真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作的制作方法

专利名称：真核生物中原卟啉原氧化酶酶活力的操作的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及一种酶活力的操作，该酶在所有真核生物的普通生物合成途径中负责将原卟啉原IX转化成原啉啉IX。一方面，本发明可用于发展植物，植物组织，种子对除草剂的抗性，另一方面，本发明可用于发展对动物，尤其是人类缺乏这种酶活力的诊断和治疗。
导致产生叶绿素和血红素的生物合成途径有许多相同步骤。叶绿素是所有绿色光合生物中的光收集色素。血红素是血红蛋白，细胞色素，P450混合功能单加氧酶、过氧化物酶及过氧化物酶的辅助因子(见如Lehninger，“生物化学”Wroth出版公司，纽约(1975))，并且是所有需氧生物的必需组份。
叶绿素和血红素生物合成的最后相同步骤是原卟啉原IX到原卟啉IX的氧化。原卟啉原氧化酶(本文称为”Protox”)是催化这个最后步骤的酶(Matringe等人，生物化学杂志260231(1989))。
这个原卟啉原氧化酶已从许多种生物中或完全纯化，这些生物包括酿酒酵母(Labbe-Bios和Labbe，见“血红素和叶绿素的合成”，E.H.Dailey ed.McGraw Hill纽约.pp 235-285(1990))，大麦白色体(Jacobs和Jacobs，“生物化学杂志”244219(1987))和小鼠肝脏(Dailey和Karr，生物化学262697(1987))。编码原卟啉原氧化酶(Protox)的基因已从两种原核生物中分离出，这两种原核生物是大肠杆菌(E.coli)(Sasarman等人，加拿大微生物学杂志391155(1993))和枯草芽孢杆菌(Dailey等人，生物化学杂志269813(1994))。这些基因没有序列相似性，它们推定的蛋白质产物也没有任何氨基酸序列相似性。大肠杆菌的蛋白约21KDa，并与细胞膜相联。枯草芽孢杆菌蛋白为51KDa，是一个可溶的，细胞质中表现活力的蛋白。
目前，对原卟啉原氧化酶了解太少，因而还不能用已知的方法从较高等的真核生物(也就是动物，植物和其它除了如酵母，单细胞藻类，原生动物等的低等真核微生物以外的所有多细胞具核的生物)中分离编码原卟啉原氧化酶(protox)的基因。
具体的说，一些分离新蛋白和基因的标准技术是建立在假定它们的初级结构(也就是氨基酸和DNA序列)与具有相同功能的已知蛋白和基因有高度相似性基础上的。那些标准方法包括核酸杂交和聚合酶链式反应扩增，其中聚合酶链式反应采用与保守的氨基酸序列基序(motif)对应的寡聚核苷酸引物。这些技术如果采用目前局限于原核原卟啉原氧化酶基因的结构信息对真核原卟啉原氧化酶基因的分离是没有用的。因为即使在知道的原核原卟啉原氧化酶基因和蛋白中都没有明显的结构相似性。
另一个曾经用于从高等真核生物的其它代谢途径中分离生物合成基因的方法是对所需活力缺陷的微生物突变型进行互补。对于这个方法，一个高等真核生物的cDNA文库克隆在一个能在受体微生物中直接表达该cDNA的载体中。然后将这个载体转化或导入突变微生物中，选出表型不再是突变型的菌落。
在一些代谢路径中采用了这种策略从高等真核生物中分离基因，包括组氨酸生物合成(如本文引入其全文作为参考的美国专利5290926和WO 94/026909至Ward等人.)，赖氨酸生物合成(如Frisch等人，分子基因遗传228287(1991))，嘌呤生物合成(如，Aimi等人，生物化学杂志2659011(1990))，色氨酸生物合成(如Nigogi等人，植物细胞51011(1993))。然而尽管可以获得认为是原卟啉原氧化酶活力缺陷的微生物突变型(如大肠杆菌(Sasar-man.等人，基因微生物杂志113297(1979)，鼠伤寒沙门氏菌(Xu等人，细菌学杂志1743953(1992))和酿酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通报106724(1982))，在已知信息基础上采用这种技术去分离编码真核原卟啉原氧化酶活性的cDNA是最不可预知的。
这样说是有几个原因的，首先真核原卟啉原氧化酶cDNA序列在突变微生物中不能达到足够水平的表达。比如因为使用的密码子与受体微生物采用的密码子不一致。第二克隆的真核编码序列的初始转译产物可能不能产生有功能的多肽。如如果活力要求一个转译后修饰，比如糖基化，而这不能在微生物中进行。第三这个真核蛋白在微生物受体中不能形成其有活力的构象。比如如果这个蛋白通常作用于一个专一的细胞器膜系统，而微生物受体专一性缺乏这个系统。最后一种可能性对于植物原卟啉原氧化酶更为可能，因为此酶在植物细胞中是与补偿测试中微生物受体不具有的细胞器相联的。具体地说，植物原卟啉原氧化酶是与叶绿体膜和类体膜相联系的(Matringe等人，生物化学杂志2674646(1992))，并且可以假定以包括N-末端转译(transit)序列和成熟多肽内部特性转译后靶向机制为结果到达那些膜(见如Kohorn和Tobin，植物细胞1159(1989)；Li等人，植物细胞3709(1991)；Li等人，生物化学杂志26718999(1992))这些原卟啉原氧化酶已知在一些人类疾病中起作用。在患有杂色卟啉症，一种以神经精神病症状和皮肤损伤为特征的常染色体显性紊乱病的病人中，原卟啉原氧化酶活力水平下降(Brenner和Bloomer，新英格兰医学杂志302765(1980))。由于缺乏关于人类原卟啉原氧化酶及其对应基因的知识，对这种紊乱的诊断和治疗的选择在目前是很有限的。
采用除草剂控制不想要的的植被，如作物中的杂草或植物，这几乎已得到广泛的应用。相关的交易额每年超过了十亿美元。尽管广泛使用除草剂，对于农民控制杂草仍是一个巨大的且耗资的问题。
有效地使用除草剂要求良好的管理。比如施用除草剂的时间和方法以及杂草植物生长阶段对更好的控制杂草是关键的。因为许多种类杂草对除草剂有抗性，生产有效的除草剂变得越来越重要。
不幸的是，那些表现很大潜力，有广谱除草和在土壤中快速降解的除草剂对作物有较大的植物毒性。一个解决这个问题的方法就是建立能够抵抗或耐受杀草剂的作物。对除草剂有抗性的作物杂交种或变种允许使用除草剂而不会提高破坏作物的危险。建立抗性可采用对作物施用除草剂的方法，而这种除草剂由于是作物敏感的而事先或有限的施用的(如出现前施用)。如美国专利4,761,373至Anderson等人，教导丁对咪唑啉酮或硫基硫胺类除草剂有抗性的植物。这种抗性可以通过一个改变了的乙酰羟基酸合成酶(AHAS)证实。Goodman等人 的美国专利No.4,975,374涉及包含一种编码一个突变谷胺酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物能够对已知抑制GS的除草剂，如phosphinothrici和蛋氨酸硫氧亚胺的抑制产生抗性Bedbrook等人的美国专利No.5,013,659指导的能够表达一种突变乙酰乳酸合成酶的植物对磺酰脲除草剂的抑制有抗性。Somers等人的美国专利No.5,162,602发现一些植物对环己二酮和芳基氧基苯氧基丙酸除草剂的抑制能够耐受，这个耐受性能通过一个改变了的乙酰辅酶A羧化酶(Accase)证实。
原卟啉原氧化酶是多种除草剂类化合物的靶点。除草剂在酶分子的不同结构层次上抑制原卟啉原氧化酶(protox)(Duke等人，杂草科学(Weed Sci.)39465(1991)；Nandihalli等人，农药生化生理43193(1992)；Matringe等人，FEBS Left.24535(1989)；Yanase和An-doh，农药生化生理3570(1989)。这些除草剂类化合物包括二苯醚{如acifluorfen.5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲基酯；或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟基苯)}，Oxidiozoles，(如Oxidiazon；3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-恶二唑-2-(3H)-one)，环状亚胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧基苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二亚胺；Chlorophthal-im，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二亚胺)，苯基吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；M&B 39279)，吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopy-late和它的O-苯基吡咯烷基-和哌啶氨基甲酸酯类似物。这些化合物中的一些竞争性的抑制催化正常反应的酶，可以是以底物类似物作用。
原卟啉原氧化酶抑制型除草剂作用方式的预测包括叶绿体中原卟啉原IX的积累。这种积累被认为导致原卟啉原IX泄漏到细胞溶质，在那儿，原卟啉原被过氧化物酶氧化成原卟啉IX。光照时，原卟啉IX能导致细胞溶质中单线态氧的形成，这种单线态氧能依次导致其他氧化反应种类的形成，如能使脂类过氧化和细胞膜崩溃而导致快速细胞死亡(Lee等人，植物生理学102881(1993))并不是所有的原卟啉原氧化酶对抑制植物原卟啉原氧化酶的除草剂敏感。从大肠杆菌(Sasarman等人，加拿大生生物学杂志391155(1993))和枯草芽孢杆菌(Dailey等人，生物化学杂志269813(1994))中分离的基因编码的原卟啉原氧化酶对这些除草剂类抑制物有抗性。另外，也有报导说单细胞藻类莱因衣藻(Chlomydomonasreinhardtii)的突变体对苯亚胺除草剂S-23142有抗性(Kataoka等人，农药科学杂志15449(1990)；Shibata等人，见“光合作用研究”-Vol.111，N.Murata.ed.Kluwer荷兰，pp.567-570(1992))。这些突变体中至少有一种表现出具有改变了的原卟啉原酶活力，从而不仅对选择突变体的除草剂类抑制剂有抗性，而且对其他类原卟啉原氧化酶抑制剂有抗性(Oshio等人，Z.Naturforsch.48C339(1993)；Sato等人.见“卟啉农药学术讨论会”，S.Duke.ed.学术评论华盛顿，D.C.(1994))。一个烟草突变细胞系也曾被报导对抑制剂S-21432有抗性(Che等人，Z.Naturforsch.48C350(1993))。
本发明提供了一类真核生物中分离出的编码原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，它的优点是来自高等真核生物。具体地说，本发明提供的编码原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子来源于植物或人。
本发明范围内优选从双子叶植物中分离出的编码原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是来自拟南芥类植物的，如在SEQ ID NOS1，3和9给出的DNA分子。
也优选从单子叶植物中分离出的编码原卟啉氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是来自玉米的，如在SEQ ID NOS5和7中给出的。特别在本发明中优选的是一类分离到的DNA分子编码的双子叶植物的原卟啉原氧化酶蛋白，其中所说的蛋白质包含选自SEDID NOS 2.4和10的氨基酸序列。也优选一类分离的DNA分子，它编码单子叶植物原卟啉原氧化酶蛋白质，其中所说的蛋白质包含选自SEQ ID Nos 6和8的氨基酸序列。
采用本发明提供的信息，任何真核生物的的原卟啉原氧化酶(protox)的DNA编码序列都可通过标准方法获得。因此，本发明的进一步实施方案是提供能与编码原卟啉原氧化酶的真核DNA序列或各个mRNA特异性杂交的探针，并且提供了本发明的探针在真核生物中测定上述DNA序列的方法。
本发明进一步提供了表达框(Cassetts)和包含上述表达框的重组载体，而表达框又包含了一个必须的启动子，根据本发明这个启动子特别是在植物中有活力，而且可与编码真核生物原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子有效相连。根据本发明的表达框另外还包含一个可与上述DNA分子有效相连的信号序列，而这个信号序列能够将上述DNA分子编码的蛋白质导入叶绿体或线粒体。
另外，本发明还提供了具有改变了的原卟啉原氧化酶活性的植株，植物细胞，植物组织和植物种子，它们能对一定水平的除草剂的抑制有抗性或至少有耐受性，在此除草剂水平下植物中自然产生的原卟啉原氧化酶通常受到了抑制。具体的说，本发明提供的植物其中已改变的的原卟啉原氧化酶可以通过过度表达野生型原卟啉原氧化酶或通过编码耐受除草剂的原卟啉原氧化酶的表达来证实。上述耐受除草剂的原卟啉原氧化酶可以是真核或原核生物中自然产生的原卟啉原氧化酶的修饰形式，或者是上述植物中自然产生的原卟啉原氧化酶的修饰形式，或者上述耐受除草剂的原卟啉原氧化酶可以是在原核生物中天然产生的。本发明采用的植物包括单子叶和双子叶植物，但尤其是杂交植物。优选的那些植物是具有能够抑制原卟啉原氧化酶的除草剂的潜在靶位点的，特别是农业上很重要的作物如玉米和其它谷类作物比如小麦，燕麦，黑麦，高梁，水稻，大麦，小米，turf，和牧草及类似物，以及棉花，烟草，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。
本发明进一步包括了根据本发明的植物的繁殖材料，较优选的为用一种保护剂膜处理的植物种子，尤其是采用一种从一组包含除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀细菌剂，杀线虫剂，杀软体动物剂或其混合物中选出的制品组成的保护剂膜。
本发明还指导生产含有能抵抗或耐受一定浓度除草剂抑制的原卟啉原氧化酶的植株，植物细胞，植物组织，植物种子和其转基团后代，而此浓度下的除草剂能抑制自然产生的原卟啉原氧化酶。上述的抗性或耐受性可以通过编码真核生物中自然产生的原卟啉原氧化酶修饰形式的DNA分子的表达，或编码上述植物中自然产生的原卟啉原氧化酶修饰形式的DNA分子的表达，或通过一种原核生物中自然产生的原卟啉原氧化酶的DNA分子的表达，或编码一种原核生物中自然产生的一种蛋白的修饰形式的原卟啉氧化酶的DNA分子的表达来获得。
