专利名称：植物二氢乳清酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以作为除草剂的活性成分的新靶蛋白的植物二氢乳清酸酶的鉴定。本发明还涉及编码具有二氢乳清酸酶(EC 3.5.2.3)活性多肽的DNA序列。本发明涉及应用植物来源的能够编码具有二氢乳清酸酶活性蛋白质的核酸，产生一个测试系统用于鉴定除草活性的二氢乳清酸酶抑制剂，同时涉及利用这些方法和测系统所鉴定的植物二氢乳清酸酶的抑制剂。另外，本发明还涉及编码具有二氢乳清酸脱氢酶活性多肽的DNA序列以及此多肽在分子测试系统中作为辅助酶的应用。而且本发明还涉及利用这个编码植物二氢乳清酸酶的核酸来生产对二氢乳清酸酶抑制剂抗性增加的植物。此外，本发明涉及一种清除不被需要的植被的方法，它包括用一种化合物处理要被清除的植物，此化合物特异性地与二氢乳清酸酶结合并且抑制它的功能，其中二氢乳清酸酶是由SEQ-ID NO.1所示的一段DNA序列或与此序列进行杂交的一段DNA序列编码。
植物能够利用二氧化碳、水和无机盐合成它们的细胞组分。
这一方法只能通过生物化学反应合成有机物。核苷酸，作为核酸的组分，必须在植物中从头合成。
不仅嘌呤重新生物合成的酶反应，而且嘧啶重新生物合成的酶反应，对于调节核苷酸的代谢都具有重要作用，这些酶中的一种就是二氢乳清酸酶，它催化氨甲酰天冬氨酸脱水后闭环生成二氢乳清酸，紧接着的二氢乳清酸脱氢酶经氧化还原作用将二氢乳清酸转变成乳清酸，参见附
图1。
从许多种生物中分离出了编码二氢乳清酸酶的基因，完整的cDNA序列可以从细菌(Genebank Acc.No.M97254，恶臭假单胞菌，X84262，德氏乳杆菌，AE000207，埃希氏大肠杆菌，M97253，恶臭假单胞菌，P74438集胞蓝细菌属)中获得。在真核生物中，二氢乳清酸酶是一种位于编码序列的多功能酶复合体的一种组分(例如X03881黑尾果蝇)。在酵母中，二氢乳清酸酶也存在于一种多功能酶复合体上(Souciet等，Mol.Gen.Genet.207(2-3)，314-319(1987))。在植物中，二氢乳清酸酶不是多功能多肽的一种成分，但却与在大肠杆菌中的情形相似，它是以一种单独的酶存在。迄今为止，植物的二氢乳清酸酶只能从鼠耳芥(Genebank Acc.No.AF000146；Zhou等，植物生理学(Plant Physiol)114(1997)，1569)分离得到。
在转基因植物中，通过反义技术使酶活性减小，由此证明此酶适合作为除草剂的靶蛋白。如果酶活性的减小导致生长受抑制，可以推断这种活性被减小的酶是除草剂活性成分的作用位点。这一点已通过转基因马铃薯乙酰乳酸合成酶的实施例来说明(Hofgen等，植物生理学(PlantPhysiology)107(1995)，469-477)。
本发明的目的是，证明植物中的二氢乳清酸酶是一种合适的除草剂的靶蛋白；分离出编码植物二氢乳清酸酶的完整cDNA并在细菌和真核细胞中进行功能性的表达；产生一个有效而简便的测试系统进行抑制剂-酶结合的研究。
我们发现此目标可通过以下操作完成分离出一个编码植物二氢乳清酸酶的基因，产生二氢乳清酸酶的反义构建体，在细菌和真核细胞中功能性表达二氢乳清酸酶。
首先，本发明涉及如SEQ-ID NO1所示的DNA序列，它包含来自于马铃薯(potato)的植物二氢乳清酸酶的编码区，参见实施例1和2。
本发明还涉及从SEQ-ID NO1衍生或能够与此序列杂交的DNA序列，它能够编码一种具有二氢乳清酸酶生物活性的蛋白质。
人们已经对带有一个二氢乳清酸酶反义构建体的ROSa系植物的特征作了详细地描述。此系植物都显示出了不同程度的生长延迟，其中植物系ROSa-40受到很大影响以至没有块茎形成，因此此系中的植物无法在温室中存活，必须在体外进行培植。可以发现生长延迟和二氢乳清酸酶蛋白数量的减少之间具有相关性，二者之间的明确关联无疑确定二氢乳清酸酶可作为除草剂活性成分的新靶蛋白，参见实施例3-7。
为了找到植物二氢乳清酸酶的有效的抑制剂，必须提供适当的测试系统用于抑制剂-酶结合的研究。因此，将马铃薯二氢乳清酸酶的全cDNA序列克隆到一个表达载体(pQE，Qiagen)并在大肠杆菌中进行过表达，参见实施例8。
另外，含有SEQ-ID NO1的DNA序列表达序列盒可以在，例如，其它的细菌，在酵母，真菌，藻类，植物细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞中被表达。
由本发明的表达序列盒所表达的二氢乳清酸酶蛋白，特别适合用于寻找二氢乳清酸酶-特异性的抑制剂。
为此，可以分别在被检测的活性成分存在或不存在时对二氢乳清酸酶进行酶的测试，确定二氢乳清酸酶的活性，通过比较两种条件下的酶活性，可以对被检测的活性成分的抑制行为作出定性和定量的分析。
