用作parp抑制剂的取代2－烷基喹唑啉酮衍生物的制作方法

专利名称：用作parp抑制剂的取代2－烷基喹唑啉酮衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及PARP抑制剂并提供了化合物以及含有所披露化合物的药物组合物。另外，本发明提供了使用所披露的PARP抑制剂的方法，例如作为医药品。
背景技术：
核酶聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)是PARP酶家族的成员之一。这个增长中的酶家族由PARP类如PARP-1、PARP-2、PARP-3和Vault-PARP与端锚聚合酶(Tankyrases，TANKs)如TANK-1、TANK-2和TANK-3组成。PARP也指聚(腺苷5’-二磷酸-核糖)聚合酶或PARS(聚(ADP-核糖)合成酶)。
PARP-1是116kDa的一个主要核蛋白，116kDa由以下三个域组成含有两个锌指结构域的N-端DNA结合结合结合域、自动修饰结构域和C-端催化结构域。它存在于几乎所有的真核细胞中。该酶合成了聚(ADP-核糖)，一种可包含超过200个ADP-核糖单元的支化聚合物。聚(ADP-核糖)的蛋白质受体直接或间接地参与维持DNA的完整性。它们包括组织蛋白、拓扑异构酶、DNA和RNA聚合酶、DAN连接酶和依赖于Ca2+和Mg2+的核酸内切酶。PARP蛋白质在许多组织，最显著的是在免疫系统、心脏、脑和胚种细胞(germ-line)中被高度表达。在正常生理状况下，PARP处于最低的活性状态。然而，当DAN受损则立即引起高达500倍的PARP活化反应。
端锚聚合酶(TANKs)被识别为人类端粒复合体的组分。它们还被提出在泡囊运输过程中扮演某种角色，并有可能是蛋白质参与各种细胞过程的平台。端粒是维持和稳定染色体的基本要素，它主要靠一种特殊的逆转录酶端粒酶来维持。端锚聚合酶是(ADP-核糖)转录酶，兼具发信号和细胞骨架蛋白质两种功能。它们含有催化基础蛋白质聚-ADP-核糖化的PARP域、与某些发信号分子共享的不育α基序以及含有24个与细胞骨架蛋白质锚蛋白同源的锚蛋白重复单元的ANK域。ANK域与端粒蛋白质(端粒重复结合因子-1(TRF-1))相互作用。这些蛋白质因此被命名为TRF1-相互作用的、与锚蛋白相关的ADP-核糖聚合酶(TANKs)。
TANK更具体的功能之一是TRF-1的ADP-核糖化。人类端粒功能需要两种端粒-特殊DNA结合蛋白质，TRF-1和TRF-2。TRF-2保护染色体末端，而TRF-1调节端粒的长度，ADP-核糖化抑制了TRF-1与端粒DNA的结合能力。TRF-1的此种ADP-核糖化作用使TRF-1从端粒中释放出来，打开了端粒复合体并使其接近端粒酶。因此，TANK起到调节端粒长度的正作用，使端粒可以通过端粒酶而加长。
在PARP(特别是PARP-1)提供的众多功能中，通过ADP-核糖化来促进DNA修复是其主要功能，并因此共同构成了许多DNA修复蛋白。PARP活化后，NAD+水平明显降低。大量PARP的活化导致DNA大规模受损细胞中NAD+水平的大幅滑落。聚(ADP-核糖)短暂的半衰期导致快速的逆转速率。一旦聚(ADP-核糖)形成，它很快受到结构活性聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)、磷酸二酯酶和聚(ADP-核糖)蛋白质裂解酶的作用而被降解。PARP与PARG形成一个循环，将大量的NAD+转变成ADP-核糖。在少于1小时的时间内，PARP的过渡刺激能导致NAD+滑落并使ATP下降到低于正常水平的20％。这样的情形在局部缺血期间，氧气剥夺已危及细胞能量输出是时是极为不利。随后再灌注时产生的自由基被认为是引起组织伤害的主要原因。在局部缺血和再灌注期间，ATP的部分降落在很多器官中是典型反应，可以认为是由于聚(ADP-核糖)的逆转而导致了NAD+的耗损。因此，期望通过抑制PARP或PARG来保存细胞的能量水平，从而增强损害后缺血组织的存活能力。
聚(ADP-核糖)的合成也涉及大量炎症反应本质基因的诱导表达。PARP抑制剂压制了巨噬细胞、P-型选择素和内皮细胞中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)中可诱导一氧化氮(iNOS)的产生。该活性使PARP抑制剂表现出强力的抗炎效果。PARP的抑制作用能通过防止嗜中性粒细胞易位和渗透到受损的组织中而减少组织坏死。
PARP被受损的DNA片断激活，并且一旦其被激活，就能催化多达100个粘附的ADP-核糖至各种核蛋白质，包括组织蛋白质与PARP本身。在较大的细胞压力之下，PARP的大量活化会通过储存能量的耗尽而迅速导致细胞的损害或死亡。由于每个NAD+分子的再生需要消耗4个ATP分子，同时NAD+因PARP的大量活化而被耗尽，为了重新合成NAD+，ATP也被耗尽。
已有报道说，PARP的活化作用在NMDA和NO诱导的神经毒性中起关键作用。这已在皮层培养基和海马神经元片断中得到证实，其中毒性的预防与PARP抑制作用的潜能直接相关。PARP抑制剂在治疗神经退化性疾病和头部创伤方面的潜在作用因此而被认知，即使其真正的作用机理还没有被说明。
类似地，已证实，单纯地注射PARP抑制剂可减少兔子心脏或骨骼肌因局部缺血与再灌注所造成的栓塞的尺寸。在这些研究中，单纯注射3-氨基-苯甲酰胺(10mg/kg)，不管是栓塞前1分钟还是再灌注前1分钟，均有类似地减少心脏栓塞尺寸(32-42％)的结果，而使用另一种PARP抑制剂1，5-二羟基异喹啉(1mg/kg)，可减少栓塞尺寸的程度与前者相当(38-48％)。由这些结果可以合理地假设，PARP抑制剂可用于事先抢救缺血性心脏或骨骼肌组织的再灌注损害。
也可用PARP的活化作用来度量由于暴露于下列诱发剂而造成的神经毒性损害谷氨酸(经由NMDA受体的刺激作用)、具有反应性氧的中间体、淀粉样β-蛋白质、N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)或其活性代谢物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，其参与如中风、阿耳兹海默氏症和帕金森氏症等病理状况。其它研究已持续探索到PARP活化作用在试管小脑粒细胞和在MPTP神经毒性中的作用。中风或其它神经退化过程中最常发生的后果是神经过度暴露于谷氨酸，它起到控制中枢神经系统神经传递素的作用，并对N-甲基D-天门冬氨酸酯(NMDA)受体和其它亚型受体起作用。在缺血性脑损伤如中风或心脏病期间，被夺走氧气的神经元释放出相当大量的谷氨酸。这些过量释放的谷氨酸反过来导致N-甲基D-天门冬氨酸酯(NMDA)、AMPA、红藻氨酸和MGR受体的过度刺激(兴奋性毒性)，打开离子通道并允许不受管制的离子流动(如Ca2+和Na+进入细胞而K+流出细胞)，导致神经元的过度刺激。被过度刺激的神经元分泌出更多的谷氨酸，产生反馈环或多米诺骨牌效应，最后通过产生蛋白酶、脂肪酶和自由基而导致细胞的损害或死亡。