专利名称：使用人类可动遗传因子通过长距离pcr检测基因中的变化的制作方法
本申请的相关申请本申请是1999年12月23日提交的美国序列号No09/471,598申请的部分继续申请，本申请还是1999年12月23日提交的美国序列号No.09/470,673申请的部分继续申请，本申请还是1999年11月19日提交的美国申请序列号No.09/443,539申请的部分继续申请，本申请还是1999年9月7日提交的美国申请序列号No.09/391,244申请的部分继续申请，所有文献的全文参考收入本篇。
尽管有遗传病原学的证据，但连锁分析显示没有“主要的”易感基因分离成与SLE有关的家族(Shai，R.，等人Hum.Mol.Genet.8639-644(1999))。然而，多项研究显示出SLE和某些主要组织相容性复合体(MHC)抗原之间的相关性(Fielder，A.H.等人，Br.Med J.(Clin.Res.Ed.)286(6363)425-8(1983)；Christiansen，F.T.等人，Aust.NZJ.Med，13(5)483-8(1983)；Reville，J.D.等人，免役遗传学21(4)299-311(1985)；Howard，P.F.等人，Am.J.Med.81(2)187-193(1986)；Kemp，M.E.等人，关节炎和风湿病30(9)1015-1022(1987))，在MHC区域内，在染色体6的短臂上发现补体系统的第四组成的基因C4A和C4B。这些基因是高度同源的，只有在外显子26中有8个核苷酸不同。这种不同导致六个氨基酸的改变，这种改变可以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)来分辨(Belt，K.T.等人，细胞，36(4)907-914(1984))。
HLA-DR3和C4A无效等位基因常常作为伸展单元型B8，BfSC2C，C4AQ0，C4B1；DR3共同遗传。这是在白种人SLE患者中最常见的单元型(Kemp，M.等人，关节炎和风湿病301015-22(1987))。几种含有C4AQ0的单元型具有约30kB的DNA缺失，从C4A基因的5’末端延伸到C4B基因的相同位置。这种缺失已经通过Southern印迹来分类确定，并且已经发现是SLE的一种遗传标记(Kemp，M.E.等人，关节炎和风湿病301015-22(1987))。然而，Southern印迹法是耗时又耗力的过程。
本发明的简述本发明涉及使用长距离聚合酶链反应(LR-PCR)扩增包括全部或部分人类可动遗传因子的靶DNA在所研究的基因中检测变化的方法，具体地是在主要组织相容性区域中的所研究的基因中。变化可以是如缺失，插入，重复，或倒位。人类可动遗传因子可以是DNA-基转座因子(如，mariner因子)，自主逆转录转座子(如，含有长末端重复序列(LTR)的逆转录转座子，如人类内源性逆转录病毒(HERV)；或缺少LTR，如L1因子)，或非-自主逆转录转座子(如Alu因子，假基因)。例如，可以检测C4A基因中的缺失，这种缺失从C4A基因的5’末端延伸到C4B基因的相同位置，并作为全身性红斑狼疮(SLE)的标记。本文称为“C4AQ0”的缺失是约30kB的缺失，其与延伸的单元型B8，BfSC2C，C4AQ0，C4B1；DR3，相关，这是在白种人SLE患者中最常见的延伸单元型(Kemp，M.E等人，关节炎和风湿病301015-22(1987))。这种方法可以用来检测个体是否有可能发展成全身性红斑狼疮，因为存在C4AQ0与发展成全身性红斑狼疮的风险相关。这种方法可另外用来检测个体的C4A缺失基因型(如是否个体与C4AQ0纯合；与C4AQ0杂合；或与不存在C4AQ0纯合)。
在一个实施方案中，对基因组DNA的测试样品进行包含人类可动遗传因子(如在C4A基因的内含子9中的内源性逆转录病毒)的靶DNA的长距离聚合酶链反应(LR-PCR)扩增；将LR-PCR引物设计成这样的，如果基因组DNA包含变化(如C4A基因中的缺失)，则生成PCR产物，如果基因组DNA不包含变化(如在C4A基因中没有缺失)，则不生成PCR产物。存在或不存在PCR产物是存在或不存在变化(在C4A基因中存在或不存在缺失)的指示。在优选的实施方案中，所研究的基因是C4A基因；变化是缺失；引物包括对应于G11基因中DNA序列(如，TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1))的基因正向引物，和对应于C4A基因的外显子10中DNA序列(如，GATGACACAAAATACCAGGATGTGA(SEQ ID NO2))的反向引物。在存在C4AQ0的情况下这些引物产生约5.4kb的PCR产物，在不存在C4AQ0的情况下(即，在不存在C4A基因缺失的情况下)不产生可检测的PCR产物。
在本发明的第二个实施方案中，将基因组DNA的测试样品进行包含人类可动遗传因子(如，包括在C4A基因的内含子9和插入到C4A基因的内含子9中的内源性逆转录病毒之间的连接)的靶DNA的长距离聚合酶链反应扩增，使用设计成这样的引物，如果基因组DNA包含变化(如C4A基因中的缺失)，则没有PCR产物生成，如果基因组DNA不包含变化(如在C4A基因中没有缺失)，则生成PCR产物。存在或不存在PCR产物是不存在或存在变化的指示。在优选的实施方案中，所研究的基因是C4A基因；变化是缺失；引物包括对应于G11基因中DNA序列(如，TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1))的基因正向引物，和对应于C4A基因的内含子9和插入内含子9中逆转录病毒之间的连接(如，TGGTCCCCAACATGTCTGTGCATGCTG(SEQ ID NO3))的反向引物。在不存在C4AQ0的情况下(即，在不存在C4A基因缺失的情况下)，这些引物产生约5.2kb的PCR产物，在存在C4AQ0的情况下，没有产生可检测到的PCR产物。