从Mazus和Buchowicz(Acta Biochimica Polonica(1968)，15(4)，317-325)的方法发展来的，迄今为止用于测定二氢乳清酸酶活性的酶测定方法，是基于在280nm下检测二氢乳清酸-脱氢酶-耦合反应混合物中乳清酸的形成。这一检验方法不适于大量筛选，将这一方法修改为在340nm下检测NADH的形成。做这个实验，需要一种高活力的辅助酶，即二氢乳清酸脱氢酶。一种商品化的来自乳氰酸发酵杆菌的制备产品(Sigma)纯度太差以至无法检测到NADH的形成，为了能够进行大量的筛选，特异性二氢乳清酸脱氢酶的活性必须至少比市售产品高十倍。这样高的活性可以通过分离出植物二氢乳清酸脱氢酶并使之在酵母(酿酒酵母)中表达来获得。这就是为什么测试系统是在耦合的植物二氢乳清酸酶和二氢乳清酸脱氢酶的基础发展而来。为此，例如，分离出编码鼠耳芥二氢乳清酸/脱氢酶的基因(参见Genebank Acc.No x62909，Minet等，Plant J.(1992)，2(3)，417-422；
本发明还涉及一种方法，用于鉴定具有除草活性的物质，这种物质能够抑制植物的二氢乳清酸酶活性，方法包括以下步骤a)产生转基因的植物，植物组织或植物细胞，它们包含一段附加的DNA序列，这段序列编码具有二氢乳清酸酶活性的酶并且能够过表达有酶活力的二氢乳清酸酶；b)将一种物质作用于转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分，以及作用于未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分；c)确定转基因的和未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分被应用了化学物质后的生长和成活率；以及d)比较转基因的和未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分被应用了化学物质后的生长和成活率。
未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率受抑制，而转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率没有受到抑制，这说明了b)中的物质表现出除草的活性，抑制了植物的二氢乳清酸酶的活性。
本发明还涉及一种方法，用以去除不需要的植被，它包括用化合物处理植物，这种化合物能特异性与二氢乳清酸酶结合并且抑制它的功能，二氢乳清酸酶是由SEQ-ID NO1所示的DNA序列或与这段序列杂交的一段DNA序列编码得到。
本发明还涉及具有除草活性的化合物，它们可以通过上文描述的检测系统进行鉴定。
具有除草活性的二氢乳清酸酶抑制剂可以被用作脱叶剂，干燥剂，稻草杀剂，尤其是可用作杂草杀剂。杂草，从广义上来讲，是指生长在不被需要的地方的所有植物。根据本发明中的检测系统发现，活性成分是作为完全性的杀草剂还是作为选择性的除草剂主要取决于所使用的数量。
例如，具有除草活性的二氢乳清酸酶抑制剂可以抗以下杂草双子叶的杂草类白芥属，独行菜属，猪殃殃属，繁缕属，母菊属，春黄菊属，牛膝菊属，藜属，荨麻属，千里光属，苋属，马齿苋属，苍耳属，旋花属，番薯属，琴属，田菁属，豚草属，蓟属，飞廉属，苦苣菜属，茄属，焊菜属，节节菜属，球梳霉属，野芝麻属，婆婆纳属，苘麻属，Emex，曼陀罗属，黄鼠狼花属，罂粟属，矢车菊属，三叶草属，毛莨属，蒲公英属。
单子叶的杂草类稗属，狗尾草属，黍属，马唐属，梯牧草属，早熟禾属，羊茅属，蟋蟀草属，臂刊草属，黑麦草属，雀麦属，燕麦属，莎草属，蜀黍、高粱属，冰草属，绊根草属，雨久花属，飘拂草属，慈茹属，荸荠属，莞草属，雀稗属，鸭嘴草属，尖瓣花属，龙爪茅属，剪股颖属，春麦娘属，Apera。
本发明也涉及表达序列盒，它们的序列编码一种多块茎茄属植物的二氢乳清酸酶或它的功能等同物。这段核酸序列可以是，如DNA或cDNA序列。
另外，本发明的表达序列盒中包含调节核酸序列，它们支配着宿主细胞的编码序列的表达。根据优选的实施方例，本发明的表达序列盒包括上游，即5′-端的编码序列，一个启动子和下游，即3′-端的聚腺苷酸化作用的信号，以及如果适当的话，还包括位于它们之间的且与编码序列如二氢乳清酸酶基因可操纵性地连接的其它调节元件，。可操纵性地连接的含义是指启动子、编码序列、终止子，以及如果适当的话，其它的调节元件，按照一定的顺序排列，以便在编码序列进行表达时，每一个调节元件能够各尽其能。
本发明的表达序列盒是通过适当的启动子与适当的二氢乳清酸酶DNA序列和聚腺苷酸化作用的信号融合在一起得到的，采用的技术是常规的重组和克隆技术，例如见T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Assoc.And Wiley-Interscience(1987).
