专利名称：一种用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用酶促显色反应快速检测样品中过氧化氢含量的酶试纸，属于生物技术领域酶法分析领域。
背景技术：
过氧化氢，俗称双氧水，在搅动和光照等条件下可以分解为水和氧气，具有极强的氧化性和腐蚀性，因而被广泛地用作食品的消毒剂和漂白剂。按照我国《食品添加剂使用卫生标准》的规定，允许食品级双氧水在食品生产中作为加工助剂使用，但在制成成品前应设法清除，并严格控制残留。食品中过氧化氢地残留过高，会对人体造成严重伤害，如损伤消化道、导致癌变、加速人体衰老、诱发心血管疾病等，同时还会因杀死消化道中的有益细菌，而引起肠道功能紊乱等。目前在食品过氧化氢残留上的另一个严峻问题是市场上许多不法分子滥用过氧化氢来漂白牛百叶、凤爪和竹笋等水发食品，甚至还用来漂白和消除变质海产品的异味等。过氧化氢在食品加工尤其是保存上的滥用已严重危害了人们的身体健康，因此迫切需要发展一种快速、简便而灵敏的过氧化氢检测方法。
目前检测过氧化氢含量的方法很多，如利用过氧化氢在酸性溶液中能与钛离子生成橙色络合物的特性，通过比色法来测定过氧化氢含量；又有根据过氧化氢在稀硫酸溶液中能被高锰酸钾氧化生成氧气的特性来测定过氧化氢含量的方法等。但这些方法操作比较繁琐，并且需要分光光度计等专门的实验室仪器设备，因而不利于在食品工业及其它监测领域的广泛使用。
本发明的目的是在于建立一种快速、简便而灵敏的过氧化氢酶法检测技术。
发明内容
本发明是利用酶促显色反应原理，制备一种便于携带、经济适用、同时又能够快速检测样品中过氧化氢含量的酶试纸条。
本发明的酶试纸是通过带阴离子载体的吸附作用，将带正电荷的辣根过氧化物酶和显色剂同时吸附并固定在载体上的方法制备而成。该试纸可以检测到浓度低至0.5μmol/L的过氧化氢的存在。具体地说，实现本发明的技术方案是将定性滤纸等固体载体浸泡在0.5％-2.0％的羧甲基纤维素或硝酸纤维素阴离子水溶液中，充分吸胀后(当用羧甲基纤维膜或硝酸纤维膜作为固体载体时，因为这些载体本身就已有带负电的阴离子基团，如羧甲基和硝酸根基团，所以不必再用羧甲基纤维素水溶液等浸泡处理)，取出晾干，然后将纸张等固体载体浸泡在含辣根过氧化物酶和显色剂的混合溶液中，其中辣根过氧化物酶的使用浓度范围为0.01～0.10g/L，显色剂为0.020～0.10M的苯酚和0.0050～0.050M的4-氨基安替吡啉或N，N-二甲基苯胺或2，4-二氯酚或邻二苯酚。振摇60min，使得辣根过氧化物酶和显色液被共同吸附到纸张载体上，将纸张取出低温风干，剪成一定大小的试纸条，并置于密闭和避光的塑料袋中低温保存，即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。该试纸在4℃-10℃下保存30天后，仍可检测到样品中0.5μmol/L过氧化氢的存在。
按照本发明优选的方案，含有辣根过氧化物酶和显色剂的混合溶液中各组分的浓度如下苯酚0.025M、4-氨基安替吡啉0.0075M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。
按照本发明，固定载体可以是各种纤维素或其衍生物纸张，如滤纸、羧甲基纤维膜和硝酸纤维膜等。显色剂可选用苯酚和4-氨基安替吡啉的组合，或其单独与N，N-二甲基苯胺、2，4-二氯酚、邻二苯酚等组合，它们均是能使过氧化氢在过氧化物酶作用下显色的试剂。其中若选用4-氨基安替吡啉则显红色(见图1)，选用2，4-二氯酚时则显紫褐色，选用2，4-二氯酚时则显蓝色、而选用邻二苯酚则为棕红色。
有益效果本发明试纸反应响应时间为1分钟。可以方便快捷地测定样品中过氧化氢的含量。同时本发明试纸便于携带，适于流动作业。
图1是本发明实施例1中的酶试纸用于检测不同浓度过氧化氢标准水溶液的显色情况。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
制备实施例实施例1用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在1％羧甲基纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.025M、4-氨基安替吡啉0.0075M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例2用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备将羧甲基纤维膜剪成1cm×3cm大小(因为载体本身就是羧甲基纤维素，已具备带负电的阴离子基团，所以不必再浸泡在羧甲基纤维素水溶液中)，随后浸泡在20ml显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.02M、4-氨基安替吡啉0.005M、辣根过氧化氢酶0.01g/L(W/V)，四环素10mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例3用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备将硝酸纤维膜剪成1cm×3cm大小(因为载体本身就是硝酸纤维素，已具备带负电的阴离子基团，所以不必再浸泡在羧甲基纤维素水溶液中)，随后浸泡在20ml显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.10M、4-氨基安替吡啉0.05M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例4用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备将厚定性滤纸剪成1cm×3cm大小，浸泡在1％硝酸纤维素的水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干。