本发明的一个具体实施方案是指导了被包含合适启动子的重组DNA分子稳定转化的转基因玉米植株，玉米组织或玉米种子及其转基因后代的制备。这个在植物中起作用的合适的启动子与一个编码对除草剂有抗性的未修饰的原核原卟啉原氧化酶的结构基因有效相连。
本发明进一步指导了制备被包含与一个编码未修饰的真核原卟啉原氧化酶的结构基因有效相连的能在植物中作用的合适启动子之重组DNA分子稳定转化的转基因植株，植物细胞，植物组织和植物种子及转基因后代。在这种植物中未修饰原卟啉原氧化酶过度表达的结果足以克服除草剂对此酶的抑制作用。
本发明也提供了能表达一种对在野生型未改变的原卟啉原氧化酶活力通常有抑制的浓度下的除草剂的抑制作用有耐受性的改变了的原卟啉原氧化酶的植物产物。在这个实施方案中，植物可被包含一个编码抗性原卟啉原氧化酶的结构基因的重组DNA分子稳定转化，或采用直接挑选技术分离，测定和建立除草剂抗性系来制备。
本发明进一步指导了控制不需要的植物的生长的方法，此方法包括对具有改变的原卟啉原氧化酶的植物群体施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂，这种改变了的原卟啉原氧化酶能抵抗对上述植物自然产生原卟啉氧化酶有抑制作用水平的除草剂的抑制作用。上述方法中保护的植物特别是那些对原卟啉原氧化酶型除草剂有潜在靶位点的，具体的是农业重要作物如玉米和其它谷物作物，如小麦，燕麦，黑麦，高梁，水稻，大麦，小米，turf和牧草等以及棉花，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。原卟啉原氧化酶抑制剂型除草剂选自ary-luracil，二苯醚，oxidiazole，亚胺，苯吡唑，吡啶衍生物，phenopylate和O-苯吡咯烷-和呱啶氨基甲酸酯的所谓phenopylate类似物。
本发明也提供了原卟啉原氧化酶的重组生产和重组产生的原卟啉原氧化酶的使用方法。本发明进一步提供了受体细胞，尤其那些选自植物细胞，动物细胞，细菌细胞，酵母细胞和昆虫细胞的细胞，它们都被包含能在各受体细胞中作用并与修饰或未修饰的真核原卟啉原氧化酶的结构基因有效相连的合适的启动子的重组DNA分子稳定转化；其中所述受体细胞能够表达上述DNA分子。
本发明进一步提供了使用纯化的原卟啉原氧化酶筛选影响原卟啉原氧化酶活力的新型除草剂的方法，以及鉴定抗除草剂的原卟啉原氧化酶的突变型的方法。
具体地说，此发明指导了一个测试一种化学物质能否抑制植物中原卟啉原氧化酶活力的方法，包括(a)在上述原卟啉原氧化酶能催化原卟啉原IX转化为原卟啉IX条件下，将上述原卟啉原氧化酶与原卟啉原IX在第一反应混合物中混合。
(b)在与上述第一反应混合物相同的条件下，将所述化学物质，上述原卟啉原氧化酶和原卟啉原IX在第二反应混合物中混合。
(c)在约395-410nM处激发上述第一和第二反应混合物。
(d)比较上述第一和第二反应混合物在约622-635nM处的荧光。
其中如果上述第二反应混合物的荧光远小于上述第一反应混合物荧光，那么上述化学物质有抑制上述原卟啉原氧化酶活力的能力。
本发明进一步提供了鉴定在细胞群体中能够抵抗原卟啉原氧化酶抑制剂的修饰原卟啉原氧化酶的方法，包括以下步骤(a)将上述群体培养在含量能够抑制上述原卟啉原氧化酶未修饰形式的上述原卟啉原氧化酶抑制剂中；
(b)选择步骤(a)中生长未受抑制的细胞。
(c)分离和鉴定步骤(b)中选出细胞中的原卟啉原氧化酶。
在植物细胞转化方法中，编码改变了的原卟啉原氧化酶的基因可以用作可选择的标记。本发明进一步提供了一个从非转化植物中挑选用所需转移基因转化的植株，植物组织或植物细胞的方法，包括以下步骤。
(a)用一个此植物能表达的所需转移基因和一个编码对原卟啉原氧化酶抑制剂有抗性的改变了的原卟啉原氧化酶的基因转化一类植株、植物组织或植物细胞。
(b)将这些转化了的植物或植物细胞转移到含原卟啉原氧化酶抑制剂的培养基上。
(c)挑选出在培养基上存活的植物或植物细胞。
本发明进一步提供了测定生物中原卟啉原氧化酶的存在和形式以及原卟啉原氧化酶转录的数量水平的探针和方法，这些方法可用于对与原卟啉原氧化酶改变了的形式或原卟啉原氧化酶改变了的表达水平相联的疾病条件的诊断。
一方面，本发明提供了编码一类真核型原卟啉原氧化酶(本文称为protox)已分离的DNA分子，此酶能催化原卟啉原IX转化成原卟啉IX。拟南芥菜(Arobidopsis thaliana)的原卟啉原氧化酶的DNA编码序列和对应氨基酸序列已在SEQ ID Nos.1-4和9-10提供。玉米的原卟啉原氧化酶的DNA编码序列和对应氨基酸序列在SEQID Nos 5-8中提供。
根据本发明，任何需要的编码原卟啉原氧化酶的真核DNA都可分离到。一个提供分离真核原卟啉原氧化酶编码序列的方法以实施例1为代表。在此方法中能将编码原卟啉原氧化酶的cDNA克隆从感兴趣的真核生物cDNA文库克隆中鉴定出来。该方法基于对原卟啉原氧化酶缺陷型突变受体生物提供原卟啉原氧化酶的能力。用于本方法的合适的受体生物是那些能用于筛选cDNA表达文库和可以采用或可正常繁殖的原卟啉原氧化酶缺陷型突变的生物。这样的受体生物包括大肠杆菌(Sasarman等人，基因遗传微生物学杂志113297(1979))，鼠伤寒沙门氏菌(Xu等人，细菌学杂志1743953(1992))和酿酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通报106724(1982))，但不只限于这些。
作为选择，真核生物原卟啉原氧化酶编码序列可以按众所周知的方法以它们序列与本发明提供的拟南芥菜SEQ ID Nos.1，3和9)和Eea mays SEQ ID Nos 5和7)原卟啉原氧化酶编码序列的同源性来分离。在这些技术中，全部或部分已知原卟啉原氧化酶编码序列可用于能与所选生物的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)种群中其它原卟啉原氧化酶编码序列选择性杂交的探针。那些技术包括杂交筛选平板DNA文库(噬菌斑或菌落；见，如Sambrook等人，分子克隆，eds.冷泉港实验室报导(1989))和以与已知原卟啉原氧化酶氨基酸序列保守区域对应的寡聚核苷酸为引物的PCR扩增(见如Innis，等人.PCR方案方法与应用指南eds.学术指导(1990))。这些方法特别适于从与获得探针序列的生物相关的生物中分离原卟啉原氧化酶编码序列，比如采用本方法并以拟南芥(Arabidopsis)或玉米(Zeamays)编码序列为探针将特别适于从其他植物种类中分离原卟啉原氧化酶编码序列。
本发明教导的已分离的真核原卟啉原氧化酶序列可以按照标准基因工程技术适合任何目的操作。比如完整或部分原卟啉原氧化酶序列可用作与原卟啉原氧化酶编码序列和信使RNA专一性杂交的探针。为了在各种条件下得到专一性杂交，那些包含原卟啉原氧化酶编码序列中唯一序列的探针优选至少10个核苷酸长度，最优选的是至少20个核苷酸长度。这些探针可采用熟知的聚合酶链式反应(PCR)方法从选定的生物中扩增和分析原卟啉原氧化酶编码序列。这项技术可用于从一个需要的生物中分离另外的原卟啉原氧化酶，或作为测定一种生物中是否存在原卟啉原氧化酶编码序列和与改变的编码序列相联的不利条件如，以神经生理症状和皮肤损伤为特征的原卟啉原氧化酶活力下降的人类常染色体显性紊乱疾病的诊断测试(Brenner和Bloomer，新英格兰医学杂志302765(1980))。
原卟啉原氧化酶的专一性杂交探针可用于使用以与原卟啉原氧化酶基因组序列选择性杂交探针为基础的标准技术决定选定的生物的基因组中自然真核原卟啉原氧化酶基因的位置。这些技术包括同等或包含在原卟啉原氧化酶探针序列中DNA多态性的鉴定和使用这些多态性去跟踪来自两个多态性亲本系杂交的自受精图谱种群中与其他已知图谱位置标记相关的原卟啉原氧化酶基因的分离(见如Helentjaris等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)5109(1985)，Sommer等人，生物技术1282(1992)D’Ovidio等人，植物分子生物学15169(1990))，尽管任何真核原卟啉原氧化酶序列可考虑用作测定任何真核生物原卟啉原氧化酶基因图谱的探针，优选的探针是从与选定生物亲缓较近的生物的那些原卟啉原氧化酶序列，最优选的探针是选定的生物中的那些原卟啉原氧化酶序列。这种形式的原卟啉原氧化酶图谱被认为在用于养殖目的植物中特别有用，比如知道了一个导致除草剂抗性的原卟啉原氧化酶突变基因的基因图谱位置，侧向DNA标计可从参考基因图谱中鉴定出(见如Helent-jaris，趋势遗传学，3217(1987)。在除草剂抗性特征进入新的培养系时，这些标记可用于监测在每轮回交后现在亲本中原卟啉原氧化酶相关染色体DNA仍存在的程度。
原卟啉原氧化酶专一性杂交探针也可用于通过Northern印迹(Nothern blot)分析等标准技术测定生物中原卟啉原氧化酶mRNA的量的水平。这项技术可用于可能与具体不良状况有关的原卟啉原氧化酶表达水平改变测定的诊断测试。比如对以神经生理症状和皮肤损伤为特征，原卟啉原氧化酶活力下降为特征的人类常染色体显性病的诊断测试。(Brenner和Bloomer，新英格兰医学杂志302765(1980))。
对于在一个受体生物中酶的重组生产，原卟啉原氧化酶编码序列可插入到一个为选定的受体设计的表达框中，并导入受体，在那儿重组产物产生。专一性调控序列如启动子，信号序列；5′和3′非转译序列，增强的选择是本领域的普通技术人员已知的。包含连接在合适阅读框中的各个元件的分子产物可插入到能被转化到受体细胞中的载体中。合适的表达载体和蛋白质的重组生产方法对于受体生物如大肠杆菌(见如Studier和Moffatt，分子生物学杂志J.Mol.Biol.189113(1986)；Brosius，DNA 8759(1989))，酵母(见，如Schneider和Guarente，酶学方法(Meth，Enzynol.)199373(1991))和昆虫细胞(见，如Luckow和Summers，生物技术647(1988))是众所周知的。具体的例子包括质粒如pBluescript(stratagene.LaJolla，(A)，pFLAG(国际生物技术公司，New Haven，CT)，pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)和杆状病毒(baculovirus)表达载体，如那些来自Autographica californica核多角体病毒(AcMNPV)基因组的载体。优选的杆状病毒/昆虫系统是pVI11392/sf21细胞(Invitro-gen，La Jolla，CA)。
重组产生的真核原卟啉原氧化酶可用于多种目的。比如它可以体外提供原卟啉原氧化酶，它也可用于筛选靶点未知的已知除草剂化学物质是否抑制原卟啉原氧化酶的体外测试。这样的体外测试也可用于更常规的筛选化学物质是否抑制原卟啉原氧化酶和是否能成为除草剂候选者。作为选择，重组产生的原卟啉原氧化酶可用于进一步确定与已知抑制的联系，以便有效地设计新的抑制型除草剂以及酶的除草剂耐受型。
典型的，原卟啉原氧化酶的抑制作用是通过测定在约395-410nM激发后，约622-635nM处的荧光来测定的。(见，如Jacobs和Jacobs，酶28206(1982)；Sherman等人，植物生理学97280(1991))。这个测试是基于这个事实原卟啉IX是荧光色素，原卟啉原是非荧光的。从选出的亚细胞部分如白色体，线粒体，微粒体或质膜通过差速离心制备蛋白提取物(见如Lee等人.植物生理学.102881(1993)；Prado等人.植物生理学.65956(1979)；Jackson和Moore见“植物细胞器”.Reid.ed.pp 1-12；Jacobs和Jacobs，植物生理学1011181(1993))。原卟啉原通过Jacobs和Jacobs(1982)描述的用钠汞齐还原原卟啉制备。典型的反应混合物包括100mM Hep-es(pH7.5)，5mM EDTA，2mM DTT，约2M原卟啉原1X，和约1mg/ml蛋白提取物。各种浓度的抑制溶液如1mM，100uM，10uM，1uM，100nM，10nM，1nM，100pM，在酶反应开始前加入到酶提取液中。一旦蛋白提取液加入，荧光要监测几分钟，从斜线的线性区计算斜率(反应速度)。通过比较抑制反应的斜率与对照反应的斜率测试IC50。
本发明的另一方案包括在鉴定抑制抗性原卟啉原氧化酶突变体的测定中使用原卟啉原氧化酶。典型的测试如下(a)将原卟啉原氧化酶第一份样品和它的底物原卟啉原IX在含有原卟啉原氧化酶抑制剂的第二份样品存在条件下保温；(b)测定步骤(a)中原卟啉原氧化酶的酶活力；(c)将突变的原卟啉原氧化酶第一份样品和它的底物在含有相同原卟啉原氧化酶抑制剂的第二份样品存在条件下保温。
(d)测试步骤(c)中突变原卟啉原氧化酶的酶活力。
(e)将突变原卟啉原氧化酶酶活力与未突变原卟啉原氧化酶活力比较。
在以下改进中，反应混合物和反应条件与鉴定原卟啉原氧化酶抑制剂(抑制剂测定)的测定相同。首先，一种按上述方法得到的突变原卟啉原氧化酶代替抑制剂测试反应混合物中野生型原卟啉原氧化酶，第二在两个反应混合物中都加入野生型原卟啉原氧化酶的抑制剂。第三突变酶活力(有抑制剂和突变原卟啉原氧化酶的酶活力)和未突变酶活力(抑制剂和野生型原卟啉原氧化酶存在下酶活力)相比较以决定突变酶活力与未突变酶活力相比酶活是否观察到有很大提高。突变酶活力就是在合适底物和抑制剂存在下任何测到的突变原卟啉原氧化酶酶活力，未突变酶活力就是在合适底物和抑制剂存在下任何测到的野生型原卟啉原氧化酶酶活力。一个大于测定技术的内在误差的百上上升可定为酶活力提高，优选的是比抑制剂存在下野生型酶活力提高2倍。更优选的是提高约5倍，最优的是提高大于10倍。