马铃薯与鼠耳芥两种植物中二氢乳清酸酶的同源序列在蛋白质水平上具有78％的同一性，该同源性利用程序BLASTP分析获得(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25，3389-3402)，参见实施例2。
本发明也涉及功能等同的DNA序列，它编码二氢乳清酸酶基因并且在整个基因的长度内与SEQ-ID NO1所示序列显示出40-100％的序列同一性。
本发明优选的功能等同的DNA序列是编码二氢乳清酸酶基因的，并在整个基因的长度内与SEQ-ID NO1所示序列显示出60-100％的序列同一性。
本发明更优选的功能等同的DNA序列是编码二氢乳清酸酶基因的，并在整个基因的长度内与SEQ-ID NO1所示序列显示出80-100％的同源性。
本发明中，虽然编码二氢乳清酸酶基因的功能等同DNA序列的核苷酸序列发生了改变，但仍具有所需要的功能。因此功能等同序列包括了这里所述序列的自然发生的变异体，也包括合成的，如化学合成，根据植物中实际使用的特定密码子进行改造得到的人造核苷酸序列。
功能等同序列也可以指，具体的来说，原始分离出的二氢乳清酸酶-编码序列的自然或人工的突变体，它仍具有所需要的功能。突变作用包括取代、加入，删除，交换或者插入一个或几个核苷酸残基。因此，举例来说，本发明也包括对这个核苷酸序列修饰后得到的那些核苷酸序列。修饰的目的可以是如界定所包含的编码序列，或者，插入更多的限制性酶切位点。
功能等同序列也可以是这样的变异体，它们的功能比原始基因或基因片断的功能更弱或更强。
另外，本发明的表达序列盒也可应用于转化细菌，蓝细菌，酵母，丝状真菌和藻类，以生产出充足的二氢乳清酸酶。
本发明还涉及一种具有如SEQ-ID NO2所示的氨基酸序列的马铃薯蛋白质，或者这个蛋白具有二氢乳清酸酶活性的衍生蛋白或部分蛋白。同鼠耳芥二氢乳清酸酶相比，在氨基酸水平上达到78％序列同一性。
本发明也涉及具有二氢乳清酸酶活性的植物蛋白质，与马铃薯二氢乳清酸酶在氨基酸水平上达到20-100％序列同一性。
优先的具有二氢乳清酸酶活性的植物蛋白，是那些与马铃薯二氢乳清酸酶在氨基酸水平上达到50-100％序列同一性的蛋白质。
更优选的具有二氢乳清酸酶活性的植物蛋白，是那些与马铃薯二氢乳清酸酶在氨基酸水平上达到80-100％序列的蛋白质。
本发明的另一个目的是在植物中过表达二氢乳清酸酶基因，以产生可以耐受二氢乳清酸酶抑制剂的植物。
在植物中过表达如SEQ-ID NO1所示的二氢乳清酸酶-编码基因的序列可以导致对二氢乳清酸酶抑制剂的抗性增加。本发明也涉及由此产生的转基因植物。
转基因后被表达的二氢乳清酸酶基因的表达功效，可以通过芽分裂组织的繁殖或发芽试验来测定。而且二氢乳清酸酶基因的表达类型和表达水平发生的变化，以及这一变化对二氢乳清酸酶抑制剂的抗性效应的影响，可以从温室实验中的实验植物检测出来。
本发明还涉及转基因植物，它们是由本发明中具有SEQ-ID NO1序列的表达序列盒转化得到，由于SEQ-ID NO1序列的附加的表达使得这些植物能够耐受二氢乳清酸酶抑制剂的作用，本发明还涉及这种植物的转基因的细胞，组织，部分以及繁殖材料。特别优选的转基因作物有，如大麦，小麦，黑麦，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，烟草，西红柿，油菜籽，紫花苜蓿，莴苣以及各种树木，坚果，葡萄，豆类。
本发明还涉及这样的植物，序列SEQ-ID NO1在植物中表达之后，显示出UMP含量增加的植物。
为了本发明的目的增加尿嘧啶-5′-磷酸的含量，意味着通过与至少一代的非遗传工程化的植物相比，植物的二氢乳清酸酶基因的功能性过表达所显示出来的人为地获得了的增加UMP生物合成的能力。
特别优选的序列是那些能够确保定向进入质外体，质体，液泡，线粒体或内质网的序列，或者那些，由于缺少适当的操纵序列，能够确保产物以隔离的形势保留在胞液中的序列(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)。
例如，可以将植物的表达序列盒整合到烟草转化载体pBinAR上(参见适用于本发明表达序列盒的启动子，原则上，是任何能够调控外源基因在植物中进行表达的启动子。具体来说，优先选用植物的启动子或从植物病毒衍生的启动子，特别优选的是烟草花叶病毒CaMV 32S启动子(Frank等，细胞21(1980)，285-294)。这个启动子包含转录效应子的各种识别序列，转录效应子从整体上导致引入基因的永久表达和组成型表达(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
本发明的表达序列盒也可以包含一个化学诱导的启动子，它能够使得外源二氢乳清酸酶基因在植物中的表达被控制在一个特定的时间点。这样的启动子例如PRP1启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.(1993)22，361-366)，水杨酸诱导的启动子(WO 95/1919443)，苯磺酰胺诱导的启动子(EP388186)，四环素诱导的启动子(Gatz等，Plant J.(1992)2，397-404)，脱叶酸诱导的启动子(EP 0335528)，乙醇或环己酮诱导的启动子(WO93/21334)，在文献中都有描述而且可以应用。
而且，特别优选的启动子，是那些能够在进行嘌呤或其前体物生物合成的植物组织或部分，确保表达的启动子，尤其是能够确保叶片特异性表达的启动子，如马铃薯胞液果糖二磷酸酶启动子或马铃薯ST-LST启动子(Stockhaus等，EMBO J.，(1989)8，2445-251[sic])。
利用种子特异性启动子，外源蛋白可以在转基因烟草的种子中稳定的被表达，并且其含量占全部可溶性种子蛋白质的0.67％(Fiedler and Conrad，Bio/Technology(1995)10，1090-1094)。因此本发明的表达序列盒可以包含一个种子特异性启动子(优选云扁豆蛋白启动子，USP或LEB4启动子)，LEB4信号肽，被表达的基因，以及一个内质网保持信号。