随后浸泡在20ml显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.010M、2，4-二氯酚0.0075M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，庆大霉素50mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例5用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在1％羧甲基纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.025M、2，4-二氯酚0.005M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例6用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备将硝酸纤维膜剪成1cm×3cm大小(因为载体本身就是硝酸纤维素，已具备带负电的阴离子基团，所以不必再浸泡在羧甲基纤维素水溶液中)，随后浸泡在20ml显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.10M、2，4-二氯酚0.05M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例7用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在0.5％硝酸纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.025M、N，N-二甲基苯胺0.005M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例8用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在2％硝酸纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.025M、N，N-二甲基苯胺0.05M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例9用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在2.0％羧甲基纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.05M、N，N-二甲基苯胺0.0075M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例10用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在0.5％羧甲基纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.075M、邻二苯酚0.0075M、辣根过氧化氢酶0.075g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例11用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备将羧甲基纤维膜剪成1cm×3cm大小(因为载体本身就是羧甲基纤维素，已具备带负电的阴离子基团，所以不必再浸泡在羧甲基纤维素水溶液中)，随后浸泡在20ml显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.02M、邻二苯酚0.005M、辣根过氧化氢酶0.01g/L(W/V)，四环素10mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
实施例12用于测定过氧化氢浓度的酶试纸的制备取厚定性滤纸将其剪成1cm×3cm大小，浸泡在1％羧甲基纤维素水溶液中，浸泡约60分钟，充分吸胀后，晾干，然后将滤纸条浸泡在20ml含有显色剂和辣根过氧化物酶的混合液中，其中混合液的组成为苯酚0.025M、邻二苯酚0.05M、辣根过氧化氢酶0.025g/L(W/V)，氨苄青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震荡60分钟后，取出滤纸片，低温晾干，最后置于密闭的塑料袋中低温避光保存。即制得可用于过氧化氢浓度测定的酶试纸。
效果实施例实施例13实施例1中所制得的酶试纸用于检测过氧化氢标准水溶液和待测样品配制8μmol/L，4μmol/L，2μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L等一系列浓度的过氧化氢标准水溶液，分别用实施例1中所制成的试纸快速蘸取样品，等待1分钟后试纸呈现不同深浅的红色，其中过氧化氢浓度越高，试纸显现的红色越深。具体如图1所示。