抑制原卟啉原氧化酶的除草剂包括许多不同结构层次的分子(Duke等人，杂草科学39465(1991)；Nandihalli等人，农药生化生理学Resticide Biochem.physiol.43193(1992)；Natringe等人，FEBS Left 24535(1989)；Yanase和Andoh，农药生化生理学3570(1989))。包括二苯醚{如acifluorifen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲酯；或oxyfluorfen 2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟苯)}，Oxidiazoles(如oxcliazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-oxadiozol-2-(3H)-one)，环亚胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二酰亚胺；chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二酰亚胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑基-5-氧〕丙酸盐；MQB 39279)；吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopylate及其O-苯吡咯烷和呱啶氨基甲酸酯类似物。
二苯醚特别标志是那些具有下面通式的分子 (式I)其中R为-COONa(结构式II)，-CONHSO2CH3(结构式III)或-COOCH2COOC2H5(结构式IV；见Maigrot等人，布赖顿公司植保会议-杂草47-51(1989))另外一些有兴趣的二苯醚是那些R为 (结构式IVa见Hayashi等人，布赖顿公司植保会议-杂草53-58(1989))。另外一类有兴趣的二苯醚有结构式 (结构式IVbbifenox，见Dest等人，东北杂草科学会议汇编2731(1973))已知的亚胺类除草剂也有意义，具有一般结构式 (结构式V)其中Q可为 (结构式VI) (结构式VII) (结构式VIII)(结构式IX) (结构式IXa) (结构式IXb)(见Hemper等人(1995)见“第8届国际农药化学会议汇编”，Rag-dale，等人.，eds.美国化学学会华盛顿，D.C.pp 42-48(1994))。
而R1为H，Cl或F，R2为Cl，R3可被醚，硫醚，酯，氨基或烷基任意取代。并且R2和R3可形成一个5或6元杂环。特别有益的亚胺类除草剂例子有 (结构式X) (结构式XI) (结构式XII)(见Miura等人，布赖顿作物保护会议-杂草35-40(1993)) (结构式XIII) (结构式XIV) (结构式XV)(结构式XVI)
以上化合物的除草剂活力在以下文献中有描述1991布赖顿作物保护会议-杂草(英国作物保护委员会)(结构式X和XVI)，1993 布赖顿作物保护会议-杂草(英国作物保护委员会)(结构式XII和XIII)。美国专利No.4,746,352(结构式XI)和Abstracts of美国杂草科学协会vol.33 pg 9(1993)(结构式XIV)。
最优选的亚胺类除草剂是那些称为aryluracils并具有下面通式的分子 (结构式XVII)其中R表示基团(C2-6-烷氧基)羰基-C1-4-烷基。正如在美国专利No.5,183,492中所公开的，本文引入作为参考。
具有结构通式如下的除草剂也具意义 (结构式XVIII，thiadiazimin)(见Weileretal，布赖顿作物保护会议-杂草pp.29-34(1993))； (结构式XIXCarfentrazone)(见Van Saun等人，布赖顿作物保护会议-杂草pp.19-22(1993))；N-取代S的吡唑的通式 (结构式XX)(见国际专利出版物94/08999，WO 93/10100，和美国专利No.5,405,829转让给Schering)；N-苯基吡唑，如
(结构式XXI，nipyraclofen)(见农药手册第621页，9th ed.ed.by C.P.Worthing，英国作物保护委员会，Surrey(1991))；和3-取代-2-芳基-4，5，6，7-四氢吲哚(Lyga等人，PesticideSci 4229-36(1994))。
一般对原卟啉原氧化酶活性有抑制的除草剂水平包括本领域中已知的使用比利，并且依赖于外部因子如环境、时间和使用方法。比如对于结构式V～IX代表的亚胺类除草剂，更具体的那些结构式X～XVII代表的除草剂，施用比例范围为0.0001～10kg/na，优选的为0.005～2kg/na。除草剂的剂量比例或浓度可以不同，这依赖于需要的作用和具体所用的化合物，并且可用本领域中已知的方法来确定。
本发明进一步提供能耐受除草剂的植株，植物组织和植物种子，而这些植物中自然产生的原卟啉原氧化酶可被除草剂抑制，并且这种耐受作用是通过改变了的原卟啉原氧化酶而获得。代表性的植物包括按一般目的的施用除草剂的任何植物。优选的是在农业上较重要的作物，即重要的被子植物和裸子植物如棉花，大豆，油菜，甜菜，玉米，水稻，小麦，大麦，燕麦，黑麦，高梁，小米，turf，牧草，turf草等。
改变了的原卟啉原氧化酶活性表示一种与植物自然产生的(即没有人直接或间接对此酶进行操作的自然产生的原卟啉原氧化酶)原卟啉原氧化酶不同的原卟啉原氧化酶，这种酶对能抑制自然产生的酶的除草剂有抗性。改变了的原卟啉原氧化酶可通过本发明的以下方法在植物中获得，提高野生型，对除草剂敏感的原卟啉原氧化酶的表达，在此植物中表达一类改变了的耐受除草剂的真核原卟啉原氧化酶，表达在植物中抗除草剂的修饰或未修饰的细菌原卟啉原氧化酶，或将以上技术联合使用。
通过提高植物细胞中原卟啉原氧化酶表达水平而获得改变的原卟啉原氧化酶活力足以克服除草剂引起的生长抑制。这样的原卟啉原氧化酶表达水平通常为自然表达的2倍，优选的为5倍，更优选的为至少10倍。表达的提高可能因为原卟啉原氧化酶基因份数增加，基因增加可发生在原卟啉原氧化酶基因内编码序列(即基因扩增)或植物细胞中内生原卟啉原氧化酶基因的非编码，调节序列的突变。包含这样原卟啉原氧化酶的植物可直接从植物中选择而获得。此方法在本领域中是已知的。见，如Somers等人，见美国专利5,162,602和Anderson等人，见美国专利4,761,373及其中引用的参考文献。这些植物亦可采用本领域已知的基因工程方法获得。
除草剂敏感型原卟啉原氧化酶表达的提高也可通过重组或嵌合DNA分子稳定转化植物细胞而获得。重组或嵌合DNA分子包含一个与同源或异源的原卟啉原氧化酶结构基因相连并能使与之相联结构基因表达的启动子。“同源性”表示此原卟啉原氧化酶基因是从与靶植物细胞分类学上相同的生物中分离的。“非同源性”表示此原卟啉原氧化酶基因是从与靶植物细胞分类学上不同的生物中分离的。同源原卟啉原氧化酶基因可通过细菌或酵母的缺陷型突变体与靶植物的cDNA文库互补而获得。见，如实施例1和Snustad等人，遗传学1201111-1114(1988)(玉米谷氨酸合成酶)；Delauney等人，分子遗传学221299-305(1990)(大豆-二氢吡咯-5-碳酸还原酶)，Frish等人，Mol Gen.Genet.228287-293(1991)(玉米二氢吡啶二羧酸合成酶)；Eller等人.植物分子生物学.18557-566(1992)(油菜叶绿体3-异丙基苹果酸脱氢酶)；美国自然科学研究汇编881731-1735(1991)；Minet·等人，植物杂志2417-422(1992)(二氢乳清酸脱氢酶)和其中引用的参考文献。其他已知方法包括在高等植物的基因组或cDNA文库中筛选，如可以与特异核酸探针杂交的序列，或在表达文库筛选能与特异性抗体探针交叉反应的原卟啉原氧化酶。一个优选的方法包括将大肠杆菌hemG缺陷型突变体与玉米或拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA文库进行互补实验。
能在植物或植物细胞中作用的启动子，即那些能使与之相联的结构基因如原卟啉原氧化酶基因在植物中表达的启动子实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的19S或35S启动子和CaMV的双重启动子，核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISO)启动子等，优选的有水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，分子基因遗传学231150(1991))，玉米泛素启动子(EP 0342 926；Taylor等人，植物细胞繁殖12491(1993))，及烟草，Arabidopsis或玉米的Pr-1启动子(见Ryds等人.的国际专利申请No.PCT/IB 95/00002，本文引入其全文作为参考)，优选的还有Koy等人，科学2361299-1302(1987)中描述35S启动子和一个增强的或双重35S启动子，此双重35S启动子克隆在pCGN2113中，以ATCC 40587保存，在EP-A 0392225中公开，相关说明书以其全文在本文中引用作为参考。启动子本身可按技术可行步骤被修饰以增强启动子提高原卟啉原氧化酶表达的强度。
信号或转移肽可与本发明嵌合DNA结构中原卟啉原氧化酶编码序列融合以指导表达的原卟啉原氧化酶到要作用的位点。信号肽的实例包括那些与植物的致病相关蛋白相连系的，如PR-1，PR-2等，见如Payne等人，植物分子生物学.1189-94(1988)。转移肽的实例包括Von Heijne等人，植物分子生物学Rep.9104-126(1991)；Mazur等人，植物生理学851110(1987).Vorst等人，基因6559(1988)中描述的叶绿体转移肽和Boutry等人，自然328340-342(1987)中描述的线粒体转移肽。对于本发明，叶绿体和线粒体转移肽被认为对线粒体和叶绿体内典型的原卟啉原氧化酶的产生特别有用。最优选的是采用叶绿体转移肽，因为叶绿体中原卟啉原氧化酶的抑制被认为是原卟啉原氧化酶抑制型除草剂作用的最初基础(Witkowski和Halling植物生理学，87632(1988)；Lehnen等人，农药生化生理37239(1990)Duke等人.野草科学.39465(1991).也包括导致编码的蛋白定位于如液泡等各种细胞组分的序列，见例如Neuhaus等人，美国自然科学研究汇编8810362-10366(1991)和Chrispeels.Ann.Rev.植物生理、植物分子生物学，4221-53(1991).相关的公开出版物在此引入作为参考。
本发明的嵌合DNA结构可包含多拷贝的启动子和多拷贝的原卟啉原氧化酶结构基因。另外，此结构中可包括标记的编码序列，以及其他如信号或转移肽；在合适阅读框中与其他作用原件一起在DNA分子中的序列。制备这样的构建体是本领域的普通技术人员已知的。
有用的标记包括提供除草剂，抗生素或药物抗性的肽，例如对潮霉素、卡纳霉素、G 418、庆大霉素、林肯霉素、氨甲蝶呤，glyphosate，phosphinothricin等抗性。这些标记可用于从未转化细胞中选择用本发明嵌合DNA构建体转化的细胞。其它有用的标记为可通过如颜色反应等可见反应观测到的多肽酶，如荧虫素酶，β-葡萄糖醛酸酶，或β-半乳糖苷酶。
改变了的原卟啉原氧化酶也可通过分离了的真核原卟啉原氧化酶编码序列修饰形式的产生和鉴定而获得。此编码序列至少有一个氨基酸取代，增加或删除，且编码对能抑制未改变自然产生形式(即没有直接通过基因重组方法或间接选择培育方法等操作过在真核生物中自发产生的形式)的除草剂有抗性的改变了的原卟啉原氧化酶。编码那些酶的基因可通过本领域中已知的多种方案获得。第一个普通方法包括直接或间接对微生物进行突变。如一种基因可操作的微生物如大肠杆菌和酿酒酵母用如紫外光.乙基或甲基甲烷硫酸随机诱变。诱变步骤在以下文献中有描述如Miller分子遗传学实验，冷泉港实验室，纽约冷泉港(1972).Davis等人，高等细菌遗传学，冷泉港实验室纽约冷泉港(1980)；Sherman等人，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，纽约冷泉港(1983)；和U-S.Patent No.4,975,374(Goodman等人)。被选用诱变的微生物包含正常除草剂敏感真核原卟啉原氧化酶基因，并且依赖于由此基因而获得到卟啉原氧化酶。诱变后细胞培养在能抑制未改变原卟啉原氧化酶浓度的除草剂中，诱变微生物菌落在除草剂存在下长得比未诱变微生物好的(即表现对抑制抗性)选出来进一步分析。这些菌落中原卟啉原氧化酶基因通过克隆或PCR扩增而分离并且测序。编码已改变了的原卟啉氧化酶的序列再克隆回微生物以证实它们能产生抑制剂抗性的能力。
第二个获得真核原卟啉原氧化酶除草剂抗性等位突变基因的方法包括直接从植物中选取，如，上面描述的原卟啉原氧化酶抑制剂对植物生长(如Arabidopsis，大豆、玉米)的抑制作用可采用技术可行的方法将种子接种到含抑制剂浓度不断上升的简单基本盐培养基平板中进行测定，这些浓度包括，0.001，0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10.30，110.300，1000，3000ppm。在最低剂量有显著生长抑制的用于以后试验。
植物材料的诱变可用于提高选定种群中抗性等位基因发生的频率。诱变的种子材料可从各个来源获得包括化学或物质诱变或种子，或化学或物质诱变花粉(Neutter，见“进行生物研究的玉米”Sheridan，ed.Univ.Press.Grand Forks.ND.pp61-64(1982)；此花粉可用于植物受精而收集到M1代突变种子，对于拟南芥(Arabidop-sis)M2种子(Lehle Seeds.Tusson.AZ)即采用如EMS等化学物质或γ射线或快中子等物理方法诱变的种子长出的植物的后代种子以高达10,000个/平皿(直径10cm)的密度放在包含合适浓度的用于选择抗性的抑制剂的基础盐培养基中。在平皿中植物被转移到土壤并生长至成熟和产生种子仍要继续生长和保持绿色7-21天。这些种子的后代要测试对除草剂的抗性。如果抗性特征为显性，种子抗性与敏感以3∶1分离的植物可假定在M2代抗性是杂合的，产生种子全为抗性的植物可假定M2代抗性是纯合的。作用在相关种子上的那引些诱变剂和M2后代种子的筛选亦可在其他种类上使用，如大豆(见，如U.S.Pat.No.5.084.082(Sebastian))，筛选的对除草剂有抗性的种子也可由物理或化学方法诱变的花粉受精而获得。
