrLeu
455055
TGCTCCTGCGGCTGCGGGATCCACGGCATGCACACGAGAGGAGATAGA336
CysSerCysGlyCysGlylieThrGlyMetHisThrArgGlyAspArg
606570
GAGTTGGTAGAATTTCTACAAGAGGAAATATTGGCTGAGAAGAAAACA384
GluLeuValGluPheLeuGlnGluGlulieLeuAlaGluLysLysThr
758085
ATGGCCAGTGGTGTTCCTTCACATATAGATGATTTCAAAGTTAGTGTT432
MetAlaSerGlyValProSerHislieAspAspPheLysValSerVal
9095100
AATGATGCAGAGGTTACTCTTACAAAGAACTTCCATGATGAGGTCATT480
AsnAspAlaGluValThrLeuThrLysAsnPheHisAspGluVallie
105110115120
GCCATCAGCCTCAACGTGAATCACACAGTAGACACTGAAGCCCCTGCT528
AlalieSerLeuAsnValAsnHisThrValAspThrGluAlaProAla
125130135
TTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCTCGAMACCCTGTCCTTCACGTGC576
GluLeuSerGlnAsp Gln Ser Glu Gly Glu Leu Lys Ser Arg Pro Ser
140145150
TTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCTCGAMACCCTGTCCTTCACGTGC624
PheGluValAsplieLysValGlySerLysThrLeuSerPheThrCys
155160165
TCTTACTCAGGACCAAGTGACATTACAGMGGTCAAGACCAGGTTGAG672
SerTyrSerGlyProSerAspLeuThrGluGlyGlnAspGlnValGlu
170175180
GATGCTTTTGGTATCAACGAACTTACCATGTATGAGGGCGMTGGAAT720
AspAlaPheGlylieAsnGluLeuThrMetTyrGluGlyGluTrpAsn
185190195200
GMGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGATGTAT768
GluGluValTyrCysValSerGlyAsplieLeuAspGlyMetMetTyr
205210215
GATCTTTTAATGMCATGTTGGMGAGAGAGGAGTCACAAATGARTTT816
AspLeuLeuMetAsnMetLeuGluGluArgGlyValThrAsnGluPhe
220225230
GCAGAGAAATTGAGCAATCTCTGCTCTGACTACGAGCATTCTTTATAC864
AlaGluLysLeuSerAsnLeuCysSerAspTyrGluHisSerLeuTyr
235240245
GTTCAGTTACTTCMAAAGTGCAGGACTTCGTCAAGAGGAAATAAGTG912
ValGlnLeuLeuGlnLysValGlnAspPheValLysArgLys氺
250255260
AGAAACTCTTGAACTGACAACAAATCACCACAGTATCATCAAGCCCAA960
GATTTCAAGTGAATGGATGGTCTGCCTTGCAAAAGTAACCATTTATGT1008
TCCATTCTGAGTAGAAATGTAACAGATATTTCTTGTATTGGATATATC1056
TAGGGCTGTTCATTTTCTTTTTTTCTTTTTTATATATAGTTACATAAA1104
AATGAAGATTTTGATCATTAATAAAAAATTGCTAACTTTTTATATGTT1152
TACAGTTTGTTCTGTTGTATAGCTTATAATATTTATCACTTAATGGTA1200
TCGTCTTTGCAAAAGGCAAGACACTGTAAGTAATATGTACAGAAGAAG1248
TCTAGGTTGAATGGCCTTGACTATCTCTTAΑΤΑTATAACAAAGATGGA1296
AMAAAAAAAAAAA1310。
ClqBP的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
3. PCR检测ClqBP mRNA在雌雄斑节对虾不同组织的分布
提取了雌雄斑节对虾的不同组织(包括肝胰腺、肠、鳃、淋巴、神经、胃、精巢、卵巢、血细胞)的RNA。总RNA的提取方法见前所述取不同组织总 RNAl μg与反转录引物(Oligo-(dT) 18接头引物)lyL(10pmol/L)混合，70°C加热5min后，立即放置冰上，然后加入