谷氨酸的过度活化已被认为牵涉到各种神经性疾病和病情，包括癫痫、中风、阿耳兹海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨丁顿氏症、人格分裂症、慢性疼痛、缺氧后的的局部缺血和神经损耗、低血糖症、缺血症、外伤和神经损伤。谷氨酸暴露和刺激作用已被暗示为强迫症的原因，特别是药物依赖性。证据包括在很多动物种类以及用谷氨酸或NMDA处理过的脑皮质培养物中发现，谷氨酸受体拮抗剂(即阻断谷氨酸与其受体结合或激活其受体的化合物)阻断了血管冲击后的神经损伤。试图通过阻断NMDA、AMPA、红藻氨酸和MGR受体来预防兴奋性毒性的方法已被证明相当困难，因为每个受体具有多个谷氨酸可结合的位置，因此想找到有效的拮抗剂混合物或万能拮抗剂来防止谷氨酸与所有受体结合并使该理论得到检验也相当困难。另外，很多能有效阻断受体的组合物对动物也有毒性。因此，至今仍未获知能有效治疗谷氨酸异常的方法。被谷氨酸刺激的NMDA受体，例如酶神经元一氧化氮合成酶(nNOS)的活化导致了一氧化氮(NO)的形成，它同时也引发了神经毒性。用一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂处理或在生物体外进行nNOS的靶向基因破坏可防止NMDA神经毒性。
PARP抑制剂的另一用途是治疗末稍神经损伤，以及由此导致的病理疼痛综合症，即所公知的神经性疼痛，例如由一般坐骨神经的慢性狭窄损伤(CCI)引起的神经性疼痛和其中脊髓后角跨突触的改变所引起的神经性疼痛，其特征为出现细胞质与核质的色素过多(所谓的“深色”神经元)。
证据还显示出，PARP抑制剂可用于治疗炎性肠紊乱如结肠炎。
具体做法是，对大鼠管腔施用溶解于50％乙醇的庚烯三硝基苯磺酸而使其得结肠炎，然后使被治疗的大鼠接受3-氨基苯甲酰胺，这是一种特效PARP活性抑制剂。PARP活性的抑制减少了炎症反应并恢复末梢结肠的形态和能量状态。
进一步的证据显示，PARP抑制剂可用于关节炎。另外，PARP抑制剂似乎可用于糖尿病。已有证据显示，PARP抑制剂可用于治疗内毒素休克和败血性休克。
PARP抑制剂已被用于延长细胞的寿命和增殖能力，包括疾病如皮肤老化、阿耳兹海默氏症、动脉硬化、骨关节炎、骨质疏松症、肌肉营养不良、骨骼肌的退化性疾病包括复制衰老、与年龄相关的肌肉退化、免疫衰退、AIDS和其它免疫衰退疾病的治疗；并用于改变衰老细胞的基因表达。
也已知，PARP抑制剂，例如3-氨基苯甲酰胺，可影响例如由过氧化氢或离子化照射而引起的全面DNA修复。
PARP在修复DNA链断裂方面所起到的关键作用已被充分确立，特别是离子化照射所引起直接链断裂，或间接地在受到甲基化剂、拓扑异构酶I抑制剂和其它化学治疗剂(如顺氯氨铂和博来霉素)作用所引起的DNA损伤的酶修复。许多使用“基因剔除”小鼠、反式显性抑制模式(DNA-结合结构域的过度表达)、反义和小分子量抑制剂的研究已经证明，PARP在修复及诱导DAN损伤后细胞的存活方面起到作用。PARP酶活性的抑制将导致肿瘤细胞对DNA损伤治疗的敏感性的增强。
已有报道说，PARP抑制剂对肿瘤细胞的放射增敏(缺氧)有影响，同时可防止放射治疗后肿瘤细胞从潜在的致死和亚致死DNA损伤中恢复过来，推测机理为，PARP抑制剂具有防止DNA链断裂再连接的能力，同时可以破坏一些DAN损伤信号通道。
PARP抑制剂已被用于治疗癌症。另外，美国专利5,177,075讨论一些异喹啉，它们能增强离子放射或化疗制剂对肿瘤细胞的致死效果。Weltin等人的“Effect of 6(5-Phenanthridione)，an Inhibitor of Poly(ADP-ribose)Polymerase，on Cultured Tumor Cells”，Oncol.Res.，69，399-403(1994)，讨论了PARP活性的抑制，肿瘤细胞繁殖能力的降低，以及用烷基化剂共同治疗肿瘤细胞时显著的协同效果。
Li和Zhang在Idrugs 2001，4(7)804-812，Ame等人在Bioassays2004，26882-883和Nguewa等人在Progress in Biophysic & MolecularBiology 2005，88143-172公开了对本领域技术现状的综述。
对有效和强力的PARP抑制剂一直都有需求，特别是对产生副作用最小的PARP-1抑制剂更是需求强烈。本发明提供了抑制PARP活性的化合物、组合物和方法，用于治疗癌症和/或防止由于例如坏死或自我凋亡而造成细胞受损或死亡所导致的细胞、组织和/或器官的损伤。本发明化合物和组合物特别有利于增强化疗和放疗的效力，其主要治疗作用是致使靶向细胞的DNA损伤。
1967年3月22日出版的GB 1062357披露了具有抗高血压作用的喹唑酮衍生物。
1973年6月20日出版的DE 20,1973披露了具有抗高血压作用的取代的吡啶酮衍生物。
1983年11月11日出版的EP 13612披露了取代哌啶基烷基喹唑啉衍生物。所述化合物为血清胺拮抗剂。特别是该发明所公开的第63号化合物。
1994年6月9日出版的EP 669919披露了作为5-HT3拮抗剂的二甲基苯并呋喃和二甲基苯并吡喃。
1994年12月20日出版的US 5374637披露了苯甲酰胺衍生物。所披露的化合物具有刺激胃肠蠕动的特性。
1998年12月23日出版的EP 885190披露了具有提高胃动力特性的1，4-二取代哌啶衍生物。
1999年6月12日出版的EP 1036073披露了取代的喹唑啉二酮衍生物。所述化合物具有缓解胃底的特性。
2002年6月20日出版的EP 1355888披露了作为PARP抑制剂的喹唑啉酮衍生物。

发明内容
本发明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、药用可接受加成盐及其立体化学异构形式，其中，虚线代表任选键；X为＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或当X为＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)二价自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羟基；R1是氢、卤素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；
R3是氢或C1-6烷氧基；Z是选自下列的自由基 其中每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或者R7和R8一起可形成下式的二价自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每个R9独立地选自氢或C1-6烷基；且L是一个选自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二价自由基；或当X是＞CR2-或当Z是式(b-11)的自由基时，L可以直接是一个键；其限定性条件是当X是＞CH-，-NY-是-N-C(O)-时，第二条虚线不是一个键，Z是式(b-2)的一个自由基且L是-C(O)-，则-C1-6烷二基-不是-CH2-CH2-。