有两种方法可用于证实抗性的遗传基础是改变了的原卟啉原氧化酶基因。首先，将对抑制剂表现抗性的原卟啉原氧化酶等位基因通过DCR分离，引物是以SEQ ID，NOS1，3，5，7中Arabidopsis和玉米原卟啉原氧化酶cDNA序列保守区域或更优选的是以用于产生抗性等位基因的植物中未改变原卟啉原氧化酶基因的序列为基础。在对等位基因进行测序以决定编码序列中存在的突变后，等位基因用于测试采用推断为提供抗性等位基因转化的植物中提供对抑制剂抗性的能力。这些植物可以是Arabidopsis或任何其他生产对抑制剂敏感的植物。第二，原卟啉原氧化酶基因可以建立已知限制性片段长度多态性(RFLPS)相关的图谱(见，如Chang等人，美国自然科学汇编85；6856-6860(1988)；Nam等人，植物细胞1699-705(1989).抗性特征可用相同标记独立地建立图谱。如果抗性是由于原卟啉原氧化酶中的突变，抗性特征图谱将标在与原卟啉原氧化酶相同位置。
第三个获得原卟啉原氧化酶除草剂抗性的等位基因的方法是从植物细胞培养中选择，植物组织如胚胎，叶片，等外植体或快速生长愈伤组织或感兴趣植物的悬浮培养物在无血红素，有浓度不断上升的除草剂性抑制物或适用于实验室环境的抑制剂类似物的有限培养基上生长。在不同培养物中有不同生长程度的记录，在一些培养物中，产生的快速生长克隆即使在一般抑制浓度的抑制剂中继续生长。这样快速生长改变株发生的频率在将植物组织或细胞加入除草剂前用物理或化学诱变剂处理会得到提高。推论为原卟啉原氧化酶基因提供抗性的等位基因按前面各段描述的方法分离和测试。那些肯定为提供除草剂抗性的等位基因可通过工程学达最佳表达并转化入植物。另外，植物可由包含这些等位基因的组织或细胞培养再生形成。
第四种方法包括对细菌或酵母中野生型，除草剂敏感的原卟啉原氧化酶基因的诱变，接着将此微生物在缺乏血红素但包含抑制浓度的抑制剂的培养基上培养，挑选在抑制剂存在下生长的那些克隆。更具体地说，编码原卟啉原氧化酶的植物cDNA.，如Arabidopsis或玉米cDNA克隆到否则缺乏原卟啉原氧化酶活性的微生物中。这类微生物的实例包括大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和酿酒酵母的缺陷型突变，包括大肠杆菌菌株SAS×38(Sasarman等人，遗传微生物学杂志113297(1979)，鼠伤寒沙门氏菌菌株TE2483.或TT13680(Xu等人，细菌学杂志1743953(1992))和hem14-1酵母突变株(Ca-madro.等人，生化生理研究通报106724(1982))。转化的微生物用如上面刚描述的体内诱变处理，或者用各种本领域中已知的化学或酶学方法的体外诱变处理，如二硫化钠(Shortle等人.酶学方法100457-468(1983))；甲氧基胺(Kadonaga等人，核酸研究131733-1745(1985))；寡聚核苷酸直接饱和诱变(Hutchinson等人.美国自然科学研究汇编83710-714(1986))；或各种不联合种类的聚合酶(见，如Shortle等人，美国自然科学研究汇编791588-1592(1982)Shiraishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技术111-15(1989)。在有一般抑制浓度的抑制剂中生长的菌落被挑选出与用重复划线纯化。它们的质粒进行纯化并且转化到缺乏原卟啉原氧化酶的微生物中以测试提供对抑制剂抗性的能力。通过这个测试的质粒中原卟啉原氧化酶cDNA插入的DNA序列进行测序。
一但一个除草剂抗性原卟啉原氧化酶等位基因鉴定了，它可用基因工程方法在作物植物中达最适表达。这可包括改变抗性等位基因编码序列使之在感兴趣作物种类中最适表达，修饰编码序列以获得在特定作物中的最适表达的方法是众所周知的(见，如Perlak等人，美国自然科学研究汇编883324(1991)；Koziel等人，生物技术11194(1993))。原卟啉原氧化酶等位基因最适表达的基因工程也包括联上合适的调控基因序列(即容动子，信号序列，转录终止子)。优选的启动子是那些能高水平组成型表达的启动子或更优选的是那些在除草剂可能破坏的组织中特异性高水平表达的启动子。
重组DNA分子可用许多技术上可行的方法导入植物细胞。本领域的技术人员可预料到方法的选择取决于所要转化的植物类型即单子叶或双子叶。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，生物技术4320-334(1986))、电穿孔(Riggs等人.美国自然科学汇编USA 835602-5606(1986))、土壤杆菌介导的转化(Hinchee.等人，生物技术6915-921(1988))，直接基因转移(Paszkowski等人，EMBO杂志J.32717-2722(1984))和使用来自Agracetus公司，Madison.Wisconsin和Dupont公司.Wilm-ington.Delaware的设备进行导道微粒加速(见，如Sanford等人，Datent.4,945,050.和McCobe等人，生物技术6923-926(1988))。也可见，Weissinger等人，遗传学年鉴22421-477(1988)；Sanford等人，颗粒科学及技术527-37(1987)(洋葱)；Christou等人.植物生理.87671-674(1988)(大豆)；Mc Cabe等人，生物/技术6923-926(1988)(大豆)；Datta等人，生物/技术8736-740(1990)(水稻)；Klein等人.美国自然科学研究汇编，854305-4309(1988)(玉米)，Klein等人，生物/技术6559-563(1988)(玉米)；Kleim等人，植物生理91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，生物/技术8833-839(1990)，和Gordon-Kamm等人，植物细胞2603-618(1990)(玉米)。
本发明的范围还包括转基因植物，具体的转基因可育植物为用上述方法转化的植物及其无性和/或有性后代，它们仍然对抑制植物中自然产生原卟啉原氧化酶抑制的除草剂的抑制有抗性，至少有耐受性。尤其较优的是对植物中自然产生的原卟啉原氧化酶抑制水平的除草剂的抑制有抗性，至少有耐受性的杂交植物。
根据本发明的转基因植物可以是双子叶或单子叶植物。优选的单子叶植物是禾本科植物，包括黑麦草、玉米，小麦，Triticale，高梁，甘蔗，雀麦，稻，燕麦，大麦和黑麦。
特别优选的有转基因玉米、小麦、大麦、高梁、黑麦、燕麦、苔草(turf)和水稻。
在双子叶植物中，本文特别优选大豆，棉花，烟草，甜菜，油菜和向日葵。
“后代”表达意思为包括转基因植物产生的无性或有性后代。这个定义也意味着包括所有通过已知方法获得的突变体或变种，如通过仍表现初始转化植物特征的细胞融合与突变体选择，以及所有转化植物材料的杂交或融合产物。
本发明的另一涉及转基因植物的繁植材料。
转基因植物的繁殖材料对于本发明定义为任何可在体外或体内有性或无性繁殖的植物材料。在本发明范围中较优的为原生质体，细胞，愈伤组织，组织，器官，种子，胚胎，花粉，卵细胞，合子及其他任何转基因植物来源的繁殖材料。
植物的部分，如来源于转基因植物或通过本发明方法转化的后代花、茎、果实、叶、根，并至少包含部分转基因细胞，也是本发明的一个主题。
在植物繁殖材料[果实、块茎、谷粒、种子]，尤其是种子在作为商业产品出售前，它们要用一种包含除草剂，杀虫剂，杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂，杀软体动物剂或这几种物质混合物的保护剂覆盖物处理，如要需要与其它载体一起，保护使免受细菌、真菌或害兽破坏的工艺中还采用表面活性剂和使用增高配料。
为了处理这些种子，保护剂覆盖物可通过用液体配方处理块茎和谷粒或联合的湿或干的配方覆盖而使用于种子。另外，在一些特殊例子中，其他用于植物的方法也是可行的，如直接处理花蕾和果实。
根据本发明包含编码一类真核的具有根据本发明原卟啉原氧化酶(protox)活力的蛋白质的DNA序列的植物种子常用包含一类种子处理化合物的种子保护剂覆盖物处理，这些种子处理化合物包括如Captan，Carboxin，二硫化四甲秋兰姆(TMTD)，methalaxyl(Apron)和pirimiphos-methyl(Actellic)及其他常用于种子处理的复合物。
本发明还有一个目的是提供种植植物的植物繁殖材料，但尤其是常用于种子处理的种子保护剂覆盖物处理的植物种子。
一旦一个除草剂抗性原卟啉原氧化酶等位基因在作物植物或能再生成作物植物的植物细胞培养物中通过直接选择获得，它能够采用传统培养技术移入商业变种中建立除草剂耐受性作物而无需对等位基因进行基因工程处理并转化入植物。也就是，除草剂抗性等位基因可以分离，并通过遗传工程达最适表达并转化到所需变种。
编码抵抗原卟啉原氧化酶抑制剂的改变了的原卟啉原氧化酶基因而作为植物细胞转化方法中可选择的标记。如用转移基因转化的植物，植物组织或植物细胞也可用编码能够在植物中表达的改变了的原卟啉原氧化酶的基因转化，然后转化的细胞转移到包含原卟啉原氧化酶的抑制剂的培养基上，只有转化了的细胞才能存活。原卟啉原氧化酶抑制剂中作为特别有用的选择性试剂的有二苯醚{如acifluorfen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；其甲基酯，或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-2氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟基苯)}，Oxidiazoles，(如Oxidiazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基〕-5-(1，1-二甲基乙基-1，3，4-Oxadiazol-2-(3H)-one)，环亚胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟)-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二酰胺；Chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氢邻苯二酰胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；M&B 39279)，吡啶衍生物(如LS 82-556)，和phenopylate和它的O-苯吡咯烷一和呱啶氨基甲酸酯类似物。这个方法可以用于任何被编码改变了的原卟啉原氧化酶基因转化的植物细胞，可使用任何感兴趣的转移基因。转移基因和原卟啉原氧化酶基因的表达可使用在植物细胞中起作用的同一启动子或分开的启动子。
本发明通过参考以下详细的实施例进一步描述。这些实施例只是用于举例目的，而不是用于限制，除非另有。
保存以下的载体分子保存在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North University Street.Peoria，Illinas 61604，U.S.A，日期如下原卟啉原氧化酶-1 采用pBluescript SK载体，1994，4，5以pWDC-2(#B-21238)保存。
原卟啉原氧化酶-2 采用pFL61载体，1994，4，5作为pWDC-1(NRRL#B-21237)保存。
M2Protox-1，以pBluescript SK为载体，1994，5，20以pWDC-4(NRRL#B-21260)保存，在SEQ ID No5中表示。
MZProtox-1，以pBluescript SK为载体，1994，7，11作为SEQID NO5表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260N)保存。
MZProtox-2，以pBluescript SK为载体，1994，5，20作为SEQID NO7表示的pWDC-3以NRRL(#B-21259)保存。
原卟啉原氧化酶-3 以pFL61为载体，1994.6.10.以pWDC-5(NRRL#B-21280)保存。
pMzC-1Val，以pBluescript SK为载体，1994.9.30以命名为pWDC-8的形式以给定的保藏号NRRL#21340保存。
pAraC-2Cys，以pFL61为载体，1994.11.14以pWDC-7形式以给定的保藏号NRRL#21339N保存。
实施例这儿使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并在以下文献T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，“分子克隆实验室手册”，冷泉港实验室，纽约冷泉港(1982)和T.J.Sil-hary.M.L.Berman和L.W.Enquist.“基因融合试验”冷泉港实验室，纽约冷泉港(1984)中进行了描述。
实施例1通过一个大肠杆菌突变体的功能互补分离拟南芥编码原卟啉原氧化酶基因的cDNA。
一个以pFL61为质粒载体(Minet等人，植物杂志J.2417-422(1992))的拟南芥菜(Landsberg)cDNA文库已获得并扩增。购买了第二个以Unizapλ为载体的拟南芥(Columbia)cDNA文库，并通过体内噬菌体外切以pBluescript质粒扩增。获得大肠杆菌hemG突变体SAS×38(Sasarman等人.遗传微生物杂志113279(1979))并在含20g/ml正铁血红素(美国生化物质)的L培养基上保存。质粒文库通过电穿孔采用Bio-Rad Gene Pulser和制造者建议的条件转化到SAS×38中。这些细胞以大约500,000个转化子/10cm平皿的密度平板接种到包含100mg/ml的氨苄青霉素的L琼脂上。这些细胞在低亮度下37℃培养40小时，选择其在无外源血红素下生长能力。血红素原养微生物的恢复频率在pFL61文库约400/107，在pBluescriprt文库约2/107。从24个克隆中分离的质粒DNA进行了序列分析，24个中的每一个都再转化到SAS×38以证实其互补能力。
序列分析显示出两类推定的原卟啉原氧化酶克隆。9个命名为“Protox-1”型。每一个都来自同一基因，两个为全长克隆。此cD-NA为17196bp长，编码蛋白分子量为57.7KDa。N-末端肽序列约60个氨基酸具叶绿体转移肽的特征。用GAP程序(Deveraux等人，核酸研究12387-395(1984))搜寻的数据库显示出与枯草芽孢杆菌hemY(protox)蛋白有同源性(Hansson和Hederstedt 1992，Dailey等人，生物化学杂志269813(1994))。这两种蛋白有53％相似，31％与高同源区相同，包括hemY蛋白可能的二核苷酸结合域(Dai-ley等人，J.Biol.Chem.269813(1994))。