5 X buffer, 2. 5mmol/L dNTP 混合液，Ribonuclease Inhibitor, M-MLV 反转录酶(Promega， USA)，反应体系为25 μ L0反应过程为42°C 60min, 70°C 15min,稀释1倍后作为模板使用。
PCR 反应使用半定量引物 ClqBP-Fl (5' -GAACTTGGTGGTGATGTG-3‘)和 ClqBP-Rl (5 ，-CGTATAAAGAATGCTCGTAG-3，)扩增 ClqBP 基因，扩增看家基因 EF-1 α (EF-F15，-ATGGTTGT CAACTTTGCCCC-3，，EF-R15，-TTGACCTCCTTGATCACACC-3，)作为内参，以上述合成的 cDNA 作为模板。PCR反应条件为94°C变性aiiin ；χ个循环(ClqBP为30个循环，EF_1 α为26个循环)94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 Imin ； 1 个循环，72°C延伸 IOmin ；4°C保温。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，结果见附图加和2b，可见在多种组织中均有表达，但在神经中没有表达，在肝胰腺、鳃、淋巴、血细胞等免疫组织和细胞中高丰度表达，同时卵巢表达量显著高于精巢。4. PCR检测ClqBP mRNA在性腺不同发育阶段的表达提取不同发育阶段的斑节虾，即无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、籽虾，以及体长为 7-20cm的雌雄斑节对虾性腺进行总RNA抽提。不同时期精巢按照体长进行取样，卵巢按照 I期、II期、III期、IV期、V期(分别为卵原细胞期、染色质核仁期、周边核仁期、卵黄囊期、 成熟期)进行取样。总RNA的提取方法、第一链CDNA逆转录和RT-PCR方法与前述相同。结果见附图3，可见在无节幼体至籽虾阶段该基因表达量低或不表达，随着性腺发育成熟开始有所表达。该基因在不同发育阶段的卵巢表达量都较高，而在不同发育阶段精巢中表达量均较低。再次印证了该基因是卵巢特异性表达的基因。5.荧光定量PCR检测ClqBPmRNA在不同刺激物的表达LPS是多数真核生物天然免疫系统的有效刺激剂。LPS诱导表达的基因往往被认为参加了宿主抗菌的天然免疫过程。为确认ClqBP是否参与这一过程，进行了 LPS刺激表达实验。健康斑节对虾按照5 μ g/g的剂量注射50 μ 1 LPS,对照组注射50 μ L PBS缓冲液 (NaCl 137mM, KCl 2. 7mM, Na2HPO4IOmM, KH2P042mM, pH 7. 4)，于第二腹节处向心注射。注射后
0-24h取肝胰腺，剪碎后置于RNAlater中保存，并带回实验室分析。总RNA抽提方法和cDNA逆转录方法见前所述。根据ClqBP基因的全cDNA长设计荧光定量 PCR 弓 |，ClqBP-F2(5，-CTCAACGTGAATCACACAGTAGACACT-3，)，ClqBP_R2 (5，-ACTTC AAAGCTGGGACGACTCT-3，)，同时选用 EF-1 α 作为内参基因，引物序列 EF_F2(5，-AAGCCAGGT ATGGTTGTCAACTTT-3，), EF-R2 (5，-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3，)。荧光定量 PCR 反应体系为 20μ 10μ L 的 2XSYBR Green Real-time PCR Master Mix(TaKaRa, Japanese)， 1 μ L cDNA模板，2 μ L引物和7 μ L的双蒸水，以蒸馏水代替模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，反应参数为95°C预变性10s，然后95°C变性15s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 共40个循环。实验数据采用相对CT法进行数据分析。结果见附图4，ClqBP在注射后池开始上调，到他达到表达高峰，表达量显著高于对照组，随着时间推移，表达量逐渐回落。说明ClqBP受LPS刺激后上调，是急性表达蛋白。6. ClqBP融合蛋白的制备以cDNA作为模板，利用PCR扩增ClqBP的部分开放读码框(l_210Aa)，PCR引物为 PETC-F :5，-ATGAATTCATGAGTGCCATCAGCCGTGCTA-3，；PETC-R :5，-ACCTCGAGAAGATCTCCAGA AACACA-3，；PCR 条件为 94°C 2min，94°C 30s，50°C，30s，72°C，lmin，共 30 循环。PCR 产物经 EcoRI, XhoI酶切后亚克隆到ρΕΤ-3^ι质粒，质粒经测序确认无误后，转化到大肠杆菌BL21 细胞，挑取单克隆培养至对数期，加入终浓度为0. 4mM的IPTG在37°C诱导表达3H附图5显示pET-ClqBP诱导表达为一个约43kD的融合蛋白，除去约21KD的标签蛋白，ClqBP