式(I)化合物也可按其互变异构的形式存在。这些类型虽未明确地列示于上述化学式中，但也属于本发明的范围内。
此前及此后定义中所使用的大量术语将在以后的内容中解释。这些术语有时被单独使用，有时以组合术语的方式被使用。
此前及此后所定义中，卤素一般指氟、氯、溴和碘；C1-6烷基指含有1到6个碳原子的直链和支链的饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、2-甲基-丁基、2-甲基戊基等；C1-6烷二基指含有1到6个碳原子的二价直链和支链的饱和烃基，例如亚甲基、1，2-乙二基、1，3-丙二基、1，4-丁二基、1，5-戊二基、1，6-己二基以及它们的支链异构体，例如2-甲基戊二基、3-甲基戊二基、2，2-二甲基丁二基、2，3-二甲基丁二基等。
“药用可接受盐”意指药学上可接受的酸或碱加成盐。上述药用可接受的酸或碱加成盐是指可由式(I)化合物形成的、具有治疗活性的无毒酸和无毒碱加成盐形式。具有碱性性质的式(I)化合物，用合适的酸处理后可转化为药用可接受的酸加成盐。合适的酸包括，例如无机酸类如氢卤酸，如氢氯酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸类；或有机酸类例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸(环己烷基氨基磺酸)、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸等酸类。
具有酸性性质的式(I)化合物，用合适的有机或无机碱处理后可转化为药用可接受的碱加成盐。合适的碱盐包括，例如铵盐、碱金属和碱土金属盐类如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱形成的盐如苄星、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明盐类以及与氨基酸如精氨酸、离氨酸等形成的盐类。
术语“酸或碱加成盐”也包括可由式(I)化合物形成的水合物和溶剂合物形式的加成盐。此种形式的实例有水合物、醇合物等。
前面所用到的“式(I)化合物的立体化学异构形式”是指式(I)化合物所拥有的所有可能的化合物，他们由相同的键合原子按照相同的顺序连接而成，但具有不可互变的三维立体结构。除非另外提及或指明，否则一个化合物的化学名称涵盖了所述化合物可能拥有的所有可能的立体化学异构体的混合物。所述混合物包含了所述化合物基本分子结构的所有非对映异构体和/或对映异构体的。式(I)化合物的所有立体化学异构形式，无论是纯态还是彼此的混合物，都包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式是指式(I)化合物上的一个或几个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物，特别是指那些其中哌啶或哌嗪上的一个或多个氮被氧化的N-氧化物。
以后无论何时用到术语“式(I)化合物”，意指还包括其N-氧化物形式、药用可接受的酸或碱加成盐和所有的立体异构形式。
GB 1062357披露了具有抗高血压作用的喹唑酮衍生物。DE2258561披露了具有抗高血压作用的取代吡啶酮衍生物。EP 13612披露了做为血清胺拮抗剂的取代哌啶基烷基喹唑啉衍生物。EP 669919披露了作为5-HT3拮抗剂的二甲基苯并呋喃和二甲基苯并吡喃。US5374637披露了具有刺激肠胃蠕动特性的苯甲酰胺衍生物。EP 885190披露了具有提高胃动力特性的1，4-二取代哌啶衍生物。EP 1036073披露了具有缓解胃底特性的取代喹唑啉二酮衍生物。EP 1355888披露了作为PRAP抑制剂的喹唑啉酮衍生物。
令人意外的是本发明化合物也具有抑制PRAP的功能。
第一组令人感兴趣的化合物包括满足以下一项或多项限制条件的那些式(I)化合物a)X为＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；b)当X为＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)二价自由基；c)-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羟基且第二条虚线是一个键；d)R1是卤素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；e)R3是C1-6烷氧基；f)Z是一个选自(b-1)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)、(b-8)、(b-9)、(b-11)、(b-11)的自由基；g)每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；h)L是一个选自-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二价自由基；
第二组令人感兴趣的化合物包括满足以下一项或多项限制条件的那些式(I)的化合物a)X为＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；b)当X为＞CR2-时，R2则与-L-Z一起可形成式(a-1)二价自由基；c)R1是氢；d)R3是氢；e)Z是式(b-1)、(b-2)或(b-11)自由基；f)每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；g)L是一个选自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的二价自由基；且，h)当X为＞CR2-或当Z是式(b-11)的自由基时，L可以直接是一个键。
第三组令人感兴趣的化合物包括满足以下一项或多项限制条件的那些式(I)的化合物a)X为＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；；b)R1是氢；c)R3是氢；d)Z是式(b-1)或(b-2)自由基；e)每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；f)L是一个选自-C(O)-或-C(O)-NH-的二价自由基；且，g)当X为＞CR2-时，L可以直接是一个键。
优选的式(I)化合物组为，其中X为＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；当X为＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)二价自由基；R1是氢；R3是氢；Z是式(b-1)、(b-2)或(b-11)自由基；每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；L是一个选自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的二价自由基；且当X为＞CR2-或Z是式(b-11)自由基时，L可以直接是一个键。