可替换地，在本发明的另一个实施方案中，用于长距离聚合酶链反应扩增的引物设计成这样的，在存在及不存在变化的情况下(即，在存在或不存在C4AQ0的情况下)，产生可检测到的大小不同的PCR产物。评定PCR产物的大小来显示变化是否存在。
本发明的方法简单实施，提供一致性的结果，并可以使用在测试样品的高产量筛查中。此外，该方法还有利于测定个体基因型，从而提供一种检测有可能遗传或发展成与所研究的基因的变化有关的疾病(如全身性红斑狼疮)的个体的快速可靠的装置。
本发明示图的简单描述
图1显示长距离聚合酶链反应(PCR)检测存在C4AQ0(在C4A基因中存在缺失)。
图2显示长距离聚合酶链反应(PCR)检测不存在C4AQ0(在C4A基因中不存在缺失)。
本发明的详细描述本发明涉及在所研究的基因中检测变化的方法。如本文所使用的，“所研究的”基因是指要进行评定存在或不存在变化的基因(如编码多肽的核酸)。在优选实施方案中，基因是主要组织相容性(MHC)区域中的基因。例如，方法可以用来评定与补体-基疾病有关的变化，如风湿性关节炎，全身性红斑狼疮，或肾脏疾病如肾病(如免疫球蛋白A肾病)。基因中的“变化”是指与基因的已知或预期核酸序列相比(测试样品中的)基因的核酸序列中的改变。例如，变化可以是缺失(如缺失一个或多个核苷酸)，插入(如插入一个或多个核苷酸)，重复(重复部分或全部基因)，或倒位。
在本发明的方法中，长DNA序列的聚合酶链反应(PCR)扩增(本文称为“长距离PCR”或“LR-PCR”)可以用来扩增与人类可动遗传因子相邻的及包括人类可动遗传因子的DNA(对于人类可动遗传因子的讨论，参看如，Kazazian，H.和Moran，J.，自然遗传学(Nature Genetics)1919-24(1998)；这篇文献的全文全部参考收入本篇)。人类可动遗传因子可以是DNA-基的转座因子(如，mariner因子)。可替换地，人类可动因子可以是自主逆转录转座子，例如含有长末端重复序列(LTR)的逆转录转座子，如短散在元件或长散在元件(SINE或LINE)，或人类内源性逆转录病毒(HERV)，或缺乏LTR的逆转录转座子，如L1因子。人类可动遗传因子也可以是非-自主逆转录转座子(如Alu因子，假基因)。在优选实施方案中，所研究的人类可动遗传因子是人类内源性逆转录病毒(HERV)。由于HERV在MHC内流行，以及HERV和补体-基或其他与MHC相关的疾病之间的可能的关系，HERV对于分析所研究的基因特的主要组织相容性复合体(MHC)特别有用(参看如Amdersson，G.等人，Trends Genet.14(3)109-114(1998)；Kulski，J.K.等人，J.Mol.Evol.48(6)675-83(1999)；Taruscio，D.，和Mantovani，A.，(畸形学)Teratology53(2)108-110(1996)；Hasuike，S.等人，J.Hum.Genet.44(3)343-7(1999)；Kulki，J.K.等人，J.Mol.Evol.49(1)84-97(1999))。
使用在方法中的人类可动遗传因子是指“所研究的人类可动遗传因子”。使用在LR-PCR反应中的引物设计成这样的，在所研究的基因中存在变化的情况下，产生可以检测的PCR产物，在不存在变化的情况下，没有产生可以检测的PCR产物，或者可以检测可检测到的不同大小的PCR产物。使用所设计的(在不存在变化的情况下，产生可以检测的PCR产物，在存在变化的情况下，没有产生可以检测的PCR产物，或者可以检测可检测到的不同大小的PCR产物)引物通过LR-PCR可证实不存在变化。
例如，在本发明的具体实施方案中，检测到C4A基因中的缺失。具体地，检测到从C4A基因5’末端延伸到C4B基因的相同位置的缺失C4AQ0。这种缺失可作为全身性红斑狼疮(SLE)的标记(参看如，Kemp，M.E.等人，关节炎和风湿病301015-22(1987)；Arnett，F.C.，Clin.Immunol.Immunopathol.63(1)4-6(1992))。检测C4A基因中缺失的方法利用C4A基因中的多态性，这种多态性是由于在C4基因的内含子9中存在6.4kb逆转录病毒插入(Chu，X.，等人，Exp.Clin.Immunogenet.1274-81(1995))。使用在LR-PCR反应中的引物是设计成这样的，在C4A基因中存在缺失的情况下(如，在存在C4AQ0的情况下)，产生可检测的PCR产物，在不存在缺失的情况下(如不存在C4AQ0的情况下)，没有可检测的PCR产物产生，或者可以检测可检测到的不同大小的PCR产物。使用所设计的(在不存在缺失的情况下，产生可以检测的PCR产物，在存在缺失的情况下，没有产生可以检测的PCR产物，或者可以检测可检测到的不同大小的PCR产物)引物通过LR-PCR可证实不存在缺失。