编码二氢乳清酸酶的插入核苷酸序列可以通过合成产生，或者从天然获得，或者由合成的或天然的DNA组分混合形成。通常，所生产的合成核苷酸序列含有植物中的优势密码子，这类密码子可以通过在大多数所研究的植物种类中具有最高表达频率的蛋白质所对应的密码子来确定。
在准备表达序列盒时，为了获得能够以正确的方向方便阅读并且配有一个正确的阅读框的一段核苷酸序列，可以利用各种DNA片断，为使DNA片断彼此相连，可以将接合体或接头接到片断上。
其它适用的DNA序列可以是人工构建的DNA序列，如以上实例所描述的，只要它们能够调节所需要的特性，即通过农作物植物的二氢乳清酸酶基因的过表达来增加植物中UMP的含量。这样的人工DNA序列，可以通过由分子模型构建的显示二氢乳清酸酶活性的蛋白的反翻译确定，或者通过体外筛选来确定。特别适用的序列是编码DNA序列，它们是按实际使用的宿主-植物-特异性密码子从多肽序列反翻译得到的DNA序列。熟悉植物基因工程的技术人员可以很容易通过计算机评估其它的被转化植物的已知基因，测定出实际使用的特定密码子。
本发明的其它适用的等同核酸序列可以是编码融合蛋白的序列，融合蛋白其中的一个组分是植物二氢乳清酸酶多肽，或者是二氢乳清酸酶多肽的一部分功能性等同体。融合蛋白的第二部分可以是其它具有酶活力的多肽，或是抗原多肽序列，借助它可以用来检测二氢乳清酸酶的表达(如myc-tag或his-tag)。然而，它优选为一个调节蛋白序列，如，信号肽或转移肽，它们能够将二氢乳清酸酶蛋白引导至所需要的作用位点。
本发明的启动子区和终止子区最好应该，沿着转录的方向，配备一个接头或多接头，接头中包含一个或多个用于插入序列的限制性酶切位点。一般来说，接头具有1-10，多数是1-8，最好是2-6个限制性位点。通常，调节区内的接头小于100bp，常见的是小于60bp，但是至少是5bp。本发明的启动子可以是来自宿主，或与宿主同源的，也可以是外来的与宿主异源的启动子。本发明的表达序列盒由，沿着5′-3′转录方向，本发明的启动子，任一指示转录终止的序列和区域组成。各种终止区可以根据需要彼此进行交换。
可以通过操纵来提供适当的限制性酶切位点，或者除去多余的DNA或多余的限制性酶切位点。在适于进行插入、删除、取代，包括转换和颠换的情况下，也可以使用体外诱变，初始修复，限制性作用或连接作用。在使用如限制性作用、回嚼(chewing back)、或填补平末端的悬垂部分这些操纵作用时，可利用片断的互补性末端来连接片断。
优选的聚腺苷酸化作用信号是植物聚腺苷酸化作用信号，尤其是那些实质上与根癌土壤杆菌T-DNA聚腺苷酸化作用信号相一致的信号，具体包括Ti质粒p TiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)835 ff)中T-DNA(章鱼肉碱合成酶)的基因3，或者它的功能等同基因。
为了以二氢乳清酸酶编码DNA转化宿主植物，本发明的表达序列盒采取如插入的方式整合到重组载体，载体DNA包含附加的功能调节信号，例如用来复制或整合的序列。适用的载体在“植物分子生物学和生物技术方法”(CRC Press)，Chapter 6/7，pp.71-119，一文中有描述。
将外来基因转移到植物的基因组称为转化作用。利用上述的方法将用于暂时的或稳定的转化作用的植物组织和细胞进行转化，并且再生出植株。适用的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA吸收的原生质体转化法，，利用基因枪的生物弹射学法，电穿孔法，DNA溶液中的干胚胎诱导法，显微注射法，以及土壤杆菌介导的基因转移法。以上方法的描述参见B.Jenes等，基因转移技术(Techniques for Gene Transfer)in转基因植物(TransgenicPlants)，Vol.1，工程和应用(Engineering and Utillization)，edited byS.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225).将被表达的构建体优先克隆到适于转化根癌土壤杆菌的载体，如pBin19中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
利用本发明表达序列盒转化的土壤杆菌，同样可以被用来去转化植物，尤其是农作物包括谷类，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，烟草，西红柿，油菜籽，紫花苜蓿，莴苣，以及各种树木，坚果，葡萄，豆类。转化的方法是，如将受伤的叶片或叶片的一部分浸泡在土壤杆菌的悬浮液种，然后在适当的培养基中进行培养。
嘧啶的合成部位一般是在叶片组织，所以二氢乳清酸酶的叶片-特异性表达很有用处。然而，很明显嘧啶的生物合成不必被限制在叶片组织，而是以组织特异性的方式，可以在植物所有其它的部分发生，如在富含脂肪的种子里。
而且外源二氢乳清酸酶基因的组成型表达是有利的，另一方面，也需要诱导性表达。
利用上述的重组和克隆技术，本发明的表达序列盒可以被克隆到适当的载体，并使它得到复制，如克隆到大肠杆菌。适用的克隆载体包括有pBR332，pUC系列，M13mp系列，和pACYC184。特别适用的载体是在大肠杆菌和土壤杆菌中都能够进行复制的二元载体。
本发明还涉及利用本发明的表达序列盒来转化植物，植物细胞，植物的组织或植物的一部分。本发明首选的目标是提高植物中的二氢乳清酸酶的含量。
根据启动子的选择不同，表达可以特异性发生在叶片，种子或植物的其它部位。这样的转基因植物，它们的繁殖材料以及它们的植物细胞、组织或部分也是本发明的研究主题。