优选的式(I)化合物组为，其中X为＞N-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；R1是氢；R3是氢；Z是式(b-1)或(b-2)自由基；每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；L是一个选自-C(O)-、或-C(O)-NH-的二价自由基；且当X为＞CR2-，L可以直接是一个键。
最优选的化合物是编号为No.4、No.5、No.11、No.12和No.14的化合物。
化合物4 化合物5 化合物11化合物12 化合物14可依据EP 13612所描述的一般方法来制备式(I)化合物。起始原料和一些中间体都是已知的化合物并可购买到，或者依据本领域通晓的惯用反应工艺来制备。
一些制备方法将在下文中详细描述。获得最终式(I)化合物的其它方法将在实施例中描述。
其中-NY-是-N-C(O)-且第二条虚线是一个键的式(I)化合物，此处指式(I-a)化合物，可按照本领域公知的环化工艺，对适当的式(II)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺进行环化而制得。
或者，其中C1-6烷二基-是-CH2-CH2-和-NY-是-N-C(O)-且第二条虚线是一个键的式(I)的化合物，此处指式(I-b)化合物，可按照本领域公知的环化工艺，用式(III)中间体对适当的式(IV)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺进行环化而制得。
其中-NY-是-N-C(O)-且第二条虚线不是一个键的式(I)的化合物，此处指式(I-c)的化合物，可按照本领域公知的环化工艺，用适当的式(VI)所示的取代中间体对适当的式(V)所示的取代2-胺基苯甲酰胺进行环化而制得。在合适溶剂如醇类(甲醇、乙醇、丙醇等)的存在下，将各种反应物放在一起搅拌即可方便地实施所述的环化反应。略微提高温度和加入一种合适的催化量的强酸如盐酸等，可提高反应速度。

通过本领域已知的反应或官能团转移，式(I)化合物也可彼此转化。部分这类转化已在前面描述过。其他的实例有羧酸酯水解成相应的羧酸或醇；酰胺水解成相应的羧酸或胺；腈水解成相应的酰胺；通过本领域已知的重氮化反应以及随后用氢置换重氮基团，可使咪唑或苯基上的氨基被氢取代；醇可以转化为酯和醚；伯胺可以转化为仲胺或叔胺；双键可以被氢化后变成相应的单键；在合适的钯催化剂存在下，通过插入一氧化碳可将苯基上的碘代自由基转化成酯基。
本发明还涉及将上述所定义的式(I)化合物作为医药品来使用。
从下面的实例中，可看到本发明化合物具有PARP抑制作用。
此处所用的术语“PARP”意指一种具有聚-ADP-核糖化活性的蛋白质。在此术语的涵义中，PARP涵盖了所有由parp基因编码的蛋白质、其变种及其片段被替换的蛋白质。另外，此处所用的术语“PARP”包括PARP的同系物、同族体以及其他动物的PARP同系物。
术语“PARP”包括但并不仅限于PARP-1。在此术语的定义中，也涵盖了PARP-2、PARP-3、Vault-PARP(PARP-4)、PARP-7(TiPARP)、PARP-8、PARP-9(Bal)、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-13、PARP-14、PARP-15、TANK-I、TANK-2和TANK-3。
能够同时抑制PARP-1和端锚聚合酶-2的化合物更有利于增强对癌细胞生长活性的抑制。
本发明还打算将所述化合物用于制备治疗动物体疾病和功能紊乱的药品，其中所述化合物为式(I)化合物。
它的N-氧化物形式、药用可接受的加成盐及其立体化学异构形式，其中，虚线代表任选的键；X为＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或当X为＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)二价自由基
-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羟基；R1是氢、卤素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氢或C1-6烷氧基；Z是选自下列基团的自由基 其中每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤基、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或，R7和R8一起可形成下式的二价自由基。
-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)
其中每个R9独立地选自氢或C1-6烷基；和L是一个选自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的二价自由基；或当X是＞CR2或当Z是式(b-11)自由基时，L可以直接是一个键。
鉴于本发明化合物的PARP结合特性，可将其用作参照化合物或示踪化合物，此时分子上的一个原子可以被例如放射性同位素所取代。
为了制备本发明的药用组成物，将有效剂量的一种作为活性组分的特定化合物，按照碱或酸加成盐的形式，与一种药用可接受的载体密切混合，根据预期的用药方式和制备形式，可采用多种形式的载体。将这些药用组成物制成人们愿意接受的的单位剂量形式，优选适合于口服、直肠投药、皮下或非肠道注射的形式。例如，制备口服剂型的组成物时，任何常用的药物媒介都可使用，如制备悬浮液、糖浆、药酒和溶液时，可使用水、乙二醇、油、醇等；或在制备粉剂、丸粒、胶囊和片剂时，可选用淀粉、糖、高领土、润滑剂、粘结剂和消散剂等做固态载体。由于胶囊和片剂使用简便，是最好的口服剂型，此时显然优选使用固态药用载体。对于肠胃外给药的组成物，载体通常包括无菌水，虽然也可以加入其他成分，例如助溶剂，但无菌水仍占大部分。可制备注射溶液，此时载体可包括，例如盐溶液、葡萄糖溶液或盐与葡萄糖的混合溶液。通过选用合适的液体载体、悬浮液等也可制备成可注射的悬浮液。在适合于皮下给药的组合物中，载体任选包括渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选混有少量合适的天然添加剂，这些添加剂不会对皮肤造成严重的伤害。所述的添加剂有助于皮肤给药和/或便于制成所需的组成物。这些组成物可以按各种方式给药，例如，做成膏药、喷剂、药膏。特别有利的是，将前述药物组成物配制成方便用药的剂量单位型式和统一用药的剂量型式。在说明书和权利要求中所用的剂量单位型式指的是适于单独使用、呈物理分离状态的药剂单位，每个单位的药剂中包含预定量的活性组分，该预定量是依据与所需的药物载体一起达到所要的治疗效果来计算的。单位剂量型式的实例有片剂(刻痕片或糖衣片)、胶囊、丸剂、粉剂药包、干胶片、可注射溶液剂或悬浮剂、一茶匙、一汤匙等，以及它们单独剂型的若干份。