方法可以用来检测有可能发展成SLE或遗传SLE的个体，或者可以用来在怀疑患有SLE的个体中证实对SLE的诊断。聚合酶链反应扩增聚合酶链反应(PCR)扩增是众所周知的扩增核苷酸序列的手段。在单个循环的PCR扩增中，将双-链靶DNA序列变性；引物对每条链的变性靶退火；引物被DNA聚合酶延伸。为了集中样品中靶DNA序列的拷贝数，将这个循环重复，一般在25次到40次之间。使用在PCR中的引物设计用来在使延伸的引物是靶DNA序列的互补拷贝的位置和方向对变性的靶DNA序列链退火。在随后的扩增循环中，延伸的引物也可用作为扩增的靶。PCR在美国专利No.4,683,20；4,683,195；4,800,159；和4,965,188中进行了详细地描述，这些专利的全部内容参考收入本篇。“长距离”PCR使用促进靶链变性(如较高的变性温度)的扩增条件，以及保护DNA不降解的扩增条件；使用较长的延伸时间；并通过使用具有外切核酸酶活性的聚合酶降低错配来最小化错误核苷酸的掺入，从而使DNA的延伸链扩增。长距离PCR在美国专利5,512,462中，在Burland，V和Kusukawa，N.，生物技术231070-1072，1074-1075(1997)中；以及在Cheng，S.等人Proc.Natl.Acad，Sci.USA 915695-5699(1994)中有详细描述，这些文献的全文参考收入本篇。测试样品在本发明的方法中，使用了包括基因组DNA的测试样品。测试样品从怀疑在所研究的基因中有变化(或携带与变化有关的缺损的)的个体(如个体怀疑具有或携带与全身性红斑狼疮(SLE)有关的缺损)中获得的(“测试个体”)。个体可以是成年人，儿童，或胎儿。测试样品可以从含有基因组DNA的任何来源获得，如血液或组织样品(如从皮肤或其他器官)。在优选的实施方案中，测试样品从血液样品，成纤维细胞皮肤样品，从头发根部，或者从从口腔获得的细胞(如，通过漱口水)中获得。在另一个优选实施方案中，测试样品通过适当的方法从胎儿细胞或组织中获得，如通过羊水诊断或绒膜绒毛取样。将测试样品进行LR-PCR扩增，然后检测存在或不存在变化(如在C4A基因中存在或不存在缺失)。引物为了实施LR-PCR，设计引物来扩增与所研究的基因相邻，和/或包括至少部分所研究的基因的DNA。扩增的DNA包括全部或部分所研究的人类可动遗传因子(如在C4A基因中掺入的逆转录病毒)，以及部分可能含有所研究的变化的基因。在一些实施方案中，所研究的人类可动遗传因子可以是部分所研究的基因(如，不仅仅与所研究的基因相邻)，并且可以含有所研究的变化。靶中用来进行扩增的DNA，其含有所研究的人类可动遗传因子，本文称为“靶”DNA。如本文所使用的，术语“引物”是指在如下面所描述的适当条件下，在PCR期间能作为核酸合成的启动点的寡核苷酸。一般引物有15到50个核苷酸，和/或具有Tm约50-75℃；优选地，引物的长度约为25-30个核苷酸，和/或具有Tm约60-65℃。引物可通过多种方式制备，包括化学合成(参看，如Narang等人，Meth.Enzymol.6890-99(1979)；Brown等人，Meth.Enzymol.68109-151(1979)；Beucage等人，Tetrahedron Lett.221859-1862(1981)；美国专利4,458,066；这些文献的全部内容参考收入本篇)。引物设计成这样的，从引物获得的PCR产物(如下面所描述的)大小将不同，这取决于存在或不存在变化(如，在C4A基因中存在或不存在缺失，如C4AQ0)。也就是，在存在变化的情况下，引物将产生某种(第一)尺寸的PCR产物，在不存在变化的情况下，相同的引物将产生与在存在缺失的情况下的PCR产物的尺寸(第一尺寸)有可检测到的不同的尺寸(第二尺寸)的PCR产物。“可检测到的不同”尺寸是指使用标准技术(如下面所描述的)产物的尺寸的不同可以检测。在另一个实施方案中，引物设计成这样的，在存在变化的情况下或者在不存在变化的情况下没有产生PCR产物。例如，在一个实施方案中，在存在变化的情况下，引物将产生某种尺寸的PCR产物，在不存在缺失的情况下，引物将不产生PCR产物。可替换地，在另一个实施方案中，在不存在变化的情况下，引物将产生某种尺寸的PCR产物，在存在变化的情况下将不产生PCR产物。
引物的核苷酸序列对应于与所研究的人类可动遗传因子相邻的或存在于所研究的人类可动遗传因子中(如与C4A基因相邻或逆转录病毒插入)的DNA序列。“对应于”DNA序列的引物是具有与DNA序列相同的核苷酸序列的引物，或者是与DNA序列充分互补以使其在PCR条件下能与DNA序列杂交的引物。与人类可动遗传因子“相邻的”DNA序列是指物理上与所研究的可动遗传因子磷近的DNA序列。例如，与C4A基因“相邻的”DNA序列是指在染色体6上与C4A基因物理上邻近的DNA序列，如与C4A基因相邻接的基因中的DNA序列(如，G11，C2，TEN，Bf，21-OH或RD基因，优选的是G11基因)。“上游”或“正向”引物(与靶DNA的非-编码链杂交并形成编码链的扩增产物的5’末端的引物)和“下游”或“反向”引物(与靶DNA的编码链杂交并形成非-编码链的扩增产物的5’末端的引物)都可以使用。
