7] 在本实施方式中，还可检测酪氨酸酶抑制剂重复利用的效果，具体步骤为：
[0048] 在所述步骤（4)之后，弃去所述96孔板上的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清 洗96孔板，甩干后，在该96孔板上加入100 μ 1底物溶液，反应10min-60min后，于酶标仪 中检测475nm处的吸光度值；
[0049] 步骤八、重复步骤七5遍，比较每次反应所得到的溶液在酶标仪中检测475nm处的 吸光度值，得到酪氨酸酶重复利用时的活性。
[0050] 请参阅表二、为步骤八所得到的酶标仪中检测475nm处的吸光度值；
[0051]
[0052] 表二
[0053] 在本实施方式中，检测酪氨酸酶抑制剂重复利用的效果时，还可以通过以下方式 实现：
[0054] 本实施方式还可以用于判断酪氨酸酶抑制剂的抑制机理，具有为：
[0055] 取上述步骤（2)所得到的吸附有酪氨酸酶的96孔板，加入100 μ 1底物溶液（实 验组，5个平行），反应10min-60min后，于酶标仪中检测475nm处的吸光度值。然后弃去溶 液，再用PH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗5遍，甩干后，重复之前的步骤。共重复5次，从表 二的数据可以说明重复使用6次，固定的酪氨酸酶仍然保持活性。
[0056] 在本实施方式中，酶的纯化变得简单方便，有利于对各种酶的性质研究，并且该方 法使得酪氨酸酶能够实现重复利用，提高筛选抑制剂的效率，并节约成本。
[0057] 在其他实施方式中，所述双孢蘑菇可以用土豆、苹果等含有酪氨酸酶的物质来替 换。
[0058] 实施方式二
[0059] 检测抑制剂对酪氨酸酶的抑制机理，包括步骤：
[0060] 取实施方式一步骤（2)所得到的吸附有酪氨酸酶的96孔板，加入100 μ 1曲酸溶 液即待检测的抑制剂（实验组，2个平行），反应5-10min后，弃去曲酸溶液，再用pH = 6. 8 的磷酸缓冲溶液清洗5遍，甩干后加入100 μ 1底物溶液；按照上述步骤，把曲酸溶液换成缓 冲液，作为空白对照。比较实验组和空白对照的颜色，吸光度值如果没有显著性差异说明曲 酸对酪氨酸酶的抑制是可逆的。请参阅图2和表三；
[0061]
[0062] 表三
[0063] 表三为实验组（曲酸）与对照组所得到的溶液在酶标仪测试475nm的吸光度值， 可见检测结果发现实验组溶液变色，和空白对照没有显著性差异，酪氨酸酶仍然具有活性， 说明曲酸对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制。
[0064] 在本实施方式中，可以将所述抑制剂换成无水乙醇，用于检测无水乙醇对酪氨酸 酶的抑制机理。请参阅表四和图3，
[0065]
[0066] 表四
[0067] 表三为实验组与对照组（乙醇）所得到的溶液在酶标仪测试475nm的吸光度值， 检测结果发现实验组溶液未变色，而空白对照变色，说明酪氨酸酶已失去活性，说明乙醇对 酪氨酸酶的抑制属于不可逆抑制。
[0068] 通过本实施方式能够直观地判断抑制剂的抑制机理。
[0069] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、将洗净的含有酪氨酸酶的物料切碎，按质量比Ig:lmL的比例将切碎后的所述 物料加入至4°C预冷的pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液中； 步骤二、将所述磷酸缓冲溶液匀浆处理，然后用双层500目的尼龙纱布过滤，收集滤液 得到酪氨酸酶的粗提液； 步骤三、在96孔板的每孔中加入所述酪氨酸酶的粗提液，将96孔板放入4°C冰箱中进 行吸附，吸附的时间为30min-120min，弃去吸附后96孔板中的溶液，然后用pH = 6. 8的磷 酸缓冲溶液清洗96孔板2遍，将96孔板甩干备用； 步骤四、称取左旋多巴，用PH = 6. 8的磷酸缓冲溶液将左旋多巴配制成底物溶液，称取 待筛选的酪氨酸酶抑制剂，用蒸馏水配制成抑制溶液； 步骤五、取步骤三所得到的96孔板，在96孔板中标记出一号孔和二号孔，在一号孔内 加入50 y 1的所述抑制溶液，在二号孔内加入缓冲液，静置l-5min后，分别在一号孔和二号 孔内加入所述底物溶液，在室温下反应10_60min ; 步骤六、比较所述一号孔与二号孔内溶液的颜色深浅来判断曲酸对酪氨酸酶的抑制效 果。