利用下面实施例对本发明进行说明，但不限于此实施例应用实施例所依据的遗传工程方法普通克隆方法克隆方法，举例来说包括限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳，DNA片断的纯化，核酸转移到硝化纤维和尼龙膜，连接DNA片断，埃希氏大肠杆菌细胞的转化，细菌培养，以及重组DNA的序列分析，这些方法可以按照Sambrook等的描述进行操作(Sambrook等(1994)Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0-87969-309-6)。
重组DNA的序列分析可以利用ABI激光荧光DNA序列分析仪按照Sanger等的方法对重组DNA分子进行测序(Sanger等，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)。由聚合酶链反应所得片断要进行测序和校对，以避免在被表达的构建体中发生聚合酶错误。
实施例1编码一种功能性的植物二氢乳清酸酶的cDNA的分离利用大肠杆菌突变体的功能互补作用，从马铃薯中获得了编码二氢乳清酸酶的一个克隆。所用的突变体是大肠杆菌遗传保藏中心的突变株CGSC5152(CS101-2U5)，它在编码二氢乳清酸酶的pyrC基因位点发生突变。互补作用是通过用载体质粒pBS SK-中的cDNA文库对菌株CGSC5152的感受态细胞进行电转化而实现。按照标准的程序，以间接的方式利用EcoRI/NotI接头克隆出基本的lambda ZAPII文库(Stratagene)，并从叶子(sink leave)中分离出cDNA的RNA模板(小1-cm-叶片来自生长于温室中10周龄的马铃薯)。
将转化的大肠杆菌细胞涂布在M9基本培养基中(Sambrook等，1989)，在培养基中补充了甲硫氨酸(20mg/l)，氨卞青霉素(100mg/l)，和异丙基硫代半乳糖苷IPTG(2.5mM)。总体上，在8批实验中转化了4μg的基因文库，产生36个克隆，随后利用限制性酶切进行检测，证明这些克隆是一样的。
实施例2编码具有二氢乳清酸酶活性蛋白质的cDNA克隆体的序列分析获得的36个cDNA克隆体能够编码一种多肽，与其它生物的二氢乳清酸酶具有同源性，同源性分析利用程序BLASTP(Altschul等，Nucleic AcidsRes.(1997)25，3389-3402)进行。因此，此蛋白与鼠耳芥二氢乳清酸酶具有78％的同一性，与集胞蓝细菌二氢乳清酸酶具有58％的同一性，与大肠杆菌和恶臭假单胞菌二氢乳清酸酶具有55％的同一性。其中最长的克隆体被命名为pyrCSt5，质粒被命名为pBBSK-pyrCSt5。cDNA(参见SEQ-ID NO2)具有一个开放的阅读框，它由1046个碱基对组成，一个终止密码子位于1047-1049。氨基酸序列开始于阅读框的第三个碱基，并能够被翻译成348氨基酸长度的多肽(参见SEQ-ID NO2)，这一长度与原核生物的二氢乳清酸酶-编码序列的长度相符合。
由于本序列cDNA的阅读框，不能确切的推断cDNA是存在于质体中，还是胞质中。
实施例3植物表达序列盒的产生将一个35S CaMV启动予以EcoRI-KpnI片断的形式(对应于烟草花叶病毒核苷酸6909-7437(Franck等，Cell 21(1980)，285)插入到质粒pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1980)，8711)。从Ti-质粒pTiACH5(Gielen等，EMBOJ.3(1984)，838)分离出T-DNA的基因3的聚腺苷酸化作用信号成为PvuII-HindIII片断，接上SphI接头后，将其克隆到载体的位于SphI-HindIII酶切位点之间的PvuII酶切位点，这样就得到质粒pBinAR(Hofgen and Willmitzer，植物科学(Plant Science)66 19199010，221-230)。通过Asp718酶切位点(964bp的内在酶切位点)和BamHI酶切位点(来自聚和接头)将pyrCSt5构建体以反义方向克隆到pBinAR。
实施例4转基因马铃薯植物的产生马铃薯植物(cv.solara)的转化，是利用相应的构建体pBinAR-anti-pyrCSt5借助于根癌土壤杆菌进行的。先将质粒转化进入根癌土壤杆菌C58C1pGV2260(Deblaere等，Nucl.Acids Res.13(1984)，4777-4788)。通过Pocha-Sosa等(EMBO J.，8(1998)，2-29)的方法转化马铃薯，要使用1∶50在Murashige-Skong培养基(植物生理学，15(1962)，473)中过夜培养的阳性转化的土壤杆菌克隆稀释溶液。将无菌的植物小圆叶片(约1cm2)置于装有1∶50的土壤杆菌的稀释液培养皿中培养5-10分钟，然后转移到MS培养基，在黑暗中20℃培养2天之后，以16小时有光/8小时无光的光周期继续培养。为了进行发芽诱导，每周一次将外植体转换到补充有500mg/l claforan(头孢噻肟-钠)，50mg/l卡那霉素和植物激素(Rocha-Sosa等，EMBO J.，8，23-29，1989)，1.6g/l葡萄糖的MS培养基中。长出的发芽体转换到补充有2％蔗糖，250mg/l claforan，细菌培养用琼脂(Bacto-agar)的MS培养基中。
从补充卡那霉素和claforan的2MS培养基中得到生成的发芽体，生出根之后将其转移到土壤中；在16小时有光/8小时无光的光周期，空气湿度为50％的可调控的环境中培养2周后，对外源基因的表达，代谢物含量和表型生长特征的变化进行检测。核苷酸含量的变化可以通过Stitt等方法来测定(FEBS Letters，145(1982)，217-222)。
实施例5植物组织全RNA的分析按照Logemann等，Anal.Biochem.163(1987)，21说明的方法分离植物组织的全RNA，为了进行分析，每次将20微克RNA在含有甲醛的1.5％的强化琼脂凝胶中分离，再转移到Duralon紫外膜上(Stratagene)。