其它15个命名为”Protox-2”型。这些也表现为由一个基因产生。大约全长的cDNA是1738bp，编码的蛋白质分子量为55.6KD。氨基末端具有线粒体转移肽的某种特征。原卟啉原氧化酶-2(pro-tox-2)蛋白与protox-1(53％相似，28％相同)和枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶(50％相似，27％相同)有有限的同源性。
原卟啉原氧化酶-1(protox-1)以pBluescript SK为载体，1994.4.5以pWDC-2保存(NRRL#B-21238)。
原卟啉原氧化酶-2(protox-2)以pFL61为载体，1994.4.5以pWDC-1保存(NRRL#B-21237)。
在pWDC-2中编码原卟啉原氧化酶-1和在pWDC-1中编码原卟啉原氧化酶-2的拟南芥cDNA分别在以下SEQ ID NOS1和3中表示。实施例2通过大肠杆菌突变体的功能互补作用分离玉米编码原卟啉原氧化酶基因的cDNA从Stratagene购买了一个在λUnizap中的玉米(B73 inbred)cDNA文库，并且通过群体外切转到pBluescript文库中。第二个商业制造Unizap玉米cDNA文库购自Clontech，并类似地转变到pBluescript质粒上。从玉米中选择有功能的原卟啉原氧化酶基因的方法按上面实施例1.中描述的制拟南芥文库方法进行。
两个血红素原养型从Stratagene文库107个转化子中分离出，并表现互补性，且测了序。这些cDNA是相同的并与拟南芥原卟啉原氧化酶-1有同源性。这个玉米克隆，命名为MZProtox-1是不完全的。此cDNA长度为1698bp，仅编码可能的成熟原卟啉原氧化酶，没有转移肽序列，也没有甲硫氨酸启始密码子。此基因在核苷酸水平与拟南芥protox-1有68％相同，在氨基酸水平有78％相同(87％相似)(在表1表示)。
从Clontech文库107个转化子中得到一个血红素原养型，表现有互补作用，并测了序。此cDNA似乎是完整的，长2061bp，编码59KDa的蛋白。此克隆是一个与拟南芥Protox-2同源的玉米克隆，命名为MZProtox-2。此基因在核酸水平有58％与拟南芥Pro-tox-2相同，在氨基酸水平有58％相同(76％相似)(表2中表示)。此玉米克隆只一个比拟南芥克隆长30个氨基酸的N-未端序列。与拟南芥克隆相比，两个玉米原卟啉原氧化酶基因间同源性很低，两个蛋白的序列之间仅31％相同。
MZProtox-1以pBluescript SK为载体，1994.5.20以在SEQID NO5中表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260)保存。
MZProtox-1以pBluescript SK为载体，1994.7.11以在SEQID NO5中表示的pWDC-4在NRRL(#B-21260N)中再保存。
MZProtox-2以pBluescript SK为载体，1994.5.20以在SEQID NO7中表示的pWDC-3在NRRL(#B-21259)保存。实施例3以与已知原卟啉原氧化酶编码序列的序列同源性为基础分离另外的原卟啉原氧化酶基因一个噬菌体或质粒文库以约10,000个噬菌斑每次10cm陪氏平皿的密度平板接种，在将植物在37℃生长过夜后制备噬菌斑的滤膜转移。噬菌斑的转移物以SEQ ID Nos1，3，5或7所述的cDNA为探针，以32P-dCTP标记，借助于Prime Time试剂盒(国际生物技术公司，New Haren，CT)以随机引物方法进行探针杂交。杂交条件为7％+＝烷基硫酸钠(SDS)，0.5M Na3sPO4pH7.0 1mM ED-TA，50℃。杂交过夜后，滤膜用1％SDS，2×SSC冲洗。阳性杂交噬菌斑通过放射自显影检测。在纯化到单个噬菌斑后，分离cDNA插入序列，采用荧光染料标记的双脱氧终止子以链终止法测定它们的序列(应用生物系统公司，Foster城，CA)。
上面描述的标准实验方案可由本领域的技术人员使用以获得来自其它真核生物，尤其高等植物种类与已知原卟啉原氧化酶编码序列有高度同源性的原卟啉原氧化酶基因序列。
被SEQ ID Nos2和6中表示的序列编码的各个蛋白质的推定的氨基酸序列的比较在表1中表示。被SEQ ID Nos4和8中表示的序列编码的各个蛋白质的推定的氨基酸序列的比较在表2中表示。
表1拟南芥(SEQ ID No.2)和玉米(SEQ ID No.6)原卟啉原氧化酶氨基酸序列的比较相似百分比87.137相同百分比78.00851 GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100..|||:|||||||||.||||||:| :..:::||||:.|.||||.
1 ....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44101 T..REENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTMVVDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148| |.|:|:||||||||||||||:|||.||||||||||:|||.|||||||45 TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198:||||||||| .||||||||||.||:|||:|||||||.||||||||||||95 EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248|||||.||||||||||||||||||||||||||||||||:||:.|||||||145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194249 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298|:|.||||...||:.||:|||||.||||:|||||| |||:||...|||||195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244299 KLSWKLSGITKLESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSVVMTVPSHVASGLLRP 348||||||.:||| :. || |.||||:|:||||.|||:||:||.|||.:|||245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398||..||:|||::||||||||.:||||||||.||||||||.||||||||.|295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448|||||||||||||||||||.||:||||||||.|||||:||.|:|||||||345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498||||||||.....||| |||||||||||||||||:|:|:.||..|..:||395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK*538:|||||||||||||||||||||||.| ::.:|:.:|||||445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK*484
相同的残基以两序列间垂直杆表示。采用Deveraux等人，核酸研究12387-395(1984)中描述的GAP方法进行序列比较。
表2拟南芥(SEQ ID No.4)和玉米(SEQ ID No.8)原卟啉原氧化酶-2氨基酸序列的比较相似百分比75.889相同百分比57.9051 ............................MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21.| |:|: .: |..::.|||1 MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 5022 VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71||||||||||||:|: .|:|||||||.:|.|||:|. :.|::|||||||51 VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 10072 MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121|||:| |.:.|:|||||.:|||:| ||.|||||::|.|.::|.:||.|:.
101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167||||||.||:.:::||||:||.|:|||:. .|||:.| :||||.|151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200168 VVDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217||||::||||:||||:||:|||::|.||.|||:|:.:||:||||| .|:|201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267|||:. :. ..|.|.::..|.||||.|||| | :.| ..::.|::.|:..
251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300268 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312||||. :::.. :.||:|. |.:..::: |. :|||||||||:||:
301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362||. |||.|. |:|||.::|:|||:::|.|.|:.||:|||||||||| |351 RMKFTKGGAPVVLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411| ||||:|||||||||||||||.|.| .|||||:|||:|.:|| |.|. |401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461||:|||||.:||||||:|. |.| || .|||||: .|.||:|||:|||.:
451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL*509||||||||| ::||.||. ||||:|||||.|||||| ......:
501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545实施例4从拟南芥cDNA文库分离污染的酵母原卟啉原氧化酶克隆为了鉴定具有原卟啉原氧化酶活性的少数cDNA，对pFL61拟南芥文库按以上方法进行了第二次筛选，再次产生数百个互补克隆。大约600个被各自接种到网格平皿，并在28℃培养18h.。复制的滤膜转移物按制造商说明在菌落/噬菌斑筛选(NEN)膜上制备。分别用EcoRI/xhol和NotI消化，将Protox-1和Protox-2 cDNA从它们的载体上移出。插入序列在1.0％。Seaplaque GTP(FMC)琼脂糖上凝胶电泳分离，切下并用随机引物法以32P标记。每一份转移物用一种探针杂交。杂交和冲洗条件按Church和Gilkert 1984所述进行。
不能显示与Protox-1或Protox-2清晰杂交的克隆(约20个)在液体培养基中扩增，并制备质粒DNA。此DNA用Not1消化，重复的样品走1.0％琼脂糖胶，再Southern印迹到Gene Screen Plus(NEN)滤膜上[New England Nuclear]。这两种已知原卟啉原氧化酶的探针按以前标记和杂交。有两个不是Protox-1或Protox-2的相同克隆。此克隆表现出虽然生长很慢，但能与SAS×38突变体互补，命名为原卟啉原氧化酶-3(protox-3)。
Protox-3以pFL61为载体，1994.6.8以pWDC-5保存(NR-RL #B-21280)。这些编码序列测定后是来自拟南芥cDNA文库中少量污染的酵母DNA。包含在pWDC-5中编码原卟啉原氧化酶-3(Protox-3)的酵母DNA在下面SEQ ID No9中描述。实施例5在细菌系统中植物原卟啉原氧化酶克隆对原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的敏感性的证实Protox-1/SASX38，Protox-2/SASX38和pBluescript/XL1-Blue的液体培养物在L amp100上生长，每种培养物分成100ml等分平板接种到含各种浓度(1.0nM-10mM的具结构式XVII原卟啉原氧化酶抑制型aryluracil除草剂的L amp100培养基。双套平皿在37℃下培养18h.，要在弱光或完全黑暗中培养。
表现出对任何浓度除草剂都不敏感的protox+大肠杆菌菌株XL1-Blue包含对类似除草剂有抗性的自然细菌酶。Protox-1/SAS×38明显是敏感的，它的菌膜在10nM低的浓度的抑制剂下就几乎完全消失。Protox-2/SAS×38也是敏感的，但要在较高的除草剂浓度(10m下)。除草剂对两个植物原卟啉原氧化酶株的作用在弱光下最有效，在黑暗的平皿也显然也完全存在。除草剂的毒性可通过外加20mg/ml的正铁血红素到平皿中而完全消除。