本发明化合物可以治疗或预防由细胞受损或死亡而引起的组织损伤，这些细胞受损或死亡是由坏死或自我凋亡造成的；可以改善神经或心血管的组织损伤，包括病灶缺血、心肌梗塞及再灌注后造成的损伤；可治疗由PARP活性所引起或加剧的多种疾病与病况；可延长或增加细胞的寿命或繁殖能力；可改变衰老细胞的基因表达；可提高细胞放疗和/或化疗的敏感性；通常，PARP活性的抑制减少了细胞的能量损失，对于神经细胞来说，可防止神经元发生不可逆的去极化作用，从而对神经提供保护作用。
基于前述原因，本发明进一步涉及使用足以抑制PARP活性的治疗有效量的上述所定义的化合物，来治疗或预防由于坏死和自我凋亡造成细胞受损或死亡而导致的组织损伤，不以NMDA毒性为媒介来影响神经细胞的活性，以NMDA毒性为媒介来影响神经细胞的活性，治疗由于缺血和再灌注伤害所造成的神经组织损伤、神经失常和神经退化性疾病；治疗或预防血管栓塞；来治疗或预防心血管疾病；治疗其他病况和/或紊乱，例如，与年纪有关的肌肉退化，AIDS和其他免疫衰老疾病、炎症、风湿病、关节炎、动脉硬化、恶疾、癌症、涉及复制衰老的骨骼肌肉退化症，糖尿病、脑损伤、炎性肠炎(例如，结肠炎和节段性回肠炎)、肌肉萎缩、骨关节炎、骨质疏松症、慢性和/或急性疼痛(例如神经痛)、肾衰竭、视网膜局部缺血、败血性休克(例如内毒素休克)和皮肤老化；延长细胞的寿命或或增加其繁殖能力；改变衰老细胞的基因表达，增加肿瘤细胞对化疗和/或放疗(组织缺氧)的敏感性。本发明还涉及动物体疾病和症状的治疗，包括对所述的动物体施加治疗有效量的上述所定义的化合物。
特别地，本发明涉及一种治疗、预防或抑制动物体神经性疾病的方法，包括对所述的动物体施加治疗有效量的上述所定义的化合物。神经性疾病选自下列一组疾病，包括因物理伤害或疾病症状而引起的末梢神经病变、创伤性脑损伤、脊髓的物理伤害、与脑损伤相关的中风、病灶性局部缺血、总体性局部缺血、再灌注损伤、髓鞘脱失疾病和由于神经退化而引起的神经性疾病。
本发明还打算使用式(I)的化合物来抑制PARP活性，治疗、预防或抑制由于坏死和自我凋亡造成细胞受损或死亡而导致的组织损伤，治疗、预防或抑制动物身上的神经性疾病。
术语“预防神经退化”包括新近被诊断出患有神经退化疾病的患者、或有危险发展成为新的神经退化疾病的患者有能力去预防神经退化，以及已患有或已出现神经退化病症状的患者有能力去预防神经退化病情的恶化。
此处所用的术语“治疗”涵盖了对动物、特别是人类疾病和/或病况进行的任何治疗，并包括(i)对于尚未诊断出具有疾病，但有倾向发生疾病和/或病况的对象进行疾病和/或病况的预防；(ii)抑制疾病和/或病况，即制止它的发展；(iii)减轻疾病和/或病况，即从疾病和/或病况中复原。
此处所用的术语“放射致敏剂”指一种分子，优选低分子量分子，经对动物施用治疗有效量的该物质，来增加细胞对离子辐射的敏感性和/或促进对可用离子辐射治疗的疾病的治疗效果。可用离子辐射治疗的疾病包括赘生瘤疾病、良性的和恶性的肿瘤以及癌细胞。其它未在此列出的可用离子辐射治疗的疾病，也在本发明的涵盖范围之内。
此处所用的术语“化学致敏剂”指一种分子，优选低分子量分子，经对动物施用治疗有效量的该物质，来增加细胞对化疗的敏感性和/或促进对可用化疗治疗的疾病的治疗效果。可用化疗治疗的疾病包括赘生瘤疾病、良性的和恶性的肿瘤以及癌细胞。其它未在此列出的可用离子辐射治疗的疾病，也在本发明的涵盖范围之内。
本发明的化合物、组成物和方法，特别适用于治疗或预防抑制由细胞受损或死亡而引起的组织损伤，这些细胞的受损或死亡是由于坏疽或自我凋亡而发生的。
本发明的化合物可以是“抗癌剂”，该术语也涵盖了“抗肿瘤细胞生长剂”和“抗赘生瘤剂”。例如，本发明的方法可用于治疗癌症和癌症中对放疗和/或化疗敏感的肿瘤细胞，如，ACTH-引起的肿瘤、急性淋巴性血癌、急性非淋巴性血癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、颈部的癌症、慢性淋巴癌、慢性髓母细胞血癌、直肠癌、皮下T-细胞淋巴癌、子宫内膜癌、食道癌、Ewing’s肉瘤胆囊癌、发细胞血癌、头&颈癌、Hodgkin’s淋巴瘤、Kaposi’s肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌(小型和/或非小型细胞)、恶性腹腔腹水、恶性胸腔腹水、黑色素瘤、中皮层瘤、多重骨髓瘤、神经母细胞瘤、非Hodgkin’s淋巴瘤、骨癌、卵巢癌、卵(精)细胞癌、前列腺癌、胰脏癌、阴茎癌、视网膜细胞瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、滋养性赘生癌、子宫癌、阴道癌、会阴癌和Wilm’s肿瘤。
因此，本发明的化合物可以用作“放疗致敏剂”和/或“化疗致敏剂”。
如人们所知，放疗致敏剂可提高癌细胞对离子照射毒性作用的敏感性。有关放疗致敏剂作用模式的一些机理已在以下文献中提及，包括缺氧性细胞放疗致敏剂(如2-硝基咪唑化合物和二氧化苯并三嗪物化合物)可在缺氧环境下，模仿氧或行为表现得像生物还原剂；非缺氧性细胞放疗致敏剂(如卤代嘧啶类)可作为DNA碱基的类似物并可优先结合到癌细胞的DNA上，从而促进DNA分子的放射-诱发断裂和/或抑制正常的DNA修复机制；以及其它各种关于放疗致敏剂治病潜在机理的假设。
目前，许多癌症治疗方案都将放疗致敏剂与X射线照射相结合。能活化X射线的放疗致敏剂的实例包括但并不限于以下物质灭滴灵、米索硝唑(misonidazole)、desmethylmisonidazole、哌迷清(pimondazole)、依他硝唑(etanidazole)、硝咪吗啉(nimorazole)、丝裂霉素C、RUS 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴去氧尿苷(BUdR)、5-碘去氧尿苷(IUdR)、溴去氧胞苷、氟去氧尿苷(FudR)、羟基尿素、顺氯胺铂，及其具有治疗效果的类似物和衍生物。
癌症的光动力治疗(PDT)使用可见光作为致敏剂的放射活化剂。光动力学放疗致敏剂的实例包括但并不限于以下物质血卟啉衍生物、光敏素(Photofrin)、苯并卟啉衍生物、初卟啉合锡盐(tinetioporphyrin)、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁、酞菁、锌酞菁，及其具有治疗效果的类似物和衍生物。