为检测特异性的转录，首先利用PCR技术按照操作说明制备用于杂交反应的digoxygenine-标记探针(DIG EasyHyb，Boehringer)；然后，将膜在60℃的洗涤缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)中洗三次，每次20分钟，利用以CDP-STAR为底物的Boehringer DIG检测系统，通过暴露于Hyperfilm ECL(Amersham)上的膜的发光现象进行检测。
附图3显示了测试的转基因植物的RNA含量，其中包括ROSa系-34，-31，-10，-19，-9和-3。一条大小为1.6kb可识别的带即是所要的二氢乳清酶转录产物，而在ROSa-3，-9，31，-34中，具有大小为1.1kb的反义转录产物。尤其在ROSa-9中还发现RNA含量显著减少。
实施例6块茎和叶片组织中马铃薯二氢乳清酸酶的检测为产生抗二氢乳清酸酶多肽的多克隆血清，需要从马铃薯二氢乳清酸酶氨基酸序列中筛选一个肽序列。将由商业公司(Eutogentec，Seraing，Belgium)合成的肽链LGTDSAPHDRRRKEC，通过C-末端的半胱氨酸与KLH(锁眼帽贝蛋白)接合，用此共轭体免疫兔子就得到抗此肽链的抗血清，同样由商业公司(Eutogentec)完成。在蛋白质印迹实验中，抗血清特异性地识别马铃薯多肽。为此，在变性条件下，将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移到硝酸纤维素滤膜上，然后利用免疫检测方法按照操作说明(ECL-系统，Amersham)进行检测。利用抗血清来鉴定ROSa系的转基因植物，系-3，-9，-40的叶子中显示出不同程度的蛋白质减少，见附图2。植株-40没有形成块茎，植株-30和-9的块茎中也显示出二氢乳清酸酶蛋白数量相应地大大减少。
实施例7转基因植物的表型分析对携带一个二氢乳清酸酶反义构建体ROSa系植物的特征进行了详细研究，表明植株都有不同程度的生长延迟。其中ROSa系-40受到较大影响以至没有块茎形成；这个系的植株在温室中不能成活，必须在体外进行培植。可以发现生长延迟和二氢乳清酸酶蛋白数量减少之间具有相关性，这种明确的相关性无疑说明马铃薯二氢乳清酸酶可作为除草剂活性成分的新靶蛋白。
实施例8大肠杆菌的过表达载体的产生下列寡聚核苷酸序列是从已测定的序列衍生得到，它具有一个BamHI酶切位点和两个悬垂的碱基。
5′-引物aaggatccGCAAAAATGGAGCTCTCA3′-引物aaggatccTCAGAGAGGAGCCGGCAACPCR反应混合物包含有8ng/μl pBSSk-pyrCSt5 DNA，0.5μM相应的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。扩增条件如下变性温度92℃，1分钟解链温度52℃，1分钟延伸温度72℃，2.5分钟循环次数30PCR片断通过BamHI酶切位点被克隆到过表达载体pQE9，经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导后，进行蛋白质合成，IPTG诱导的方法为常规方法(参见HandbuchThe QiaExpressionist，Qiagen，Hilden)。
实施例9测定二氢乳清酸酶活性的检测系统迄今用子测定二氢乳清酸酶活性的酶检测方法，是从Mazus和Buchowicz(Acta Biochimica Polonica(1986)，15(4)，317-325)的方法发展而来，其根据是在280nm下，检测二氢乳清酸-脱氢酶-耦联反应混合物中乳清酸的形成。先决条件是具有一种高活性的辅助酶，即二氢乳清酸脱氢酶。商品化的来自于乳清酸发酵杆菌(Sigma)的此酶制备物已被证明含有较多的杂质。
为了能够进行大量的筛选，特异性的二氢乳清酸脱氢酶的活力必须比商品化的制备物的酶活力至少高10倍。可以先克隆植物的二氢乳清酸脱氢酶，使之在酵母(酿酒酵母)中进行表达，然后从肥厚脉胞菌(R.W.Miller，酶学方法LI，1978，63-69)中制备二氢乳清酸脱氢酶可以获得这样高的酶活力。对测试系统的进一步修正是在340nm下进行测定。
首先，分离鼠耳芥的二氢乳清酸脱氢酶(参见Genebank Acc No.X62909，Minet等，Plant J.(1992)，2(3)，417-422)。
下列寡聚核苷酸序列是从数据库中记录的二氢乳清酸脱氢酶序列衍生得到5′-引物aaggatccatggccggaagggctg3′-引物aaggatccttagtggtggtggtggtggtgtttgtgggatggggcPCR反应混合物包含10ng的质粒DNA(得自载体pFL61(ATCC 77600)中的鼠耳芥cDNA)，，0.5microM[sic]相应的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3 在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。扩增条件如下变性温度92℃，0.5分钟解链温度60℃，0.5分钟延伸温度72℃，1.5分钟循环次数35将获得的PCR片断首先经BamHI酶切位点克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，所产生的构建体命名为pYES2-pyrDAt。
实施例10从烟草中克隆植物二氢乳清酸脱氢酶如实施例9说明的PCR片断被用于烟草噬菌体cDNA文库的异源基因的筛选，用于产生烟草噬菌体cDNA文库的cDNA来自于悬浮培养的烟草细胞的RNA，按照操作说明(Stratagene)制备此cDNA文库。将具有烟草cDNA文库的3.0×105个lambda噬菌体涂布于琼脂平板上，琼脂平板上的细菌菌株是大肠杆菌XLI-Blue。