为了在所研究的基因中检测存在或不存在变化，正向引物对应于可能含有变化的所研究的基因的上游部分的单一DNA序列，反向引物对应于可能含有变化的所研究的基因的下游部分的单一DNA序列；或者正引物，或者反向引物含有全部或部分的人类可动遗传因子。例如，为了检测C4A基因中存在缺失(如，存在C4AQ0)，正向引物对应于靶DNA的上游单一DNA序列(如对应于G11基因中DNA序列的正向引物)，反向引物对应于C4A基因的外显子中的DNA序列，即在逆转录病毒插入的靶DNA位置后(下游)(如内含子9的第二个一半，外显子10，或在远处)。为了检测C4A基因中不存在缺失(如，检测不存在C4AQ0，或检测存在逆转录病毒的插入)，可使用如上所描述的相同的正向引物；反向引物对应于靶DNA内的DNA序列，其是逆转录病毒序列(如在逆转录病毒序列和内含子9之间的连接中的DNA序列)。在本发明的一个实施方案中，为了检测存在C4AQ0，使用了正向引物TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1)，其对应于G11基因中的DNA序列。在本发明的另一个实施方案中，为了检测不存在C4AQ0，使用了相司的正向引物TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ IDNO1)，使用了反向引物TGGTCCCCAACATGTCTGTGCATGTG(SEQ ID NO3)，其对应于C4A基因的内含子9和逆转录病毒序列之间的连接的DNA序列。PCR条件在LR-PCR扩增中使用基因组DNA的测试样品和引物。实施长距离PCR扩增，如在美国专利5,512,462中所描述的。简单地，将基因组DNA的测试样品和引物混合成扩增反应混合物。“扩增反应混合物”含有靶DNA序列扩增所需的试剂(如核苷酸，酶，缓冲液等等)。代表性扩增反应混合物包括可购得的试剂盒，如rTth DNA POLYMERASE XL试剂盒(Perkin Elmer，产品目录N808-0187)。然后将包括测试样品和引物的扩增反应混合物进行温度变化循环处理。如果使用购得的试剂盒，制造商的建议方案可用来扩增靶DNA。
例如，在本发明的一个实施方案中，可使用20ul的反应混合物，包括下列组分模板DNA(基因组) 1ul(约100ng)3.3×缓冲液 6ul(如rTth聚合酶XL试剂盒缓冲液，Perkin-Elmer)MgOAc 0.8ul(最终1mM)dNTP(2mM) 2ul(最终200uM)正向引物(5uM) 2ul(最终0.5uM)反向引物(5uM) 2ul(最终0.5uM)rTth聚合酶0.4ul**水5.8ul**rTh聚合酶外切核酸酶活性；在加入rTth聚合酶后立即开始PCR，rTth聚合酶持续加入到混合物中。
然后将反应混合物经历循环条件，如下列条件1循环 94℃30秒35循环 90℃10秒55℃10秒65℃10秒保持在4℃。PCR产物分析在LR-PCR扩增反应后，如果有的话，进行PCR产物检测。术语“PCR产物”是指在PCR扩增期间产生的靶DNA序列拷贝(即，在PCR过程期间已经扩增的DNA)。如果在PCR期间没有DNA扩增，就没有PCR产物产生。对PCR产物分析包括检测可检测到的PCR产物存在(或不存在)；在优选实施方案中，对PCR产物分析包括确定任何可检测到的PCR产物的大小。PCR产物可通过多种方法检测；在优选实施方案中，可使用通过大小分离DNA的方法，如凝胶电泳法(如琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳)，或HPLC，来分离PCR产物，接着通过染色(如，使用溴化二氨乙苯啡啶)，或标记探针的杂交来检测大小分组的DNA。代表性的方法在分子生物学的当前方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)(Ausubel，F.等人，John Wiley &Sons)中描述，包括截止到1999年的全部增刊。在优选实施方案中，使用溴化二氨乙苯啡啶琼脂糖凝胶电泳，然后检测存在或不存在PCR产物。对存在变化的测定根据PCR产物的存在不存在，或PCR产物的大小可以测定所研究的基因中存在或不存在变化(如在C4A基因中的缺失)。例如，如
图1所示，如果测试样品包括含有C4AQ0的基因组DNA，那么G11基因中的正向引物和外显子10中的反向引物(如，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)将会产生约5.4kb的PCR产物。如果测试样品包括的基因组DNA不含C4AQ0，那么在这些引物间的DNA将有约11.8kb，这个产物太大而不会产生(即，没有PCR产物产生)。因此，检测到PCR产物，特别是约5.4kb的PCR产物，表示存在缺失，具体地存在与SLE有关的C4AQ0。没有PCR产物表示不存在C4AQ0。如果检测到PCR产物(即，如果测试样品含有包括缺失(如C4AQ0)的基因组DNA)，可实施进一步的试验来确定测试样品对缺失是纯合的还是杂合的(如对C4AQ0杂合或纯合)。例如，使用在G11基因中的正向引物(如，SEQ ID NO1)，以及使用对应于C4A基因的内含子9和逆转录病毒序列之间的连接的DNA序列的反向引物(如，SEQ ID NO3)。如图2中所示，如果测试样品含有不包括缺失的(即，对C4AQ0是杂合的)基因组DNA，这些引物将会产生5.2kb的PCR产物。如果测试样品含有包括缺失的(即，对C4AQ0纯合的)基因组DNA，那么就没有PCR产物产生。因此，检测到PCR产物，特别是约5.2kb的PCR产物，表示不存在缺失，具体地不存在C4AQ0。没有PCR产物表示存在缺失，具体地表示存在与SLE有关的C4AQ0。测定个体发展成与所研究的基因中的变化有关的疾病的可能使用上述方法，从个体获取基因组DNA的测试样品，如从怀疑有可能发展成或遗传与所研究的基因中的变化有关的疾病或病况(如SLE)的个体获取，对测试样品进行在所研究的基因中存在或不存在变化的分析(如，在C4A基因中的缺失，如分析存在或不存在C4AQ0)。如果从个体获取的测试样品包括含有变化的(如在C4A基因中的缺失，如存在C2AQ0)基因组DNA，由此存在缺失表示个体有可能发展成或遗传与所研究的基因中的变化有关的疾病或病况。