1-210Aa的原核表达蛋白约22KD，与预测的分子量一致。利用融合表达蛋白的6个组氨酸标签，使用Ni-NTA+树脂和His BindPurification Kit(Novagen, USA)对 pET-ClqBP 进行亲和层析纯化。纯化流程见 Novagen 试剂盒说明书。附图6显示His纯化效果较好，纯化的pET-ClqBP融合蛋白约43KD。7. ClqBP基因编码蛋白的多克隆抗体制备将纯化蛋白割胶回收(约100-200 μ g)，与3ml完全弗氏佐剂充分混勻孵化，在小鼠皮下多点注射，共注射8只小鼠，每只小鼠注射约50 μ g蛋白。第一次注射3周后加强免疫3次。加强注射剂量为10-20yg蛋白，使用不完全弗氏佐剂进行乳化。每次注射间隔10 天。第4次注射后将小鼠拔除眼球取血，将鼠血于37°C静置Ih后，4000rpm离心IOminJl 取上层多抗血清，分装保存于_80°C。附图7显示使用制备的多克隆抗体，可特异性的识别 ClqBP原核蛋白。8.重组ClqBP抗体对白斑综合症病毒的阻断作用将纯化获得重组ClqBP (5mg/ml)以及重组ClqBP抗体(用PBS磷酸缓冲液1 10 稀释)分别接种斑节对虾成体，每组15-16尾。对照组一注射小鼠血清(用PBS 1 10稀释)，对照组二注射磷酸缓冲液(PBS)。注射免疫物后12h，接种10_5浓度白斑综合症病毒 (WSSV)肌肉悬液，以后每隔Mi记录死亡情况。结果显示，对照组一和对照组二死亡规律相似，均在12天时累积死亡率达100% (图幻；使用重组ClqBP抗体进行被动免疫，5天后较对照组死亡时间延迟，死亡率降低至80%，具有一定的阻断效果(图8)。相应的，注射重组 ClqBP具有加速发病的效果，斑节对虾发病时间提前2-3天，累积死亡率达93% (图8)。9. ClqBP基因在酵母中的表达将ClqBP基因的开放读码框的核苷酸序列与pGAPZA和pGAP α B表达载体制备成真核表达质粒，并转入克隆菌株DH5 α。将表达质粒用限制性内切酶BspI消化，浓缩线性化DNA片段后，电转化毕赤酵母，在kocin抗性平板上筛选出重组克隆，并在3ml YPD (100 μ g/ml) Zeocin培养，48h后分别取菌体和上清于12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。筛选出游特异蛋白表达的克隆。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
权利要求
1.一种对虾补体Iq结合蛋白的CDNA，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.—种对虾补体Iq结合蛋白，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种表达载体，其特征是所述的表达载体包含权利要求1所述的对虾补体Iq结合蛋白的cDNA。
4.一种制备重组对虾补体Iq结合蛋白的方法，其特征是包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的对虾补体Iq结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述的寄主细胞是原核或真核细胞。
6.一种重组对虾补体Iq结合蛋白，其特征是包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的对虾补体Iq结合蛋白的步骤的方法制备。
7.一种能与权利要求6中所述的重组对虾补体Iq结合蛋白特异性结合的抗体。
8.权利要求7所述的能与重组对虾补体Iq结合蛋白特异性结合的抗体在制备虾类抗病或增强虾类免疫力药物中的应用。
9.权利要求6所述的重组对虾补体Iq结合蛋白在制备虾类生殖调控药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种对虾补体1q结合蛋白基因序列及其用途，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了含有上述对虾补体1q结合蛋白cDNA的表达载体，及利用上述表达载体制备的重组对虾补体1q结合蛋白及该重组对虾补体1q结合蛋白的制备方法，还公开了一种能与上述重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体。还进一步公开了上述能与重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体在制备虾类抗病或增强虾类免疫力药物中的应用。
文档编号A61K38/17GK102559689SQ20111043892
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年1月30日
发明者刘先军, 张殿昌, 杨丽诗, 杨其彬, 江世贵, 黄建华 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所