放疗致敏剂可与治疗有效量的一种或多种其他化合物一起使用，包括但并不限于以下物质可促进放疗致敏剂与目标细胞结合的化合物；能控制治疗剂、营养液和/或氧气朝目标细胞流动的化合物；无论有无其他照射都能作用于肿瘤的化学治疗剂；或其他能有效治疗癌症或其他疾病的化合物。可与放疗致敏剂一起使用的其它治疗剂的实例包括但并不限于以下物质5-氟尿嘧啶、亚叶酸、5’-氨基-5’去氧胸苷、氧气、碳氧混合气、输血、全氟烃(如Fluosol 10 DA)、2，3-DPG、BW12C、钙通道阻断剂、己酮可可碱(pentoxyfylline)、抗脉管形成化合物、胼酞嗪和LBSO。可与放疗致敏剂一起使用的化学治疗剂的实例包括但并不限于以下物质阿霉素、喜树碱、卡铂、顺氯氨铂、道诺霉素、多烯紫衫醇、亚德里亚霉素、干扰素(α、β、γ)、白细胞介素2、依立替康(irinotecan)、紫杉醇、罗卡，及其具有治疗效果的类似物和衍生物。
化疗致敏剂可与治疗有效量的一种或多种其他化合物一起使用，包括但并不限于以下化合物可促进化疗致敏剂与目标细胞结合的化合物；能控制治疗剂、营养液和/或氧气朝目标细胞流动的化合物；能作用于肿瘤的化学治疗剂或其他能有效治疗癌症或其他疾病的化合物。可与化疗致敏剂一起使用的其它治疗剂的实例包括但并不限于以下物质甲基化剂、拓扑异构酶I抑制剂和其它化疗剂，如顺氯氨铂和博来霉素。
式(I)化合物也可用来检测和识别PARP，特别是PARP-1受体。在做此目的使用时，可对式(I)化合物进行标记。所述的标记可选自放射性同位素、自旋标记物、抗原标记物、酶标记物、荧光基团或化学冷光基团。
本领域技术人员可以从下面所列示的实验结果中非常容易地确定出有效量。通常建议的有效量为0.001-100毫克/公斤体重，优选0.005-10毫克/公斤体重。可将一天所需的剂量适当地分成二、三、四或更多的小份，在适当的时间间隔下使用。所述的小份可制成单位药剂型式，例如，每单位剂量含活性成分0.05-500毫克，优选0.1-200毫克。
实验部分下文中，“DCM”代表二氯甲烷、“DMF”代表N，N-二甲基甲酰胺、“MeOH”代表甲醇、“MIK”代表甲基异丁基酮、“MEK”代表甲基乙基酮、“TEA”代表三乙胺和“THF”代表四氢呋喃。
A.中间体化合物的制备实施例A1中间体1的制备
将溶于乙氰(150ml)中的2-[(4-氯-1-氧代丁基)氨基]-苯甲酰胺(0.03mol)、4-苯基-4-哌啶羧胺(0.03mol)和TEA(0.1mol)混合物搅拌并回流过夜，蒸发掉溶剂后，在残留物中加入水。用三氯甲烷萃取油层，干燥，过滤并蒸发除去溶剂。用装在玻璃过滤器里的硅胶来提纯残留物(洗提液三氯甲烷/MeOH 95/5)。收集产品级分并蒸除溶剂，得到5g(40.8％)中间体1。
实施例A2中间体6的制备 将溶于4-甲基-2-戊酮(250ml)的4-氯-1，1-二乙氧基-丁烷(0.05mol)、4-苯基-4-哌啶羧胺(0.03mol)、碳酸钠(0.05mol)和碘化钾(q.s.)混合物搅拌并回流过夜，冷却反应混合物，加水、分层。经干燥有机层、过滤和蒸除溶剂，得到9g(86％)的中间体6。
B.最终化合物的制备实施例B1化合物3的制备 将溶于2-丙醇(150ml)的2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-苯甲酰胺(0.02mol)、1-(4-氟苯基)-2-(4-哌啶基)-乙酮(0.02mol)和碳酸氢钠(4g)混合物搅拌并回流过夜，趁热将反应混合物过滤并蒸除溶剂。残留物经柱色谱法在硅胶上提纯两次(洗提液三氯甲烷/MeOH95/5)，收集产品级分并蒸除溶剂。残留物在2-丙醇中再结晶，收集所得沉淀，得到2g(25％)的化合物3，熔点为159.1℃。
实施例B2化合物4的制备 将中间体1(0.012mol)溶于氢氧化钠(60ml)和乙醇(100ml)，搅拌形成的混合物并回流1.5小时，然后蒸发除去溶剂并向残留物中加入水。用三氯甲烷萃取油层，干燥，过滤并蒸发除去溶剂。残留物在MIK/2-丙醇中再结晶，收集所要的产物并干燥，得到2g(41.7％)的化合物4，熔点为138.9℃。
实施例B3化合物5的制备
将溶于乙醇(100ml)的2-氨基-苯甲酰胺(0.027mol)与中间体6(0.027mol)的混合物加热，并用化学纯盐酸(3ml)对混合物进行酸化。搅拌反应混合物并回流过夜，然后蒸发除去溶剂，向残留物中加入水和浓NH4OH溶液。过滤得到沉淀物再溶解于三氯甲烷，然后干燥、过滤。蒸发除去溶剂后，将残留物在MeOH中再结晶，收集所得沉淀并干燥，得到3g(28％)的化合物5，熔点为216.1℃。
表F-1列出了按照上述实施例方法之一所制备的化合物。
药用实施例用邻近闪烁分析法(SPA)测定生物体外PARP-1抑制活性按照SPA技术(归Amersham Pharmacia Biotech所有)，在生物体外测试本发明化合物。
原则上，本试验依靠已充分建立起来的SPA技术来检测生物素化的标靶蛋白质(即组织蛋白)上的聚(ADP-核糖基)化。用被PARP-1酶和[3H]-烟酰胺腺苷二核苷酸([3H]-NAD+)活化的带切口DNA作为ADP-核糖基供体来诱导该核糖化反应。
制备带切口DNA，作为诱发PARP-1酶活性的诱导体。为此，将25mg的DNA(提供者Sigma)溶解于25ml DNAse缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 7.4；0.5mg/ml的牛血清蛋白(BSA)；5mM MgCl2·6H2O和1mM KCl)中，加入50μl的DNAse溶液(在0.15M NaCl中的浓度为1mg/ml)。在37℃下培育90分钟后，加入1.45g的NaCl中止反应，接着在58℃下再培育15分钟。将反应混合物在冰浴上冷却，并在4℃用0.2M的KCl 1.5L分别透析1.5小时和2小时，并接着用0.01M的KCl 1.5L分别透析1.5小时和2小时两次将混合物分份并在-20℃下储藏。用Amersham的生物素化反应套组将组织蛋白(1mg/ml，II-A型，提供者Sigma)生物素化并分份、储藏在-20℃下。在PBS中制备100mg/ml SPA聚(乙烯基甲苯)(PVT)珠粒(提供者Amersham)储藏液。向6ml培育缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mM MgCl2)中加入120μl的[3H]-NAD+(0.1mCi/ml，提供者NEN)制成[3H]-NAD+储藏液。在培育缓冲液(取自储藏在-20℃下、水中的100mM储藏液)中制备4mM NAD+(提供者Roche)的溶液。用本领域已知的技术制备PARP-1酶，即从人类肝脏cDNA开始进行无性繁殖和蛋白质表达。有关使用的PARP-1酶的蛋白质序列的相关信息，包括参考文献，可自Swiss-Prot的资料库中，按照主要登录号P09874查到。将生物素化的组织蛋白和PVT-SPA珠粒混合，并在室温下预先培育30分钟。将PARP-1酶(浓度依批次而定)与带切口的DNA混合，并将混合物在4℃下预先培育30分钟。将等份量的此种组织蛋白/PVT-SPA珠粒溶液与PARP-1酶/DNA溶液混合，并将75μl的此混合物与1μl溶于DMSO的本发明化合物和25μl的[3H]-NAD+一起加入到96槽微滴定板上的每个槽中。培育混合物中各种成分的最终浓度为生物素化的组织蛋白的浓度为2μg/ml、PVT-SPA珠粒的浓度为2mg/ml、带切口DNA的浓度为2μg/ml和PARP-1酶的浓度为5～10μg/ml。在室温下将混合物培养15分钟后，向培养缓冲液(最终浓度为2mM)中加入100μl的4mM NAD+来中止反应并将板子混合。