此外，使用上述方法，可以对从个体获取的基因组DNA的测试样品进行所研究的基因的纯合性或杂合性分析。例如，可以对基因组DNA的测试样品进行C4A基因中存在或不存在缺失的分析(如进行存在或不存在C4AQ0的分析)，可以确定C4A缺失的基因型(如，个体对C4AQ0是纯合的(存在C4AQ0)；或对C4AQ0杂合的；或对不存在C4AQ0是纯合的)。例如，可以对从个体获取的包括基因组DNA的测试样品实施靶DNA的长距离聚合酶链反应扩增，其中靶DNA包括在C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入，如上所述。如果测试样品包括含有C4A基因中缺失的基因组DNA，则生成PCR产物，如果测试样品不包括含有C4A基因中缺失的基因组DNA，那么就没有PCR产物生成；这样，存在PCR产物说明个体对C4A基因中的缺失(如C4AQ0)是纯合的或是杂合的，不存在PCR产物说明个体对不存在C4A基因中的缺失(如C4AQ0)是纯合的。对缺失的纯合性和杂合性可通过将包括从个体获取的基因组DNA的测试样品进行靶DNA的长距离聚合酶链反应扩增，靶DNA包括在C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入和内含子9之间的连接，如上面所描述的。如果测试样品包括含有C4A基因中缺失的基因组DNA(如，C4AQ0)，那么没有PCR产物生成，如果测试样品不包括含有C4A基因中缺失的基因组DNA，那么就生成了PCR产物；不存在PCR产物表示个体对C4A基因中的缺失(如，C4AQ0)是纯合的，存在PCR产物表示个体对C4A基因中的缺失(如，C4AQ0)是杂合的。这种方法提供了超过蛋白质-基分析法的优点，由于C4A蛋白质产生的量非常低，使得通过分析C4A蛋白质的量来确定基因型很困难。
测定基因型可以评定个体发展成(或遗传)SLE的可能性。与有一个或多个缺失的个体相比，没有缺失的个体发展成SLE的可能性低。至少一个C4AQ0(即，杂合或纯合基因型)已在高达50％或更多的患有SLE的患者中检测到，而在11-13％的SLE患者中报导对C4AQ纯合，对照组中有2-3％(Schur，P.H.，Dubois’Lupus Erythematosus，第5版254-261(1977)；Arnett，F.C.，Moulds，J.M.，Clin.Exp.Rheumatol.9289-296(1991)；Ratnoff，W.D.，Rheumatic.Dis.Clin.N.Am.2275-94(1996)；Kumar，A.等人，Clin.Immunol.Immunopathol.6055-64(1991)；Fielder，A.H.等人，Br.Med.J.(Clin.Res.Ed.)286(6363)425-8(1983)；Reveille，J.D.等人，Immunogenetics 21(4)299-311(1985))。本发明的应用已通过对C4A基因分析存在或不存在缺失(如，存在或不存在C4AQ0)来示例的本发明的方法，同样可用来分析其他基因来检测在所研究的基因中存在或不存在其他变化(如缺失，重复，插入，及倒位)。例如，如上面所描述的，由于本发明的方法能分析DNA的相当大的区域，如MHC的区域，所以本发明的方法可特别用来检测主要组织相容性复合体(MHC)区域的基因内的变化(如缺失)。由此，可使用本发明的方法来测定与补体-基疾病有关的变化，如风湿性关节炎，关节强直性脊椎炎，硬皮病，亚急性硬化性全脑炎，以及肾脏疾病如肾炎(如免疫球蛋白A肾炎)。
为了使用本发明的方法进行DNA区域分析来测定所研究的基因中存在或不存在变化，设计引物来扩增包括和/或围绕变化的DNA区域。特别注意的是引物的退火温度(Tm)设计的退火温度应保证在长距离PCR扩增所需的条件下聚合酶链反应成功。例如，如在上面所描述的，引物的Tm应约为50-75℃，优选地在约60-65℃。引物应设计成这样的，如上面所描述的，从引物获得的PCR产物将是大小不同的，这取决于在所研究的基因中存在或不存在变化。也就是，在存在变化的情况下，引物将产生某种尺寸(第一尺寸)的PCR产物，在不存在变化的情况下，相同的引物将产生(第二尺寸)的PCR产物，第二尺寸可检测地不同于存在变化情况下的PCR产物的尺寸(第一尺寸)。可替换地，引物设计成这样的，或者在存在变化的情况下，或者不存在变化的情况下，没有PCR产物产生。例如，在存在变化的情况下，引物将产生某种尺寸的PCR产物，在不存在变化的情况下，将没有PCR产物产生；可替换地，在不存在变化的情况下，引物将产生某种尺寸的PCR产物，在存在变化的情况下，将没有PCR产物产生。如上所述获得测试样品，并如所描述的实施长距离PCR。如果有的话，使用如上所述的方法评定PCR产物来检测在所研究的基因中存在或不存在变化。存在或不存在PCR产物，或存在具体尺寸的PCR产物，表示在所研究的靶基因中存在或不存在变化。