3个待测的样品分别为广州市天河区某农贸市场摊挡上2个浸泡牛百叶的水样和1个浸泡竹笋的水样，分别用上述制成的试纸快速蘸样品，等待1分钟后观察试纸颜色，并对照标准过氧化氢溶液的显色程度即可大致确定样品中过氧化氢浓度范围。结果是其中2个浸泡牛百叶的水样中检测到有不同浓度过氧化氢的存在。
该试纸密封包装，置于冰箱中保存，30天后仍然能检测到0.5μmol/L的过氧化氢存在。
实施例14实施例4所制得的酶试纸用于检测过氧化氢标准水溶液配制8μmol/L，4μmol/L，2μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L等一系列浓度的过氧化氢标准水溶液，用实施例4中所制成的试纸快速蘸样品，等待1分钟后试纸均呈现程度不同的蓝色，而过氧化氢浓度越高显色越深。该试纸密封包装，置于冰箱中保存，30天后仍然能检测到0.5μmol/L的过氧化氢存在。
实施例15实施例7所制得的酶试纸用于检测过氧化氢标准水溶液配制8μmol/L，4μmol/L，2μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L等一系列浓度的过氧化氢标准水溶液，用实施例7中所制成的试纸快速蘸样品，等待1分钟后试纸均呈现程度不同的紫褐色，而过氧化氢浓度越高显色越深。
该试纸密封包装，置于冰箱中保存，30天后仍然能检测到0.5μmol/L的过氧化氢存在。
实施例16实施例10所制得的酶试纸用于检测过氧化氢标准水溶液配制8μmol/L，4μmol/L，2μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L等一系列浓度的过氧化氢标准水溶液，用实施例10中所制成的试纸快速蘸样品，等待1分钟后试纸均呈现程度不同的颜色棕红色，而过氧化氢浓度越高显色越深。
该试纸密封包装，置于冰箱中保存，30天后仍然能检测到0.5μmol/L的过氧化氢存在。
实施例17用实施例1之酶试纸法和传统测定方法分别测定样品过氧化氢浓度配制20μmol/L，5μmol/L，1μmol/L等3个浓度的过氧化氢水溶液100ml，分别用实施例1中所制成的酶试纸、高锰酸钾滴定法和钛离子显色法测定它们的浓度。
用精密移液器各量取10μl上述过氧化氢水溶液，分别滴在三块不同的本发明之酶试纸上，等待1分钟后试纸呈现不同深浅的红色，其中过氧化氢浓度越高，试纸显现的红色越深。
高锰酸钾滴定法和钛离子显色法参照《食品成分分析手册》(宁正祥主编，1998年，北京，轻工业出版社)。在高锰酸钾滴定法中，以滴定至溶液呈现微红色并在1分钟内不褪色为终点。钛离子显色法则是根据钛离子与过氧化氢能在酸性介质中生成橙色络合物，而后以分光光度计于波长420nm处测其溶液的吸光度。
结果表明，使用本发明之酶试纸进行过氧化氢测定，只需要10μl的样品量，2分钟即完成实验，并且实验不需要任何特别设备。而高锰酸钾滴定法至少需要20毫升的样品，钛离子显色法则至少需要1.0ml的样品。同时高锰酸钾滴定法和钛离子显色法需要特定的化学滴定仪器和精密的分光光度仪，只能在实验室完成。无法进行移动作业。此外，使用本发明之酶试纸可以达到更高的检测灵敏度。
权利要求
1.一种用于测定过氧化氢浓度的酶试纸，其特征在于通过利用阴离子吸附剂的作用，将带正电荷的辣根过氧化物酶和显色剂同时固定在载体上制备而成。
2.如权利要求1所说的酶试纸，其中显色剂可以是苯酚和4-氨基安替吡啉的组合、或是苯酚单独与N，N-二甲基苯胺、2，4-二氯酚、邻二苯酚等其中任何一个的组合。
3.如权利要求1所说的酶试纸，其中载体可以是各种纤维素或其衍生物纸张。
4.如权利要求3所说的酶试纸，其中载体为羧甲基纤维膜或硝酸纤维膜。
5.如权利1要求所说的酶试纸，其中吸附剂可以是羧甲基纤维素或硝酸纤维素阴离子吸附剂。
6.如权利要求1至5之任一所说的酶试纸，其中辣根过氧化物酶的使用浓度范围为0.01～0.10g/L。
7.如权利要求1至5之任一所说的酶试纸，其中吸附剂羧甲基纤维素的使用浓度为0.5％-2.0％。
8.如权利要求1至5之任一所说的酶试纸，其中吸附剂硝酸纤维素的使用浓度为0.5％-2.0％。
9.如权利要求2至5之任一所说的酶试纸，其中显色剂为0.020～0.10M的苯酚和0.0050～0.050M的4-氨基安替吡啉或N，N-二甲基苯胺或2，4-二氯酚或邻二苯酚。
10.如权利要求1至5之任一所说的酶试纸，其中显色剂混合液中含有作为防腐剂的氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或庆大霉素等其它抗生素。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶促显色反应制备能快速检测样品中过氧化氢含量的酶试纸。该试纸是利用带阴离子载体的吸附作用，将带正电荷的辣根过氧化物酶和显色剂同时固定在载体上的方法制备而成。该试纸可以检测到样品中浓度低至0.5μmol/L的过氧化氢的存在。检测时该试纸的响应时间为1分钟。可以方便快捷地测定样品中过氧化氢的含量。同时本发明试纸便于携带，适于流动作业。
文档编号C12Q1/00GK1821754SQ200610011568
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者王炜军, 吕志, 刘娥娥, 方颖, 徐凤彩 申请人:华南农业大学