根据标准方法(Sambrook等，(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0＝87969-309-6)，将噬菌体DNA转移并固定到尼龙滤膜(Duralon UV，Stratagene)上。所用的杂交探针是上述的PCR片断，按照操作说明利用标记检测系统(Boehringer，Mannheim)对它进行了DIG标记。在DIG EasyHyb(Boehringer)，42℃，膜的杂交反应进行16小时，然后在60℃用2×SSC，0.1％SDS洗涤滤膜三次，每次20分钟。利用以CDP-Star为底物的Boehringer DIG检测系统观察发光现象，表明发生正杂交的噬菌体位于Hyoerfilm ECL(Amersham)上，利用标准技术对正杂交的噬菌体进行纯化和分离。
对所得到的相同的克隆株，即克隆pyrDT10进行完全地测序(SEQ-IDNO3)。经过EcoRI消化，得到一段1962个碱基对的EcoRI片断，此片断具有一个由458个氨基酸组成的开放阅读框，起始密码子位于305-307碱基，终止密码子位于1679-1681碱基。从烟草二氢乳清酸脱氢酶推导出的氨基酸序列(SEQ-ID NO4)与鼠耳芥的氨基酸序列显示出72％同一性，与大鼠的氨基酸序列显示出51％同一性，与酵母的氨基酸序列显示出43％同一性，与大肠杆菌的氨基酸序列显示出37％同一性，采用程序BLASTP(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25，3389-3402)对同一性进行分析。
下列寡聚核苷酸序列是从已测定的序列衍生得到，它具有一个KpnI酶切位点和两个悬垂的碱基5′-引物ggggtaccatgagacaaagggttggatt3′-引物ggggtaccttagtggtggtggtggtggtggagaggagccggcaaccaPCR反应混合物包含有5ng/μl pBSSk-pyrDT10 DNA，0.5μM相应的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。扩增条件如下变性温度92℃，1分钟解链温度52℃，1分钟延伸温度72℃，2.5分钟循环次数30将烟草二氢乳清酸脱氢酶的PCR片断经KpnI酶切位点克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，再将此构建体(pYES-pyrDY10)和鼠耳芥二氢乳清酸脱氢酶的构建体pYES2-pyrDAt互补地插入到ural酵母变种(Miner等，Gene(1992)，121(2)，393-6)中。将所得到的酵母克隆体接种到含有半乳糖的液体完全培养基中培养过夜。
实施例11
植物二氢乳清酸酶和二氢乳清酸脱氢酶的分离及二氢乳清酸酶的活性测定利用French Press的压力破碎法在20ml的加压容器，最大压力下，或借助玻璃球磨碎机(IMA Desintegrator)，对二氢乳清酸酶大肠杆菌表达培养物，以及含有烟草(或拟南芥属)二氢乳清酸脱氢酶的酵母表达培养物分别进行破碎。每1g的细胞球，使用10ml的缓冲液(0.1M KH2PO4，；pH 7.5；0.4M蔗糖；0.1mM DTT)。在细胞球中加入2.5倍体积的玻璃珠(d＝0.5mm)，然后放置于玻璃球磨碎机里，4℃，2500rpm，20分钟，使细胞球破碎；在4℃下，100,000g离心20分钟；利用光度计(Uvikon 933，Kontron)在340nm下进行光度分析来测定酶活力。筛选过表达载体，可以使二氢乳清酸酶和二氢乳清酸脱氢酶得到纯化，在自然条件下如果细胞破碎缓冲液中不含DTT(cf.Also HandbuchThe Qiaexpressionist，Qigen，Hilden)，利用组氨酸锚蛋白按照标准方法一步就可以完成。将洗出液透析到成分发生改换的缓冲液20mM的磷酸钾缓冲液pH6.1；5mM MgCl2；1mMDTT；10mM半胱氨酸；10μM ZnCl2；20μM NAD。每次将所得到的10-100μl的酶片断用缓冲液补加到700μl并进行测定，与之相对比的对照细胞包含700μl的反应缓冲液和100μl的未转化的大肠杆菌培养物的蛋白质匀浆。加入7mM的氨甲酰天冬氨酸启动反应。使用相同数量的总蛋白来测定未转化或转化大肠杆菌的抽提物。除了应用在酵母中被表达的植物二氢乳清酸脱氢酶活力之外，还可以应用从肥厚脉胞霉制备的二氢乳清酸脱氢酶活力，见R.W.Miller，二氢乳清酸脱氢酶活性，(in酶学方法(Methods inEnzymology)51(1978)，63-69)。
或者，可以利用Prescott和Jones的方法(Anal.Biochem.(1969)32，408-419)，通过敏感度较差的比色实验来测定二氢乳清酸酶，不需要耦联二氢乳清酸脱氢酶。为此，将二氢乳清酸酶在50mMTris-HCl，1mM二氢乳清酸中于37℃下进行反应，通过检测氨甲酰天冬氨酸的形成测定二氢乳清酸酶的活性。先决条件是制备的蛋白质具有较高的酶活力，这一点已经在本通过所描述的测试系统测定的马铃薯二氢乳清酸酶的酶活力，可以使用已知的二氢乳清酸酶抑制子使之减少，如6-L硫代二氢乳清酸盐，2-氧代-1，2，3，6-四氢嘧啶-4，6-二羧酸盐(Christopherson等，生物化学社会学报(Biochemical Society Transactions)23888-893，1995)。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>植物二氢乳清酸酶<130>NAE953-99<140><141><160>4<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1271<212>DNA<213>马铃薯<220><221>CDS<222>(9)..