为了演示本发明的目的提供了下面的实例，这些实例不解释为对本发明范围的限制。本文所引用的全部文献都参考收入本篇。实施例在与SLE相关的C4A基因中检测存在或不存在缺失C4蛋白质同种异型通过对羧肽酶(Sigma I类)和神经氨糖酸苷酶(Sigma VIII类)处理的血清样品的高电压琼脂糖电泳及接着使用单克隆抗体(Incstar)(sim and cross，Biochem.J.239763-767(1986))的免疫固定来分析C4蛋白质同种异型。通过将C4A和C4B在凝胶上的位置与已知标准样品相比较，确定C4A和C4B同种异型。通过C4A和C4B的相对带强度来强度C4A和C4B的接合性。HLA测定类型使用淋巴细胞毒性测试通过血清学方法实施MHC类同种异型的类型测定(Perdue等人，组织抗原，9259-266(1997))。使用序列特异引物(PCR-SSP)(Dynal)实施MHC II类等位基因的类型测定(Olerup and Zetterquist，组织抗原30225-235(1992))。使用家族信息提供MHC I，II，和III类的单元型来实施分离分析。对于具有不完全类型测定结果的个体，最可能的单元型是从第一代亲缘关系中推出的。样品选择对DNA样品收集物实施C4蛋白质同种异型测定和HLA类型测定，DNA样品收集物是在冰岛Reykjavik的风湿病学研究中心进行的风湿性疾病研究中获得的。这样确定了适当的个体使用长PCR法进行筛查。其中有两个个体即有C4A蛋白质缺损也对B8-C4AQ0-C4B1-DR3纯合，同时21个杂合子具有C4A蛋白质缺损。总共有66个个体没有B8-C4AQ0-C4B1-DR3延伸单元型，并在C4A蛋白质表达中没有缺损。通过长距离PCR测定C4A缺失基因型两种不同的长距离PCR测试法-一种C4A缺失特异和另一种非-缺失特异设计用来确定C4A基因型。使用长距离PCR对具有不同基因型的(对C4AQ0纯合的(“缺失”)；对缺失杂合的；对无缺失纯合的)个体进行测试以确定存在或不存在C4AQ0。如上面所描述的，通过分析C4蛋白质和HLA类型测定，个体的基因型已预先确定。
根据G11基因和C4A内含子9的相对位置来设计引物。对于C4A缺失和非-缺失检测可以都使用G11基因中的相同正向引物。为了检测C4A缺失，使用对C4A/C4B的外显子特异的反向引物。当出现C4A缺失时，预计产生5.4kb(5401bp)的产物，而在不存在C4A缺失时，由于在内含子9中存在6/4kb(6374bp)HERV-K(C4)，使用循环条件，可能的11.8kb(11,775bp)的产物太长而不能生成。在对缺失杂合的情况下，长距离PCR将有利于扩增5.4kb产物而不是11.8kb的产物。因此，实施对每种情况特异的不同的反应。为了检测不存在C4A缺失，设计反向引物在HERV-K(C4)序列和内含子9的单一序列之间的连接处退火，因为C4A缺失缺少这种HERV-K(C4)序列。当非-缺失发生时(即在不存在C4A缺失的情况下)，预计产生5.2kb(5237bp)的产物。
从外周白血细胞获得的DNA可使用在样品中。使用rTth聚合酶XL试剂盒(Perkin-Elmer)对样品进行长距离PCR扩增。扩增反应混合物包括下列组分，总体积为20ul
模板DNA(基因组)1ul(约100ng)3.3×缓冲液*6ulMgOAc 0.8ul(最终1mM)dNTP(2mM) 2ul(最终200uM)正向引物(5uM) 2ul(最终0.4uM)反向引物(5uM) 2ul(最终0.4uM)rTth聚合酶 0.4ul水 5.8ul缓冲液含有N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)，乙酸钾，甘油和二甲基亚砜(DMSO)。
对于正向引物，使用TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1)(“引物1”)，其对应于G11基因中的DNA序列。对于反向引物，使用GATGACACAAAATACCAGGATGTGA(SEQ ID NO2)(“引物2”)，其对应于C4A基因的外显子10中的DNA序列，或者使用TGGTCCCCAACATGTCTGTGCATGCTG(SEQ ID NO3)(“引物3”)，其对应于C4A基因的内含子9和逆转录病毒序列之间的连接的DNA序列。因为rTh聚合酶具有外切核酸酶活性；在加入rTth聚合酶后立即开始PCR，rTth聚合酶持续加入到混合物中。将反应混合物经历下列循环条件
1循环 94℃30秒35循环 90℃10秒55℃10秒65℃10秒保持在4℃。