让珠粒至少沉降15分钟后，将板子移至ToppCountNXTTM(Packard)进行闪烁计数，所得数值以每分钟闪烁次数(cpm)表示。对于每个实验，平行测试对照组(含PARP-1酶和DMSO，不含化合物)、空白培养液(含DMSO，不含PARP-1酶和化合物)和样品组(含PARP-1酶和溶于DMSO的化合物)。所有测试的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO进一步稀释。在第一个实例中，化合物在10-5M的浓度下进行测试。当化合物在10-5M显示出活性时，在化合物测试浓度范围10-5-10-8M之间绘制剂量-响应曲线。在每一次测试时，都从对照组和样品组的测试值中减去空白样的测试值。对照样品代表最大的PARP-1酶活性。对各样品，其cpm量用相对于对照样平均cpm值的百分数来表示。适当地，在实验点的上下50％，使用线性内插法可用电脑计算出IC50值(药品浓度，用来将PARP-1酶的活性减少到对比样的50％)。此处，测试化合物的效果用pIC50(IC50值的负对数值)来表示。作为参比化合物，4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺也用来验证SPA实验。所测试的化合物在起始实验浓度为10-5M下，表现出抑制活性(见表-2)。
用过滤分析来测定生物体外PARP-1抑制活性用[32P]-NAD作为ADP-核糖基供体，通过其组织蛋白的聚(ADP-核糖基)化活性，在生物体外进行过滤实验来测试本发明化合物，评价PARP-1的活性(在带切口DNA的存在下触发)。用三氯乙酸(TCA)将具有放射活性的核糖化组织蛋白沉淀在9696槽微滴定板上，用闪烁计数器测量加入的[32P]。
将组织蛋白(储备液H2O中浓度5mg/ml)、NAD+(储备液H2O中浓度100mM)和溶于培育缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mM MgCl2)的[32P]-NAD+制成混合物。同时制备PARP-1酶(5～10μg/ml)与带切口DNA的混合物。按照SPA法测定生物体外PARP-1抑制活性中所描述的方法制备带切口的DNA。将75μl的PARP-1酶/DNA混合物，与1μl溶于DMSO的本发明化合物和25μl的组织蛋白-NAD+/[32P]-NAD+混合物一起，加入到96槽过滤板(0.45μm，提供者Millipore)的每一个槽中。培养混合物中组织蛋白的最终浓度为2μg/ml，NAD+的最终浓度为0.1mM，[32P]-NAD+的最终浓度为200μM(0.5μC)和带切口DNA的最终浓度为2μg/ml。在室温下培育板子15分钟，先加入10μl冰冷的100％TCA中止反应，再加入10μl冰冷的BSA溶液(水中浓度1％)。在4℃下放置10分钟让蛋白质级分沉淀，然后对板子进行抽真空过滤。在室温下，对板子的每一个槽依次用1ml 10％的冰冷TCA、1ml 5％的冰冷TCA和1ml 5％的TCA洗涤。最后在每一个槽中加入100μl闪烁溶液(Microscint 40，Packard)，将板子移至TopCountNXTTM(Packard)进行闪烁计数，所得数值以每分钟闪烁次数(cpm)表示。对于每个实验，平行测试对照组(含PARP-1酶和DMSO，不含化合物)、空白培养液(含DMSO，不含PARP-1酶和化合物)和样品组(含PARP-1酶和溶于DMSO的化合物)。所有测试的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO进一步稀释。在第一个实例中，化合物在10-5M的浓度下进行测试。当化合物在10-5M显示出活性时，在化合物测试浓度范围10-5-10-8M之间绘制剂量-响应曲线。在每一次测试时，都从对照组和样品组的测试值中减去空白样的测试值。对照样品代表最大的PARP-1酶活性。对各样品，其cpm量用相对于对照样平均cpm值的百分数来表示。适当地，在实验点的上下50％，使用线性内插法可用电脑计算出IC50值(药品浓度，用来将PARP-1酶的活性减少到对比样的50％)。此处，测试化合物的效果用pIC50(IC50值的负对数值)来表示。作为参比化合物，4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺也用来验证SPA实验。所测试的化合物在起始实验浓度为10-5M下，表现出抑制活性(见表-2)。
用邻近闪烁分析法(SPA)测定生物体外TANK-2抑制活性用Ni Flash板子(96或384槽)，按照SPA技术(归AmershamPharmacia Biotech所有)来测试本发明化合物。
原则上，本试验依靠SPA技术，用[3H]-烟酰胺腺苷二核苷酸([3H]-NAD+)作ADP-核糖基供体来检测TANK-2蛋白质的自-聚(ADP-核糖基)化作用。
-NAD+/NAD储藏液的制备将64.6μl的[3H]-NAD+(0.1mCi/ml，提供者Perkin Elmer)和46.7μl的NAD-储藏液(10.7mM，储藏在-20℃下，提供者Roche)加入到1888.7μl的分析缓冲液中(60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 7.4；0.9mM DTT，6mM MgCl2)。按照EP1238063中的方法生产TANK-2酶。96槽涂镍闪烁板(PerkinElmer)的每个槽中，加入60μl的分析缓冲液、1μl的溶于DMSO的化合物、20μl的[3H]-NAD+/NAD和20μl的TANK-2酶(最终浓度为6mg/ml)。在室温下培育120分钟后，加入60μl中止溶液(溶于6ml水的42.6mg的NAD)，在闪烁板上盖上封口板，并置于TopCountNXTTM(Packard)中进行闪烁计数，所得数值以每分钟闪烁次数(cpm)表示。对于每个实验，平行测试对照组(含TANK-2酶和DMSO，不含化合物)、空白培养液(含DMSO，不含TANK-2酶和化合物)和样品组(含TANK-2酶和溶于DMSO的化合物)。所有测试的化合物都溶解于DMSO，并最后用DMSO进一步稀释。在第一个实例中，化合物在10-5M的浓度下进行测试。当化合物在10-5M显示出活性时，在化合物测试浓度范围10-5-10-8M之间绘制剂量-响应曲线。在每一次测试时，都从对照组和样品组的测试值中减去空白样的测试值。对照样品代表最大的TANK-2酶活性。对各样品，其cpm量用相对于对照样平均cpm值的百分数来表示。适当地，在实验点的上下50％，使用线性内插法可用电脑计算出IC50值(药品浓度，用来将TANK-2酶的活性减少到对比样的50％)。作为参比化合物，3-氨基苯甲酰胺和4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺也用来验证SPA实验。此处所描述的分析是在96-槽板中进行的。在使用384-槽板的分析中，使用相同的最终浓度和容积。若96-槽板实验的结果有效，这些结果就合并在表-2中，否则，所列示的结果得自384-槽板实验。