2. 根据权利要求1所述的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤六中通 过酶标仪测试475nm的吸光度值来比较一号孔与二号孔内溶液的颜色深浅。3. 根据权利要求1所述的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述待筛选的酪 氨酸酶抑制剂为曲酸。4. 根据权利要求1至3任一所述的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，在所述步 骤六之后还包括： 步骤七、弃去所述96孔板上的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗96孔板，甩干后， 在该96孔板上加入100 y 1底物溶液，反应10min-60min后，于酶标仪中检测475nm处的吸 光度值； 步骤八、重复步骤七5遍，比较每次反应所得到的溶液在酶标仪中检测475nm处的吸光 度值，得到酪氨酸酶重复利用时的活性。5. -种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、将洗净的含有酪氨酸酶的物料切碎，按质量比Ig:lmL的比例将切碎后的所述 物料加入至4°C预冷的pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液中； 步骤二、将所述磷酸缓冲溶液匀浆处理，然后用双层500目的尼龙纱布过滤，收集滤液 得到酪氨酸酶的粗提液； 步骤三、在96孔板的每孔中加入所述酪氨酸酶的粗提液，将96孔板放入4°C冰箱中进 行吸附，吸附的时间为30min-120min，弃去吸附后96孔板中的溶液，然后用pH = 6. 8的磷 酸缓冲溶液清洗96孔板2遍，将96孔板甩干备用； 步骤四、称取左旋多巴，用PH = 6. 8的磷酸缓冲溶液将左旋多巴配制成底物溶液，称取 待筛选的酪氨酸酶抑制剂，用蒸馏水配制成抑制溶液； 步骤五、取步骤三所得到的吸附有酪氨酸酶的96孔板，在96孔板中标记出一号孔和二 号孔，往所述96孔板内加入所述抑制溶液，往二号孔内加入缓冲液，反应5-10min ; 步骤六、弃去一号孔和二号孔内的溶液，用pH = 6. 8的磷酸缓冲溶液清洗一号孔和二 号孔5遍，甩干后分别在一号孔内和二号孔内内加入底物溶液，静置l-5min，然后在一号孔 和二号孔内加入缓冲液，反应5-10min，比较一号孔和二号孔内溶液的颜色是否有差异，若 有，则说明所述酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制，若没有，则说明所述酪氨 酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制属于不可逆抑制。6. 根据权利要求5所述的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述待筛选的酪 氨酸酶抑制剂为曲酸或无水乙醇。7. 根据权利要求5所述的筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤六中是 通过酶标仪记录475nm的吸光度值来判断所述96孔板内溶液的颜色是否发生变化。
【专利摘要】本发明公开了一种筛选酪氨酸酶抑制剂的方法，包括：将切碎后的双孢蘑菇加入至预冷的pH＝6.8的磷酸缓冲溶液中；将所述磷酸缓冲溶液匀浆处理，然后用尼龙纱布过滤，得到酪氨酸酶的粗提液；在96孔板的每孔中加入所述酪氨酸酶的粗提液，将96也板放入冰箱中进行吸附；配制左旋多巴底物溶液和称取待筛选的酪氨酸酶抑制剂溶液；取步骤三所得到的96孔板，在96孔板上加入底物溶液以及在不同的底物溶液中加入酪氨酸酶抑制剂溶液进行对照培养；比较酪氨酸酶抑制剂与对照组溶液的颜色深浅来判断曲酸对酪氨酸酶的抑制效果。本发明通过对酪氨酸酶粗提液的进行吸附，得到较为纯净的固定化的酪氨酸酶，大大简化了酪氨酸酶的提纯步骤。
【IPC分类】G01N21/31, G01N21/78
【公开号】CN105158180
【申请号】CN201510394028
【发明人】陈健敏, 黄梅萍
【申请人】莆田学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月7日