(1046)<400>1ttgcaaaa atg gag ctc tca atc aca caa cct gat gat tgg cat ctt cat 50Met Glu Leu Ser Ile Thr Gln Pro Asp Asp Trp His Leu His15 10ctc cgt gat ggt gat gtt ctt aag gca gtt gtc tct cac agt gca cat 98Leu Arg Asp Gly Asp Val Leu Lys Ala Val Val Ser His Ser Ala His15 20 25 30cac ttt ggg agg gca ata gtc atg cca aat ttg aag cct cct atc act 146His Phe Gly Arg Ala Ile Val Met Pro Asn Leu Lys Pro Pro Ile Thr35 4045acc act gct gct gct gta gca tac cgg gag gcg ata ttg aaa tct tta 194Thr Thr Ala Ala Ala Val Ala Tyr Arg Glu Ala Ile Leu Lys Ser Leu50 55 60cct gtt gat agt gat ttc aac cct ctt atg aca ctt tat ttg aca gat 242Pro Val Asp Ser Asp Phe Asn Pro Leu Met Thr Leu Tyr Leu Thr Asp65 70 75aca acc agt cct atg gaa atc aaa cta gca aga gag agc cag gtc gta 290Thr Thr Ser Pro Met Glu Ile Lys Leu Ala Arg Glu Ser Gln Val Val80 85 90ttt ggg gtg aag ttg tac cct gct ggt 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445Ile Ser Glu Ala Val Gly Ala Asp Cys Arg450 45权利要求
1.包含植物二氢乳清酸酶编码区的一段DNA序列，其中这段DNA序列的核苷酸序列如SEQ-ID NO1所示。
2.一段DNA序列，它是与如权利要求1所述的DNA序列SEQ-ID NO1进行杂交的序列，或者是此序列的一部分，或者是通过插入、删除和取代作用从此序列衍生得到的衍生体，而且编码具有二氢乳清酸酶生物活性的蛋白。
3.具有二氢乳清酸酶活性的蛋白质，它包含的氨基酸序列至少具有100个氨基酸且构成SEQ-ID NO2亚序列。
4.如权利要求3所述的蛋白质，它包含的氨基酸序列是如SEQ-ID NO2所示序列的50-300亚序列。
5.如权利要求4所述的蛋白质，它包含的氨基酸序列是如SEQ-ID NO2所示序列。
6.如权利要求1和2所述的DNA序列的应用，可将它们引入原核或真核细胞，这个序列可选择性与调节元件连接以确保细胞中的转录和翻译得以进行，并且这个序列可以引起可转录mRNA的表达，进而合成二氢乳清酸酶。
7.如权利要求1和2所述的DNA序列的应用，产生一个测试系统用以鉴定除草活性的二氢乳清酸酶的抑制剂。
8.编码二氢乳清酸酶的DNA序列SEQ-ID NO1和编码二氢乳清酸脱氢酶的DNA序列SEQ-ID NO3的应用，产生一个测试系统用以鉴定除草活性的二氢乳清酸酶的抑制剂。
9.一种用于寻找抑制植物二氢乳清酸酶活性的物质的方法，它包括第一步利用如权利要求1和2所述的DNA序列产生二氢乳清酸酶；第二步在检测物质存在时测定植物二氢乳清酸酶活性。
10.一种如权利要求9所述的方法，其中以高产量筛选(HTS)的方式进行植物二氢乳清酸酶的测定。
11.鉴定除草活性物质的方法，这种物质能够抑制植物的二氢乳清酸酶活性，包括以下步骤a)产生转基因的植物，植物组织或植物细胞，它们包含一段附加的DNA序列，这段序列编码具有二氢乳清酸酶活性的酶并且能够过表达有酶活力的二氢乳清酸酶；b)将一种物质作用于转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分，以及作用于未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分；c)确定转基因的和未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分被应用了该化学物质后的生长和成活率；以及d)比较转基因的和未经转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分被应用了化学物质后的生长和成活率。未转化的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率受抑制，而转基因的植物，植物细胞，植物组织或植物部分的生长和成活率没有受到显著抑制，这说明了b)中的物质表现出除草的活性，抑制了植物的二氢乳清酸酶的活性。
12.一种测试系统，它依据如权利要求1或2所述的DNA序列SEQ-IDNO1的表达，用于鉴定除草活性的二氢乳清酸酶的抑制剂。
13.一种测试系统，它依据DNA序列SEQ-ID NO1和DNA序列SEQ-IDNO3的表达，用于鉴定除草活性的二氢乳清酸酶的抑制剂。
14.如权利要求12和13所述的一种测试系统用于鉴定植物二氢乳清酸酶的抑制剂，它包括将酶与所研究的检测物质进行反应，经过适当的反应时间之后，测定此酶的酶活性，并且同未受抑制的酶的活性进行比较。
15.一种植物二氢乳清酸酶抑制剂。
16.一种植物二氢乳清酸抑制剂，利用如权利要求12，13和14所述的任一种测试系统进行鉴定。
17.如权利要求15或16所述的被鉴定的抑制剂，它可用作除草剂。
18.一种清除不需要的植被的方法，它包括用一种化合物处理要被清除的植物，此化合物特异性地与二氢乳氢酸酶结合并且抑制它的功能，其中二氢乳氢酸酶是由如权利要求1或2所述的DNA序列编码。
全文摘要
本发明涉及能够编码具有二氢乳氢酸酶(EC 3.5.2.3)活性的多肽的DNA,而且,本发明涉及利用此核酸产生一个测试系统。
文档编号C12N15/09GK1372596SQ00812547
公开日2002年10月2日 申请日期2000年9月2日 优先权日1999年9月7日
发明者T·埃尔哈德特, J·莱尔希尔, M·施蒂特奈杰尔, R·瑞恩尔, M·施罗德 申请人:巴斯福股份公司