对于电泳，用标准加样缓冲液(0.25％溴酚蓝；40％(w/v)蔗糖的水溶液)在0.8％溴化而氨乙苯啡啶琼脂糖凝胶(Sigma)上加样PCR产物，在100V/小时下在Tris-硼酸盐(borate)-乙二胺二乙酸(EDTA)(1×TBE)中操作，在紫外光下视觉观察(Eagle Eye II，Stratagene)。长PCR产物的克隆和末端测序将长PCR产物从琼脂糖凝胶中分离，并使用ultrafree DA提纯试剂盒(Millipore)接着通过乙醇沉淀来提纯。使用1U Taq聚合酶(Promega)和1×Taq缓冲液，在200uM dNTP中10ul反应物中实施dA3’突出端加成。在72℃实施反应15分钟，在冰上通过冷却终止反应。依据制造商的指示，将长PCR产物克隆到TOPO XL TA载体(Invitrogen)中并转化到TOP10细胞中。从每个末端对正克隆体约500个碱基对测序，以确认使用Universal M13正向(-20)(16mer)和反向(17mer)引物(Invitrogen)及BigDye终止子循环测序试剂盒(Perkin Elmer)的精确扩增。将样品在ABI377上操作，并使用序列分析软件3.0(Perkin Elmer)进行分析。结果结果显示，对于具有从C4A基因的5’末端延伸到C4B基因的相同位置的C4A基因中纯合或杂合缺失(即，对C4AQ0纯合或杂合的)的个体，引物1和2产生5.4kb的PCR产物。对于没有缺失(即，纯合正常的)的个体，没有产生可检测到的PCR产物。对于具有杂合缺失的个体，引物1和3产生5.2kb的PCR产物。显著地，C4AQ0的纯合子和C4AQ0的杂合子，全都有SLE。
虽然本发明引用其优选的实施方案进行了具体的演示和描述。但此领域中的技术人员可以理解，在没有背离所附权利要求书所包含的本发明的范围的情况下，本发明可以在形式上和细节上作出多种改变。
权利要求
1.一种在所研究的基因中检测存在或不存在变化的方法，包括(a)将包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有所研究的人类可动遗传因子的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，那么产生PCR产物，如果测试样品不包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，则没有PCR产物产生；以及(b)检测存在或不存在PCR产物，其中存在PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中存在变化，不存在PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中不存在变化。
2.一种在所研究的基因中检测存在或不存在变化的方法，包括(a)将包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有所研究的人类可动遗传因子的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，那么产生具有第一尺寸的PCR产物，如果测试样品不包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，则产生具有第二尺寸的PCR产物，其中第一尺寸和第二尺寸的不同是可检测到的；以及(b)评定PCR产物的尺寸，其中存在具有第一尺寸的PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中存在变化，存在具有第二尺寸的PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中不存在变化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所研究的人类可动遗传因子包括在所研究的基因中的变化。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中变化是从下列组中选取的，包括缺失，重复，插入，和倒位。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所研究的基因是主要组织相容性复合体(MHC)的基因。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所研究的人类可动遗传因子是从下列组中选取的，包括DNA-基的转座因子，自主逆转录转座子，和非-自主逆转录转座子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中自主逆转录转座子是人类内源性逆转录病毒或L1因子。
8.根据权利要求6所述的方法，其中非-自主逆转录转座子是Alu因子或假基因。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所研究的基因是C4A基因，所研究的人类可动遗传因子是C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入，所研究的基因中的变化是C4A基因中的缺失。
10.根据权利要求9所述的方法，其中C4A基因中的缺失是C4AQ0。
11.根据权利要求10所述的方法，其中长距离聚合酶链反应扩增使用了对应于G11基因中DNA序列的正向引物，和对应于C4A基因的外显子10中DNA序列的反向引物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中PCR产物，如果存在，尺寸约为5.4kb。
13.根据权利要求11所述的方法，其中正向引物是TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1)；反向引物是GATGACACAAAATACCAGGATGTGA(SEQ IDNO2)。