表-2

通过分析细胞内的化学-和/或放射致敏性、分析测量癌细胞株中内源PARP-1活性的抑制作用、以及最终在生物体内进行的放射致敏性实验，都可对这些化合物进行进一步的评价。
权利要求
1.本发明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、药用可接受加成盐及其立体化学异构形式，其中，虚线代表任选键；X是＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或当X是＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)的一个二价自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羟基；R1是氢、卤素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氢或C1-6烷氧基；Z是选自下列的一个自由基 其中每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或R7和R8一起可形成下式的一个二价自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每个R9独立地选自氢或C1-6烷基；且L是选自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的一个二价自由基；或当X是＞CR2-或当Z是式(b-11)的一个自由基时，L可以直接是一个键；限定性条件是当X是＞CH-，-NY-是-N-C(O)-时，第二条虚线不是一个键，Z是式(b-2)的一个自由基且L是-C(O)-，则-C1-6烷二基-不是-CH2-CH2-。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X是＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；当X是＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)的一个二价自由基；R1是氢；R3是氢；Z是式(b-1)、(b-2)或(b-3)的一个自由基；每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；L是选自-C(O)-、-C(O)-NH-或-C(O)-C1-6烷二基-的一个二价自由基；且当X是＞CR2-或当Z是式(b-11)的一个自由基时，L可以直接是一个键。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中X是＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；R1是氢；R3是氢；Z是式(b-1)或(b-2)的一个自由基；每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢或卤素；L是选自-C(O)-或-C(O)-NH-的一个二价自由基且当X是＞CR2-时，L可以直接是一个键。
4.根据权利要求1、2和3所述的化合物，其中所述的化合物选自编号为No.4、No.5、No.11、No.12和No.14的化合物。 化合物4 化合物5 化合物11 化合物12 化合物14
5.权利要求1至4任一项所述的化合物作为药品的用途。
6.一种药物组合物，包括药用可接受载体和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1至5所述的化合物。
7.一种制备权利要求6所述的药物组合物的方法，其中将药用可接受载体与权利要求1至4所述的化合物密切混合。
8.化合物在制造用于治疗PARP媒介的疾病的药品时的用途，其中所述的化合物是式(I)化合物， 其N-氧化物形式、药用可接受加成盐及其立体化学异构形式，其中，虚线代表任选键；X是＞N-、＞CH-或＞CR2-，其中R2是氨基羰基；或当X是＞CR2-时，则R2与-L-Z一起可形成式(a-1)的一个二价自由基-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中，R10是苯基；-NY-是-N-C(O)-或-N＝CR4-，其中R4是羟基；R1是氢、卤素、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R3是氢或C1-6烷氧基；Z是选自下列的一个自由基 其中每个R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、氨基、C1-6烷基或C1-6烷氧基；或R7和R8一起可形成下式的一个二价自由基-CH2-CR92-O- (c-1)-(CH2)3-O- (c-2)-O-(CH2)2-O- (c-3)或-CH＝CH-CH＝CH- (c-4)其中，每个R9独立地选自氢或C1-6烷基；且L是选自-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-C1-6烷二基-或-C(O)-O-C1-6烷二基-的一个二价自由基；或当X是＞CR2-或当Z是式(b-11)的一个自由基时，L可以直接是一个键。
9.权利要求8所述的式(I)PARP抑制剂在制造治疗PARP-1媒介的疾病的药品时的用途。
10.根据权利要求8和9所述的用途，其中所述的治疗涉及化学致敏作用。
11.根据权利要求8和9所述的用途，其中所述的治疗涉及放射致敏作用。
12.一种由式(I)化合物与化疗药剂复配而成的组合物。
13.一种制备权利要求1所述化合物的方法，特征在于a)将适当的式(II)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺进行环化得到式(I-a)化合物，其中两二条虚线均可以是一个键， b)用式(III)中间体对适当的式(VI)所示的取代2-氨基羰基苯甲酰胺进行环化得到式(I-b)化合物，其中-C1-6烷二基-是-CH2-CH2-且两二条虚线均可以是一个键，或 c)用式(VI)中间体对适当的式(V)所示的取代2-氨基苯甲酰胺进行环化得到式(I-c)化合物，其中只有一条虚线可以是一个键。
全文摘要
本发明提供了式(I)化合物，其作为PARP抑制剂的用途以及含有所述式(I)化合物的药物组合物，其中，R
文档编号C07D401/06GK1976906SQ200580021337
公开日2007年6月6日 申请日期2005年6月28日 优先权日2004年6月30日
发明者M·J·M·范德阿, A·H·M·T·范赫尔图姆, J·A·J·范杜恩, M·V·F·索默斯, W·B·L·沃特斯 申请人:詹森药业有限公司