一种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 酪氨酸酶（TYR)是一种含铜酶，来源于胚胎神经鞘细胞，是黑色素代谢和儿茶酚 胺的关键酶。酪氨酸酶抑制剂可以抑制酪氨酸酶，可以有效抑制黑色素代谢和儿茶酚胺，因 此被大家所关注。在现有技术中，筛选酪氨酸酶抑制剂的主要试验包括：构建底物、酪氨酸 酶和酪氨酸酶抑制剂（或空白）的溶液体系，通过测试底物被酪氨酸酶氧化后产物的颜色 深浅或吸光度值的大小来判断抑制剂抑制作用的大小。
[0003] 而现有的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法中存在着以下几个方法的不足：
[0004] 1、目前商品化的酪氨酸酶只有蘑菇酪氨酸酶，而且价格昂贵，若自己提取和纯化 酪氨酸酶，步骤繁琐，费时费力；
[0005] 2、传统的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法是均相反应体系，测试完后，溶液只能丢弃， 酪氨酸酶没法重复利用，材料浪费严重；
[0006] 3、传统的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法中判断酪氨酸酶抑制剂的抑制机理（可逆 或不可逆过程）实验步骤繁琐，实验量大，而且结果并不直观。
【发明内容】
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种操作更简单方便的筛选酪氨酸酶抑制剂的 方法。
[0008] -种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、将洗净的含有酪氨酸酶的物料切碎，按质量比Ig : ImL的比例将切碎后的 所述物料加入至4°C预冷的pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液中；
[0010] 步骤二、将所述磷酸缓冲溶液匀浆处理，然后用双层500目的尼龙纱布过滤，收集 滤液得到酪氨酸酶的粗提液；
[0011] 步骤三、在96孔板的每孔中加入所述酪氨酸酶的粗提液，将96孔板放入4°C冰箱 中进行吸附，吸附的时间为30min-120min，弃去包被后96孔板中的溶液，然后用pH = 6. 8 的磷酸缓冲溶液清洗96孔板2遍，将96孔板甩干备用；
[0012] 步骤四、称取左旋多巴，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液将左旋多巴配制成底物溶液， 称取待筛选的酪氨酸酶抑制剂，用蒸馏水配制成抑制溶液；
[0013] 步骤五、取步骤三所得到的96孔板，在96孔板中标记出一号孔和二号孔，在一号 孔内加入50 μ 1的所述抑制溶液，在二号孔内加入缓冲液，静置l_5min后，分别在一号孔和 二号孔内加入所述底物溶液，在室温下反应10_60min ;
[0014] 步骤六、比较所述一号孔与二号孔内溶液的颜色深浅来判断曲酸对酪氨酸酶的抑 制效果。
[0015] 进一步的，所述步骤六中通过酶标仪测试475nm的吸光度值来比较一号孔与二号 孔内溶液的颜色深浅。
[0016] 进一步的，所述待筛选的酪氨酸酶抑制剂为曲酸。
[0017] 进一步的，在所述步骤六之后还包括：
[0018] 步骤七、弃去所述96孔板上的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗96孔板，甩 干后，在该96孔板上加入100 μ 1底物溶液，反应10min-60min后，于酶标仪中检测475nm 处的吸光度值；
[0019] 步骤八、重复步骤七5遍，比较每次反应所得到的溶液在酶标仪中检测475nm处的 吸光度值，得到酪氨酸酶重复利用时的活性。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明提供的另一实现式为：
[0021] -种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
[0022] 步骤一、将洗净的含有酪氨酸酶的物料切碎，按质量比Ig : ImL的比例将切碎后的 所述物料加入至4°C预冷的pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液中；
[0023] 步骤二、将所述磷酸缓冲溶液匀浆处理，然后用双层500目的尼龙纱布过滤，收集 滤液得到酪氨酸酶的粗提液；
[0024] 步骤三、在96孔板的每孔中加入所述酪氨酸酶的粗提液，将96孔板放入4°C冰箱 中进行吸附，吸附的时间为30min-120min，弃去包被后96孔板中的溶液，然后用pH = 6. 8 的磷酸缓冲溶液清洗96孔板2遍，将96孔板甩干备用；