14.根据权利要求9所述的方法，其中靶DNA包括内含子9中逆转录病毒的插入和内含子9之间的连接。
15.根据权利要求14所述的方法，其中C4A基因中的缺失是C4AQ0。
16.根据权利要求15所述的方法，其中长距离聚合酶链反应扩增使用了对应于G11基因中DNA序列的正向引物，和对应于C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入和内含子9之间的连接的DNA序列的反向引物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中PCR产物，如果存在，尺寸约为5.2kb。
18.根据权利要求16所述的方法，其中正向引物是TCTAGCTTCAGTACTTCCAGCCTGT(SEQ ID NO1)；反向引物是TGGTCCCCAACATGTCTGTGCATGCTG(SEQID NO3)。
19.一种检测个体是否可能发展成与所研究的基因中的变化有关的疾病的方法，包括(a)将从个体获取的包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有人类可动遗传因子的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有变化的基因组DNA，那么产生PCR产物，如果测试样品不包括含有变化的基因组DNA，则没有PCR产物产生；以及(b)检测存在或不存在PCR产物，其中存在PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中存在变化，这与可能发展成与所研究的基因中的变化有关的疾病相关。
20.一种检测个体是否可能发展成与所研究的基因中的变化有关的疾病的方法，包括(a)将包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有所研究的人类可动遗传因子的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，那么产生具有第一尺寸的PCR产物，如果测试样品不包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA，则产生具有第二尺寸的PCR产物，其中第一尺寸和第二尺寸的不同是可检测到的；以及(b)检测存在或不存在PCR产物，其中存在PCR产物表示在测试样品中的所研究的基因中存在变化，这与可能发展成与所研究的基因中的变化有关的疾病相关。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中基因是C4A基因，与基因中的变化有关的疾病是全身性红斑狼疮，所研究的人类可动遗传因子是C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入，所研究的基因的变化是C4A基因中的缺失。
22.根据权利要求21所述的方法，其中C4A基因中的缺失是C4AQ0。
23.一种检测个体C4A缺失基因型的方法，包括(a)将从个体获取的包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有C4AQ0的基因组DNA，那么产生PCR产物，如果测试样品不包括含有C4AQ0的基因组DNA，则没有PCR产物产生；以及(b)检测存在或不存在PCR产物，其中存在PCR产物表示个体或者对于C4AQ0是纯合的或者对于C4AQ0是杂合的，不存在PCR产物表示个体对于不存在C4AQ0是纯合的。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括(a)将从个体获取的包括基因组DNA的测试样品进行长距离聚合酶链反应扩增含有C4A基因内含子9中的逆转录病毒插入和内含子9之间的连接的靶DNA，这样，如果测试样品包括含有C4AQ0的基因组DNA，则没有PCR产物产生，如果测试样品不包括含有C4AQ0的基因组DNA，则产生PCR产物；以及(b)检测存在或不存在PCR产物，其中不存在PCR产物表示个体对于C4AQ0是纯合的，存在PCR产物表示个体对于C4AQ0是杂合的。
全文摘要
本文描述了通过对含有基因组DNA的测试样品实施长距离聚合酶链反应扩增来检测所研究的基因(如C4A基因中的缺失)中变化的方法。本发明的方法通过设计成仅在测试样品包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA时产生PCR产物的引物,扩增包括全部或部分人类可动遗传因子(如C4A基因的内含子9中的逆转录病毒插入)的靶DNA;或可替换地,本发明的方法使用设计成仅在测试样品包括不含有所研究的基因中的变化的基因组DNA时产生PCR产物,扩增靶DNA。或者可替换地,引物设计成这样的,PCR产物具有可检测到的不同的尺寸,这取决于测试样品是否包括含有所研究的基因中的变化的基因组DNA。本发明的方法还可用来检测个体是否可能患有与所研究的基因中的变化有关的疾病或病况,因为存在这种变化与患病可能相关。
文档编号C12N15/09GK1382221SQ00812602
公开日2002年11月27日 申请日期2000年9月6日 优先权日1999年9月7日
发明者斯特劳恩·格兰特, 索瑞英尼·布洛恩戴尔 申请人:解码遗传Ehf公司