这两个植物原卟啉原氧化酶对除草剂的不同耐受性可能是这两个质粒不同表达的结果，而非此两种酶有内在差别。Protox-1/SAS×38在任何缺血红素的培养基上都比Protox-2/SAS×38长得慢。另外，MZProtox-2/SAS×38株，与拟南芥Protox-1/SAS×38有相当的生长速率，也对较低浓度(10-100nM)的除草剂很敏感。酵母Protox-3克隆的初始特征也表现对除草剂敏感。实施例6在大肠杆菌表达系统中选择对原卟啉原氧化酶抑制型除草剂有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因细菌系统中对植物原卟啉原氧化酶的抑制在大规模筛选植物基因中除草剂抗性突变是很有用的。在将液体培养物平板接种的初始剂量反应测试中，甚至在高浓度的除草剂中也产生高频的抗性克隆。这种抗性不是以再转化/除草剂敏感测试为基础的质粒造成的。转化原卟啉原氧化酶质粒到SAS×38突变株中并直接接种到含除草剂平皿可以几乎完全减少此背景问题。
植物原卟啉原氧化酶质粒可通过各种方法诱变；采用已公开的化学物质方法，(如二硫化钠(Shortle等人酶学方法.100457-468(1983)；甲氧胺(Kadonaga等人.核酸研究.131733-1745(1985)；寡聚核苷酸指导的饱和诱变(Hutchinson等人，美国自然科学研究汇编.83710-714(1986)；或各种聚合酶错误联合方法(见如Shortle等人，美国自然科学研究汇编791588-1592(1982)；Shi-raishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技术111-15(1989)。在整个质粒诱变中的可能启动子上升突变可通过将编码序列再克隆到野生型载体并重新测试而消除。较高的表达可能导致在无除草剂条件下更好的生长，目测筛选编码序列突变株也是可能的。
任何在细菌系统中表达除草剂抗性的植物原卟啉原氧化酶基因可采用此处描述的标准技术通过基因工程达到最适表达并转化进入植物。得到的植物可用除草剂处理也证实和定量测定引入的原卟啉原氧化酶基因产生的抗生水平。实施例7在植物中除草剂抗性微生物原卟啉原氧化酶基因表达的构建编码枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶基因hemY的序列(Hansson和Hederstedt，细菌杂志，1748081(1992)；Dailey等人，生化杂志269813(1994)和编码大肠杆菌原卟啉原氧化酶基因hemG的序列(Sasarman等人，加拿大微生物杂志391155(1993))通过采用标准条件和按公开序列设计的侧面引物的PCR扩增从实验室菌株中分离。这些基因是已知编码除草剂抗性形式的原卟啉原氧化酶的。
采用重叠PCR融合的标准技术(Ausubel等人.分子生物学的现行方案.John Wiley & Sons.公司.(1994))，将两细菌基因融入两个不同拟南芥叶绿体转移肽序列(CTPS)。首先是来自乙酰羟基酸合成酶的CTP(AHAS.Mazur等人，植物生理851110(1987))，此转移肽容许进入叶绿体的基质。第二个来自拟南芥质体蓝素基因(Vorst等人，基因6559(1988))，它具有一个二等分的转移肽。CTP的氨基末端部分指导蛋白质进入叶绿体，而羧基末端指导它进入类囊体膜。所有四个融合基因克隆在2×355启动子之后，而且是在为用土壤细菌转化的转基因植物产物设计的双向表达载体中。
在拟南芥和玉米原卟啉原氧化酶cDNAs的分离之后，来自Pro-tox-1或MZProtox-1的叶绿体转移肽也按上述方法融合到两个细菌原卟啉原氧化酶蛋白中。
上述载体可转化到需要的植物种类，所得的转化子可测试其对除草抗性的提高。实施例8拟南芥/枯草芽孢杆菌基因间结构域的转变以产生嵌合的，抗除草剂的原卟啉原氧化酶一个能用于产生具有在植物中对除草剂抗性和能提供有效的原卟啉原氧化酶活力的原卟啉原氧化酶基因的方法是将细菌和植物原卟啉原氧化酶基因部分融合。产生的嵌合基因可用于筛选那些在植物细胞中能提供除草剂抗性的原卟啉原氧化酶。如拟南芥和枯草芽孢杆菌(hemY)原卟啉原氧化酶肽序列在高同源区有合理的线性对应。hemY编码序列克隆到pBluescript并测试了其在SAS×38中表达除草剂抗性原卟啉原氧化酶。Protox-1/hemY嵌合基因用融合PCR技术构建，接着接回pBluescript载体。初始交换约在蛋白质的中间。产生的融合蛋白用互补法测试其原卟啉原氧化酶功能，然后经过平板接种到含完整Protox-1和hemY对照的除草剂上测试其除草剂抗性。实施例9通过过度表达植物原卟啉原氧化酶基因产生除草剂耐受性植物为了在转基因植物中表达拟南芥或玉米蛋白质，合适的全长cDNA插入到按以下方法以pCGN1761中来的表达载体pCGN1761ENX。pCGN1761在其唯一的EcoR1位点消化，再连接到包含以下两寡聚核苷酸序列的双链DNA片段中，5′AAT TATQAC GTA ACG，TAG，GAA，TTA，GCG，GCCC，GCT，CTC，GAG，T3′(SEQ ID NO.11)和5′AAT TAC TCG，AGA GCG GCC GCGAAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3′(SEQ ID NO.12)。得到的质粒pCGN1761ENX包含在来自花椰菜花叶病毒重复35S启动子(Kay等人，科学2361299-1302(1987))中的唯一EcoR1.Not1和Xhol位点及来自土壤细菌tml基因的3′非转译序列。此质粒酶切后与由一个具原卟啉原氧化酶cDNA的质粒限制酶切产生的片段连结，这样它就带有完整原卟啉原氧化酶cDNA。从此质粒可外切出一个包含拟南芥原卟啉原氧化酶cDNA，侧面接重复35S启动子和土壤细菌tml基因3′非转译序列的Xbal片段。此Xbal片段以位于T-DNA边界序列之间唯一的Xbal位点插入到双向载体pCIB200。产生的质粒，命名为pCIB200 protox，转化到根瘤土壤细菌菌株CIB542中，见如UKnes等人，植物细胞5159-169(1993)。
菸草CV.Xanthi nc的叶子小园片用具pCIB2001GPD的根瘤土壤杆菌CIB542按Horsch等人.科学2271229(1985)描述的方法感染。来自15个独立叶片的卡那霉素抗性芽转移到生根培养基，进一步转移到土壤并且得到的植物在温室中长成熟。这些植物的种子收集后，在包含卡那霉素的MS琼脂培养基上萌发。从各个单独初始转化物来的多个单独对卡那霉素抗性的嫩芽在温室中长至成熟，收集它们的种子。这些种子再含卡那霉素的MS琼脂培养基上萌芽。具有额外卡那霉素抗性嫩芽的植物系纯化后用于插入基因并用以进一步分析。用纸打孔器将15个单独的转基因植物系切小园叶片并放在含有各种不断上升浓度的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的MS琼脂培养基上。
在三周后，将每个株系的两套中10个园片称重记下结果。转基因株系对抑制剂抗性比野生型高，非转化植物选出进一步分析。
从各个株系叶片中提取RNA。来自各独立纯化系和来自非转基因对照植物中总RNA用含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳分离。(Ausubel等人，分子生物学的现行方案，Wiley & Sons，New York(1987)。此胶印迹到尼龙膜上(Ausubel等人，Supra)并用放射性标记的拟南芥原卟啉原氧化酶cDNA杂交。杂交和冲洗条件按Church和Gilbert，美国自然科学研究汇编811991-1995(1984)描述的条件进行。滤膜放射自显影，密集的对应原卟啉原氧化酶转移基因的RNA带在所有除草剂耐受性转基因植物系中观测到。
为进一步提高原卟啉原氧化酶过表达性的抗性，植物种在温室中，并用各种浓度的原卟啉原抑制型除草剂处理。实施例10烟草细胞悬浮培养物的生长培养基MX1此培养基包含Murashige和Skoog(”MS”，T.Murashige等人，植物生理15473-496，1962)主要盐类，微量盐类和Fe-ED-TA(Gibco #500-1117；4.3g/L)，100mg/L肌醇，1mg/L尼克酸，1mg/L吡哆醇-HCl，10mg/L VB1-HCl，2-3g/L蔗糖，0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，和0.04mg/L激动素，pH5.8。此培养基高压灭菌。N6此培养基包含多量元素，微量元素和Fe-EDTA，这在C-C，Chu等人，中国科学18659(1975)中有描述，以及下列有机化合物吡哆醇-HCl(0.5mg/L)，VB1-HCl(0.1mg/L)，尼克酸(0.5mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)和蔗糖(30.0g/l)。溶液高压灭菌，最终pH5.6。注多量元素以10X浓度贮备液制备，微量元素以1000X贮备液制备，维生素贮备液一般以100X浓度制备。
菸草的悬浮培养细胞系S3[Harms和Di Maio，植物生理杂志137，513-519，1991]在液体培养基MX1上生长。含有25mlMX1培养基的锥形瓶接种10ml已生长10天的细胞培养物。细胞在25℃，黑暗下，在轨道摇床上以100rpm(2cm幅度)培养。每隔7天接种等分的样品到新鲜培养基，倾倒或移出约90％细胞悬浮物，接着注入新鲜培养基到所需悬浮体积，这样进行传代培养。250-350mg细胞接种物生长10天能产生5-8g重新鲜细胞物质。实施例11通过将细胞平板接种固体选择培养基生长对原卟啉原氧化酶除草剂型抑制剂有耐受性的烟草细胞培养物按实施例10生长的细胞通过允许细胞沉淀或在500xg短暂离心进行收获，并除去已用过的培养基。细胞再用新鲜培养基稀释至适合平板接种的细胞密度，每毫升约10,000集落形成单位。在接种时，在少量体积的培养基(约1ml)中的细胞平整地铺到含所需浓度的抑制剂的固体培养基(MX1，0.8％琼脂)上部。每10cm陪氏平皿约用20～30ml培养基。合适的抑制剂浓度由剂量反应曲线(实施例14)决定，且至少是敏感野生型细胞IC50的两倍高。
包含扩散到选择培养基细胞的培养平板在25～28℃黑暗中普通生长条件下培养，直至细胞克隆形成。出现的细胞克隆转移至包含所需浓度抑制剂的新鲜培养基中。
上述方法的一个优选的改进是将生长好的悬浮培养细胞首先接种到固体培养基上部少量液体培养基中。将在40℃保持融化状态的等量温液液体琼脂培养基(1.2-1.6％琼脂)加到平皿中，在培养基融化之前，将平皿立刻温和转动使细胞平整扩散在培养基表面，并使细胞与琼脂培养基混合。
作为选择，细胞也可在扩散到选择培养基表面之前与融化的琼脂混和。此方法的优点是细胞镶嵌和固定在选择培养基上面固体培养基薄层中。与细胞镶嵌在整个20-30ml体积中相比，它能提供更好的细胞透气性。实施例12通过细胞在液体选择培养基中生长产生对除草剂原卟啉原氧化酶抑制剂有耐受性的烟草细胞培养物按实施例10培养的细胞以合适的细胞密度接种到含所需浓度除草剂型原卟啉原氧化酶抑制剂的液体培养基MX1中，细胞按实施例10培养和生长，在7～10天周期后，依赖于生长速率，用包含所需浓度抑制剂的培养基，将细胞传代培养。
取决于所用的抑制剂浓度，细胞生长会比无抑制剂慢。实施例13生产具增强水平的原卟啉原氧化酶的烟草细胞为了获得具增强水平的原卟啉原氧化酶的细胞培养物或愈伤组织，悬浮培养物或愈伤组织以步骤合理的方式转移到不断增高浓度的除草剂型原卟啉原氧化酶抑制剂中。具体的说以下步骤表示为实施例11中平板接种细胞出现的细胞集落转移到包含与根据实施例11中选择使用的相同浓度的原卟啉原氧化酶抑制剂的MX1培养基中以制备悬浮培养物。另外，实施例12中选出的细胞悬浮培养物在包含与实施例12相同浓度原卟啉原氧化酶抑制剂的液体MX1培养基中传代培养。
培养物以周为间隔传代培养1～20次，然后传代培养到包含下一个更高除草剂浓度的MX1培养基。此细胞在包含此较高浓度除草剂的培养基培养1～10个传代培养物。然后，此细胞转移到含有下一个更高浓度除草剂的MX1培养基中。
作为选择，实施例11中选出的愈伤组织块转移到含所需浓度除草剂的固化MX1培养基上。按照前面段落列出的除使用固体培养基以外的步骤转移到更高浓度的除草剂中。实施例14测定悬浮培养物中的细胞除草剂剂量依赖生长为了获得剂量反应曲线，测定在不同除草剂浓度下细胞的生长。除草剂型原卟啉原氧化酶抑制敏感的野生型烟草细胞S3的悬浮培养细胞和选出的对除草剂耐受的或转基因细胞S3和除草剂耐受的或转基因细胞在实施例11中的液体培养基中以高密度预生长2～4天。这些细胞洗去用过的培养基，再加入无除草剂的新鲜培养基使之达到需要浓度(约150mgFW细胞每毫升悬液)。2.5ml悬液，包含约250～300mg FW细胞的样品接种到装有30ml具所需除草剂浓度的液体培养基的锥形瓶中。小心接种同样量的细胞到各瓶中，每个锥形瓶包含相同体积培养基。每个除草剂浓度接种3～6个重复锥形瓶。除草剂浓度从O(＝对照)，0.1ppb，0.3ppb，1ppb，3ppb，10ppb，30ppb，100ppb，300ppb，1000ppb，3000ppb和10，000ppb。在接种以测定每个接种瓶中细胞量时，也要接种几个样品。
然后细胞接种在28℃，黑暗的对照条件下生长10天。细胞的收获可将各个瓶子中物质倾入附在真空吸滤装置的滤纸片上以除去所有液体，以获得合理的干新鲜细胞量。新鲜的细胞团进行称重，样品的干重得在干燥后获得。
细胞的生长以10天内细胞增量来测定和表达，并按以下方程以与无除草剂细胞生长的百分比表示((最终加除草剂细胞生长质量—接种量)×100/(无除草剂细胞生长量-接种量))。IC50值从绘制数据图表(相对细胞质量对除草剂浓度)上测定。IC50表示细胞生长为对照生长(细胞在无除草剂下生长)的50％的除草剂浓度。