[0025] 步骤四、称取左旋多巴，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液将左旋多巴配制成底物溶液， 称取酪氨酸酶抑制剂，用蒸馏水配制成抑制溶液；
[0026] 步骤五、取步骤三所得到的吸附有酪氨酸酶的96孔板，在96孔板中标记出一号孔 和二号孔，往所述96孔板内加入所述抑制溶液，往二号孔内加入缓冲液，反应5-10min ;
[0027] 步骤六、弃去一号孔和二号孔内的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗一号孔 和二号孔5遍，甩干后分别在一号孔内和二号孔内内加入底物溶液，静置l-5min，然后在一 号孔和二号孔内加入缓冲液，反应5-10min，比较一号孔和二号孔内溶液的颜色是否有差 异，若有，则说明所述酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制，若没有，则说明所 述酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制属于不可逆抑制。
[0028] 进一步的，所述酪氨酸酶抑制剂为曲酸或无水乙醇。
[0029] 进一步的，步骤六中是通过酶标仪记录475nm的吸光度值来判断所述96孔板内溶 液的颜色是否发生变化。
[0030] 本发明的有益效果为：区别于现有的酪氨酸酶筛选方法中，提取和纯化酪氨酸酶 的步骤繁琐，费时费力，本发明通过对酪氨酸酶粗提液进行蛋白吸附，得到较为纯净的固定 化的酪氨酸酶，大大简化了酪氨酸酶的提纯步骤，解决了传统纯化酪氨酸酶步骤繁琐，价格 高的不足的问题。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施方式一所得到的实验组与空白组的溶液颜色比对图片；
[0032] 图2为本发明实施方式二中以曲酸为抑制物得到的实验组与空白组的溶液颜色 比对图片；
[0033] 图3为本发明实施方式二中以乙醇为抑制物得到的实验组与空白组的溶液颜色 比对图片。
【具体实施方式】
[0034] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0035] 实施方式一
[0036] -种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
[0037] (1)取洗净的双孢蘑燕，切碎，按质量比Ig : ImL加入4°C预冷的pH = 6. 8的磷酸 缓冲溶液，匀浆处理（转速l〇〇〇〇r/min，2min)，双层500目的尼龙纱布过滤，收集滤液，得到 酪氨酸酶的粗提液；将酪氨酸酶的粗提液进行封装，每1ml装一管，于-20°C冷冻备用，一个 月内用完。
[0038] (2)取96孔板，每孔中加入上述酪氨酸酶粗提液100 μ 1，放入4°C冰箱中进行吸 附（所述吸附是指蛋白吸附），吸附的时间为30min-120min，然后取出，弃去96孔板中的溶 液，然后用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗所述96孔板2遍，甩干后备用。
[0039] (3)称取一定量的左旋多巴，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液配制成5mmol/L的底物 溶液，称取一定量的曲酸（为待筛选的酪氨酸酶抑制剂），用蒸馏水配制成IOOmmoVL的曲 酸溶液。
[0040] (4)在96孔板中加入50 μ 1曲酸溶液（实验组）和缓冲液（空白组），作用l-5min 后，再加入底物溶液100 μ 1，室温下反应10-60min，通过对比溶液颜色的深浅判断是否有 酪氨酸酶的抑制作用，或者用酶标仪测试475nm的吸光度值，比较吸光度值的大小，来判断 抑制作用的强弱。
[0041] 反应的结果数据如表一所示
[0042]
[0043] 表一
[0044] 如图1所示，实验组溶液未变色，而且吸光度值接近0,而空白组变色，吸光度值 0. 45,说明曲酸具有酪氨酸酶的抑制作用。
[0045] (5)测试结束后，可以弃去96孔板中的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗5 遍，甩干后重复利用。
[0046] 本实施方式还可以应用于除曲酸以外的其他制剂对酪氨酸酶活性的抑制效果。
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