此方法的改进中，除草剂抗性细胞培养物，正如在实施例11和13中得到的，其中的一些愈伤组织碎片转移到包含不同除草剂浓度的固体愈伤组织培养基中，相对生长在培养周期2～6周后测定，称量愈伤组织块并与在无除草剂培养基的对照培养相比较。然而，优选悬浮方法因其更精确。实施例15交叉耐受的测定为了测定细胞表现对类似物或其他除草剂的耐受程度，通过在不断上升的选定除草剂浓度上生长细胞来重复实施例14。对每种除草剂测定细胞的相对生长和它们的IC50值并比较。实施例16测定除草剂耐受性表型在时间上的稳定性为了测定一个细胞培养物的除草剂耐受性表型是否能长时间维持，细胞被从有除草剂培养基转移到无除草剂培养基。按实施例10描述，细胞在无除草剂下生长3个月，并有规律地以合适间隔进行传代培养(7～10天悬浮培养，而对于愈伤组织培养要3～6周)。已知量的细胞转移回含除草剂培养基中，并培养10天(悬浮培养)，或4周(愈伤组织培养)。相对生长按实施例14测定。实施例17诱导和培养来自玉米盾片组织的胚原性愈伤组织谷穗在自花传粉玉米的纯培养系Funk 2717授粉后12-14天收获。谷穗移去外壳，然后在加了几滴除污剂以更好湿润的20％商业Chlorox漂白液中摇15分钟以灭菌。谷穗再用无菌水洗几次，以后步骤在灭菌空气流动框中无菌操作。1.5-2.5mm长的胚从具匙突的核中移出并胚轴向下放置在包含2mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和3％蔗糖的培养基上，培养基用0.24％GelriteR固化。
胚原性愈伤组织在将胚的盾片组织在28℃黑暗中培养2-4周形成。此愈伤组织从外植体中移出并转移到包含2mg/l 2，4-D的新鲜固体MS培养基中。胚原性愈伤组织的传代培养以因为间隔重复。只有具胚原性形态的愈伤组织部分传代培养。实施例18选择对除草剂型原卟啉原氧化酶耐受的玉米细胞培养a)使用胚原性愈伤组织的选择来自实施例17的胚原性愈伤组织转移到包含含有2mg/l 2，4-D，3％蔗糖的N6培养基和足以阻滞生长但不影响培养的胚原性的浓度的原卟啉原氧化酶抑制剂；并以0.24％GelriteR固化的愈伤组织维持培养基上。为提高除草剂耐受性突变的频率，培养物在选择前可用化学诱变剂如乙酰甲烷硫酸或物理诱变剂，如UV光预处理，并在仅比实施14中测定的抑制生长浓度低的浓度上生长。培养物在28℃，黑暗中培养。在14天生长后，愈伤组织转移到相同组分的新鲜培养基上。只有具所需胚发生形态的即已知为可改变胚发生愈伤组织II型形态的培养物进行传代培养。通过以周为间隔的传代培养，在新鲜培养基上繁殖2～10个传代培养物，只有那些生长最快的培养物进行传代培养。最快生长的愈伤组织转移到包含实施例11设定的合适的原卟啉原氧化酶抑制剂的愈伤组织维持培养基上。一般在约5～10周的传代亚培养后，愈伤组织在此除草剂浓度生长很好，此愈伤组织再转移到含有三倍高浓度的抑制剂的愈伤组织维持培养基上，并传代培养至获得生长好的培养物。此过程采用包含浓度10倍高于原始合适浓度的原卟啉原氧化酶抑制剂的培养基重复操作，然后再用包含20和40倍高浓度的培养基。
当足够的愈伤组织产生后，将其转移到适合胚胎成熟和植物再生的再生培养基上。在各个除草剂浓度上生长的胚发生愈伤组织转移到再生培养基上。
b)使用胚发生性悬浮培养的选择玉米Funk纯系2717的胚发生性悬浮培养按实施例24建立并通过以周为间隔在新鲜包含2mg/L 2，4-D的液体N6培养基上保持。为提高除草剂耐受性突变的频率，此时，培养物可用化学诱变剂，如乙酰甲烷硫酸处理，并且按实施例14中测定的，仅低于可观测到生长抑制浓度的浓度。为了选择，培养物转移到包含2mg/l 2，4-D和足以使生长停滞但不影响培养胚胎发生的抑制剂浓度的液体N6培养基中。培养物在28℃，黑暗中，120rpm摇床上生长。以周为间隔，培养基移去后加入新鲜培养基。培养物按照它们的生长用培养基稀释以维持在每50ml培养基中含10ml聚集的细胞体积。对于每个传代培养，培养物要进行观测，只有具所需可变胚发生形态的快速生长培养物保留以进一步传代培养。在含N6培养基中经过2～10，传代培养后，对于每周传代培养，培养物生长速率上升至少2～3倍。此培养物再转移到包含2mg/L 2，4-D和比原始所用高3倍剂量的抑制剂的N6培养基。生长的培养物按上述重复地在此培养基上传代培养2～10个传代培养物。具有需要的可变胚发生形态的快速生长培养物选出进一步传代培养。快速生长培养物转移到包含2mg 2，4-D和比原始所用抑制剂浓度高10倍的N6培养基，具所需可变胚发生形态的传代培养生长培养物的过程重复2～10次传代培养直至获得快速生长培养物。此培养物再转移至包含2mg/l 2，4-D和30倍初始浓度的抑制剂的N6培养基。
为了使所提到除草剂浓度水平选出的胚发生悬浮培养物再生植物，此培养物首先转移至用0.24％GelriteR固化并包含2mg/l 2，4-D和可选择的培养物曾生长的浓度抑制剂的N6培养基上以产生胚发生愈伤组织。此胚发生愈伤组织传代培养到新鲜愈伤组织维持培养基中直至获得足够再生的愈伤组织。只有具所需胚发生形态的培养物进行传代培养。实施例19从选出的愈伤组织和悬浮培养物中再生玉米植株从实施例13中选出的胚发生性愈伤组织培养物通过转移到新鲜的再生培养基上再生出植株。使用的再生培养基有由缺少2，4-3的N6培养基组成的ON6培养基，或由含有0.25mg/l 2，4-D和10mg/l激动素(6-呋喃甲基腺嘌呤)的N6培养基组成的N61培养基，或由含有0.1mg/l 2，4-D和1mg/l激动素的N6培养基组成的N62培养基，全都以0.24％GelriteR固化。培养物在28℃光照下生长(16h每天，10-100 Einsteins/m2sec，采用白色荧光灯)，此培养物每隔两周在新鲜培养基上传代培养。3～8周出现小植物。小植物至少2cm高后从粘附的愈伤组织转移到根促生培养基中。有不同的根促生培养基可采用。这些培养基包括缺乏维生素，具普通量的盐或盐减半，蔗糖减至1g/l，并缺少生长调节物或包含0.1mg/lα-萘乙酸的N6或MS培养基。一旦根长得足够了，小植物移植到包含杀蠕虫剂，泥炭藓和花园土的盆栽混合物中。在移植时所有愈伤组织都除去，所有琼脂都洗净，叶子剪除一半。小植物在温室中生长，开始用倒置透明塑料杯盖几天以保持温度和在阴处生长。在适应气候后，植株再移栽并生长至成熟。肥料peters 20-20-20(Grace Sierra)用于确保植株健康成长。开花植物要授粉，优选自花授粉。实施例20构建植物转化载体有许多转化载体可用于植物转化，本发明的基因可用于与任何这样的载体相联。所用载体的选择依赖于优选的转化技术和转化的目标种类。对于某些目标种类，优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。在转化中使用的常规性选择标记包括能提供卡那霉素或其它相关抗生素抗性的nptll基因(Messing & Vierra，基因19259-268(1982)；Beran等人，自然304184-187(1983))，能提供除草剂phosphinothricin抗性的bar基因(White等人.，核酸研究.181062(1990)，Spencer等人，理论应用遗传学79625-631(1990)，能提供对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger & Digqelmann，分子细胞生物学42929-2931)，和能提供对Methotrexate抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO杂志 2(7)1099-1104(1983))(1)构建适合土壤杆菌转化的载体许多载体可用于对根瘤土壤杆菌进行转化。这样典型的组合至少包括一个T-DNA边界序列并包括如pBIN19等的载体。(Be-van.核酸研究(1984)).下面描述了两种典型载体的构建。
pCIB200和pCIB2001的构建用于构建土壤杆菌中重组载体的双功能载体pCIB200和pCIB201按以下方式构建。pTJS75Kan的构建是通过允许外切四环素抗性基因条件下用Narl消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，细菌杂志164446-455(1985))，接着插入带NPT11的pUC4K中的Accl片段(Messing & Vierra基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBrida等人，植物分子生物学14266-276(1990))。Xhol接头(linker)接到含有T-DNA左右边界，一个植物可选择的nos/nptll嵌合基因和puc多向接头(polylinker)的pCIBT的EcoRV片段上(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，Xhol-消化片段克隆到Sall消化的pTJS75kan中以构建pCIB200(见EP0332104，实施例19(13387)。p CIB200含以下单一的多向接头限制位点CcoR1，Sstl，Kpnl，Bgll，Xbal，和Sall。p CIB2001是通过插入其它限制性位点的多向接头而产生的p CIB200的衍生物。p CIB2001的多向接头的单一限制位点有EcoR1，Sstl，Kpnl，Bglll，Xbal，Sall，Mlul，Bcll，Arrll，Apal，Hpal，和stul。除了含有这些单一限制性位点外，p CIB2001也有植物和细菌卡纳霉素选择。用于土壤杆菌介导的转化的T-DNA左右边界，RK2衍生的trfA的在大肠杆菌和其他受体间运动的功能，也来自RK2的OriT和OriV的功能。此p CIB2001多向接头适合于克隆含其自身调控信号的植物表达框。
p CIB10和其潮霉素选择衍生物的构建双向载体p CIB10包括一个编码用于在植物中选择的卡那霉素抗性的基因，T-DNA左右边界序列和来自广泛受体范围的质粒pRK252并允许其在大肠杆菌和土壤杆菌中复制的非联合序列。它的构建在Rothstein等人，基因53153-161(1987)中描述。Gritz等人.基因25179-188(183))中描述了插入了潮霉素B磷酸转移酶基因的各种p CIB10衍生物的构建。这些衍生物能够在只有潮霉素(p CIB743)或潮霉素和卡那霉素(p CIB715；p CIB717)上挑选转基因植物细胞〔Rothstein等人，基因53153-161(1987)〕。(2)构建适合非土壤杆菌转化的载体不使用土壤杆菌的转化可迥避在选择转化载体时对T-DNA序列的需要，因而除了如上描述的含T-DNA序列的载体外，可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击，原生质体提高(如PEG和电穿孔)和显微注射变化。载体的选择主要依赖于较优选的转化物种。下面是对构建一些典型载体的描述。p CIB3064的构建p CIB3064是p UC衍生的并适合于与采用除草剂basta(或phos-phinothricin)选择的直接基因转移技术结合。质粒p CIB246包括与大肠杆菌GUS基因有效融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录终止子并在PCT公开申请WO 93/07278中有描述。此载体的35S启动子有两个启始位点5′的ATG序列。这些位点可采用标准PCR技术突变，通过此法可除去ATGs并产生Sspl和Pvull限制性位点。新的限制位点离Sall单一位点96和37bp，离准确启始位点101和42bp。所得的p CIB246衍生物命名为p CIB3025。然后GUS基因通过Sall和Sacl消化从p CIB3025上切下，末端变成平头并重连接以产生质粒p CIB3060。质粒pJIT82从John Innes Centre，Norwich获得，包含来自链霉菌的bar基因的400bp Smal片段切下并插入到p CIB3060的Hpal位点(Thompson等人，EMBO杂志.62519-2523(1987))。这样产生的p CIB3064包含用于除草剂选择的在CaMV 35S启动子和终止子控制下的bar基因，一个氨苄青霉素抗性基因(用于在E.coli中选择)和具有Sph1，Pst1，Hind111和BamH1单一位点的多向接头。此载体适合克隆包括其自身调节信号的植物表达框。
p SOG19和p SOG35的构建p SOG35是利用大肠杆菌二氢叶酸脱氢酶(DHFR)基因为提供对Methotrexate抗性的选择性标记的转化载体。采用PCR扩增pSOG10中的35S启动子(～800bp)，来自玉米Adh1基因的内含子6(～550bp)〔Lou等人，Plant J.3393-403 1993；Dennis等人，核酸研究123983-4000，1984〕和Gus的18pb非转译引导序列。一个编码大肠杆菌二氢叶酸脱氢酶II型基因的250bp片段也通过PCR扩增，这两个PCR片段与包含pUC19载体主链和nopaline合成酶终止子的p B1221(Clonteeh)的Sacl-Pstl片段组装。这样的组装就产生了包含与内含子6序列融合的35S启动子，GUS引导序列，DHFR基因和nopaline合成酶终止子的pSOG19。将p SOG19中GUS引导序列以玉米褪绿病花叶病毒(MCMV)的引导序列代替产生载体p SOG35。p SOG19和p SOG35带有氨其青霉素抗性的pUC基质和共克隆外源基因的Hindlll，Sph1，Pst1和EcoRI位点。p SOG10此β-葡糖苷酸酶(GUS)表达载体是从买自Cloneteds实验室，Palo Alto，California的质粒p B1121衍生的。玉米Adh1基因的内含子6用PCR从质粒p B428中扩增，采用了寡聚核苷酸引物SON0003和SON004；如Bennetzen等人，美国自然科学研究汇编814125-4128(1987)中所述。
SON00035′-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3′SON004.5′-ACGGGATCCAACrTCCTAGCTGAAAAATGGG-3′此PCR反应产物用限制性核酸内切酶BamH1消化，在每个PCR引物5′末端的BamH1位点切开。产生的DNA片段在琼脂糖凝胶上纯化并与在p B1121 CaMV 35S启动子和GUS基因之间的BamH1位点连接。连接的DNA转化到E.coli并克隆与限制酶切鉴定的GUS基因相同方向的Adh1内含子6。p SOG19此二氢叶酸还原酶(DHFR)表达载体是将35S启动子p SOG19中Adh1内含子6与质粒pHCO的DHFR基因按Bourouis和Jarry，EMBO杂志21099-1104(1983)描述方法融合产生。35S启动子和Adh1内含子6是p SOG10中的片段，以SON0031和SON0010为引物PCR扩增而得到。
SON00315′-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3′SON00105′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′所得的片段用限制性核酸内切酶Pst1和BspH1消化，并用琼脂糖纯化。
DHFR编码区通过以SON0016和SON0017为引物将pHCO用PCR扩增而产生。
SON00165′-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3′SON00175′-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3′得到的片段用限制酶Nsol和Sac1消化并在琼脂糖凝胶上纯化。
上述两个片段连接到通过用限制性内切酶Pst1和Sac1消化并在琼脂糖上纯化含Nos终止子区和p BI121和p UC19区的3kb片段从p BI121制备的载体片段。此三向连接物35S启动子-Adh1内含子6-DHFR基因-Nos终止子以正确顺序和方向融合以便在植物中功能性表达。p SOG30此GUS表达载体是从pSOG10通过按lommel等人，病毒学181382-385(1991)以三向联接将玉米褪绿花叶病素(MCMV)引导序列插入到35S-GUS基因非转译引导序列中而产生。
17bp MCMV外壳蛋白引导序列加上合理限制性内切酶信号的双链可合成并退火。产生的双链片段可用BamH1和Ncol消化并在聚丙烯酰胺凝胶上纯化。
此GUS基因编码区以SON0039和SON0041为引物，以pBI121为模板用PCR扩增。
SON00395′-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3′SON00415′-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3′这些引物可在GUS5′末端加一个Ncol位点，在GUS 3′末端加一个Sacl位点。得到的片段用限制性内切核酸酶Ncol和Sacl消化，并在琼脂糖凝胶上纯化。
GUS基因从质粒p SOG10上通过限制性内切酶Sacl酶切和限制性内切酶BamHI部分酶切而移去，产生的有可在35S启动子-Adh1内含子6后插入编码序列的BamHI和Sac1位点的载体在琼脂糖凝胶上纯化。
上述三个片段以三向连接物形式连接产生具以下结构的基因融合物35S启动子-Adh1内含子6-MCMV引导序列-GUS-NOS终止子，所有的都以pUC19载体为主链。p SOG35DHFR选择性标记载体除MCMV引导序列插入在DHFR基因非转译引导序列中以增强转移外与p SOG19相同。以两步进行构建首先一个除含有不是35S的修饰的Adh启动子外与p SOG30相同的载体p SOG32中的GUS编码序列被p SOG19中的DHFR编码序列经过用Ncol和Sacl切下GUS，并以Ncol-Sacl片段联接进DHFR而代替。这样产生的载体p SOG33具Adh启动子-Adh1内含子6-MCMV引导序列-DHFR编码区-Nos终止子，在启动子和内含子之间的Bg111位点及编码区和终止子之间的Sacl位点的基因结构。Bg111-Sacl片段通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶纯化而分离，并联入p SOG30的BamHI和Sacl位点；用p SOG33的Adh1内含子6-MCMV引导序列-DHFR编码区代替p SOG30的Adh1内含子Z6-MCMV引导序列-GUS编码区。实施例21构建植物表达框想要在转基因植物中表达的基因序列首先组装在一个合适的启动子之后和一个合适转录终止子的上游的表达框中，这些表达框就能容易地转移到上面实施例19描述的植物转化载体中。启动子的选择在表达框中启动子的选择将决定转移基因在转基因植物中表达的空间和时间形式。选定的启动子会在特定细胞类型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转移基因而且此选择将反映转移基因要表达的位置。并且，选定的启动子可使基因在先诱导或其他时间调控启动子下表达。进一步选定的启动子可被化学物质调控。这样使转移基因只有在需要时和用化学物质处理时才会使诱导表达成为可能。转录终止子多种转录终止子可在表达框中使用。这将导致超过转移基因转录的终止及它的正确多聚腺苷的产生。合适的转录终止子并已知在植物中作用的包括CaMV 35S终止子，tml终止子，nopaline合成酶终止子，豌豆rbcs E9终止子。这些都可在单子叶或双子叶植物中应用。增强或调控表达的序列许多序列发现能在转录单元内增强基因表达，并且这些序列能与本发明的基因联合使用以提高它们在转移植物中的表达。
多种内含子序列能表现出增强表达，尤其在单子叶细胞。例如玉米Adh1基因的内含子已发现在导入细胞后能很强地促进在它同源启动子下野生型基因的表达。内含子1发现特别有效地促进与氯霉素乙酰转移霉基因融合的结构的表达(Callis等人，基因开发11183-1200(1987))。在相同表达系统中，玉米bronzel基因内含子具相似增强表达作用(Callis等人，同上)。内含子序列已常规性联入到植物转化载体，尤其是在非转译引导序列中。
许多来自病毒的非转译序列也已知能促进表达，而且在双子叶植物细胞中特别有效。特别是烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)引导序列，玉米褪绿斑病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的引导序列已表现出很有效地增强表达(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；(Kuzeski等人，植物分子生物学1565-79(1990))。细胞内基因产物的导向多种引导基因产物的机制已知存在于植物中，并且控制和使机制运行的序列已有一些较详细的鉴定。如叶绿体基因产物的导向就由在各种蛋白质氨基末端在叶绿体产生成熟蛋白时要切除的信号序列控制(如Comai等人，生化杂志26315104-15109(1988))。这些信号序列可与异源基因产物融合影响异源产物进入叶绿体(Van den Broeck等人，自然313358-363(1985))。编码适合信号序列的DNA可从编码RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合成酶，GS2蛋白等其它已知位于叶绿体的蛋白的cDNAs 5′末端分离。
其它基因产物位于其它细胞器如线粒体和过氧化物酶体(如Unger等人，植物分子生物学13411-418(1989))。这些产物的编码CDNA也可用于影响异源基因产物对这些细胞器的导向。这些序列的例子是线粒体核编码ATP酶，特异的天冬氨酸转移酶同功酶。细胞蛋白体的导向在Rogers等人，美国自然科学研究汇编826512-6516(1985))中有描述。
使基因产物导向到其它细胞空间的另外序列已有描述。氨基末端序列负责导向ER，非原质体和糊粉层细胞的细胞外分泌(Koehler& HO，植物细胞2769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列结合负责基因产物的液泡导向(Shinshi等人.植物分子生物学.14357-368(1990))。
将上述的合适引导序列与感兴趣的转移基因序列融合，可以引导基因产物到任何细胞器和细胞空间。对于叶绿体导向，如RU-BISCO基因，CAB基因，EPsP合成酶基因或GS2基因信号序列在转移基因氨基末端ATG框中融合。选定的信号序列要包含已知切割位点并且构建的融合物要考虑要求切割的切割位点后所有氨基酸。许多时候这个要求可通过在切割位点和转移基因间加入少量氨基酸或进一步在转移基因序列内替换一些氨基酸来满足。用于叶绿体进入的融合物能够通过体外对体外转录产物的转译，接着采用下面描述的技术测定叶绿体体外吸收来测定叶绿体的吸收效率C Bartlett等人.在Edelnann等人(Eds)叶绿体分子生物学方法，Elsevier.pp1081-1091(1982)；Wasmann等人，分子基因遗传学205446-453(1986))。这些构建技术在本发明中是众所周知的并且也可用在线粒体和过氧化物体。转移基因的表达可能要求的导向的选择依赖于前体的细胞位置要求作为给定路线的起点。这通常为胞质的或叶绿体的，尽管有些情况是线粒体和过氧化物体。转移基因的产物一般不需导向ER，非原质体或液泡。
上述细胞导向机制可不仅用于与它们同源启动子联合，也可与异源启动子联合，这样可去影响在此转录启动子调控下特异的细胞导向，因而具有与引导信号来源的启动子不同的表达形式。实施例22双子叶植物的转化双子叶植物的转化技术是本领域已知的，包括土壤杆菌的基础的技术和无需土壤杆菌的技术非土壤杆菌技术包括原生质体和细胞对外源基因材料的直接吸收。这些可通过PEG或电穿孔介导的吸收，粒子轰击介导的输送，或显微注射来获得。这些技术的实例在Paskowski等人EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykus等人，分子基因遗传学199169-177(1985)，Reich等人，生物技术41001-1004(1986)和Klein等人，自然32770-73(1987)中描述。在各例中转化细胞采用本领域已知的标准技术再生成完整的植株。
土壤杆菌介导的转化是一个优选的转化双子叶植物的技术，因为它有高的转化效率和在许多种类中有广泛使用。一些土壤杆菌常规转化的作物种类包括烟草，西红柿，向日葵，棉花，油菜，土豆，大豆，苜蓿和杨树(EP 0317511(棉花)，EP 0249432(西红柿，Calgene)，WO 87/07299(芸苔，Calgene)，US 4,795,855(杨树))。土壤杆菌转化典型地包括将带有感兴趣外源DNA的双向载体(如p BI121(pCIB200或p CIB2001)转移到合适的土壤杆菌菌株，这依靠受体土壤杆菌共生质粒T；或染色体上带的Vir基因的互补(如p CIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等人，植物细胞5159-169(1993))。转移重组双向载体到土壤杆菌通过使用带有重组双向载体的大肠杆菌的三素本杂交过程而获得，它是一种辅助大肠杆菌菌株具有诸如p RK2013的质粒，能够移动重组双向载体到目标土壤杆菌菌株。作为选择，重组双向载体也可通过DNA转化转移至土壤杆菌(HOfgen & Willmitzer，核酸研究169877(1988))。用重组土壤杆菌转化目标植物种类常包括土壤杆菌与植物外植体共同培养并按本领域已知的方法进行。在双向质粒下DNA边界序列间有抗生素或除草剂抗性标记的转化组织在选择性培养基上再生。实施例23单子叶植物的转化大多数单子叶植物的转化现已变成常规性的。优选的技术包括用PEG或电穿孔技术直接转移基因到原生质体，粒子轰击使之进入愈伤组织。转化可在单DNA种类或多DNA种类(即共同转化)中进行，而且这些技术在本发明中适用。共同转化具有可避免复杂载体构建和产生具有感兴趣的基因与选择性标记不相联的基因座的转基因植物，且可在以后世代中除去选择性标记等优点。这些都可认为是需要的。但是，使用共同转化有一缺点为整合到基因组中分开的DNA种类频率少于100％(Schocher等人.生物技术41093-1096(1986))。
专利申请EP 0292435(Ciba-Geigy)，EP 0392225(Ciba-Geigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了一个玉米精华纯培养系列制备愈伤组织和原生质体，使用PEG或电穿孔转化原生质体，以转化原生质体再生玉米植株的技术。Gorden-Kamm等人，PlantCell 2605-618(1990)和Fromm等人，生物技术8833-839(1990))已出版了用粒子轰击转化A188-衍生玉米系的技术。而且申请WO 93/07278(to Ciba-Geigy)和Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)描述了用粒子轰击转化玉米纯培养系的技术。此技术采用从授粉14-15天后玉米穗上切下长1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚及PDS-100He Biolistis轰击装置。
水稻的转化可通过采用原生质体和粒子轰击的直接基因转移技术操作。原生质体介导的转化对Japonica-型和Indica-型有描述(Zhang等人，Plant Cell Rep.7379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338274-277(1989)；Dafta等人.生物技术8736-740(1990))。两种类型也都可用粒子轰击常规转化(Christou等人，生物技术9957-962(1991))。
专利申请EP 0332581(Ciba-Geigy)描述了产生、转化和再生Pooideae原生质体的技术。这些技术可用于鸭芽和小麦的转化。另外，小麦转化可用Vasil等人，生物技术10667-674(1992))描述的粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织细胞中，也可用Vasil等人，生物技术111553-1558(1993))和Weeks等人，植物生理1021077-1084(1993)描述的粒子轰击未成熟胚和未成熟胚来源愈伤组织。一个较优的小麦转化技术包括通过粒子轰击未成熟胚的小麦转化和包括在基因输送前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，许多胚(0.75-1mm长)平板接种至含3％蔗糖(Murashige & Skoog，植物生理15473-497(1962))和用于在黑暗中诱导体细胞胚的2，4-D 3mg/l的培养基上。在选定的轰击日子，将胚从诱导培养基移至渗压剂上(即有蔗糖和麦芽糖加到需要浓度，典型的为15％的诱导培养基)。这些胚允许质壁分离2-3h再轰击。典型的是每平皿20个胚，尽管这不是关键的。使用标准方法将合适的基因携带质粒(如p CIB3064或p SG35沉积到毫米大小的金粒上。每个平皿的胚用DuPont Biolistics射击，氦气装置为标准80目筛，约1000Psi爆发压力。在轰击后，胚放回黑暗中恢复约24h(仍在渗压剂中)。24小时后，胚从渗压剂移至诱导培养基并在上面保持约一个月直至再生前。约一个月后，构建胚形成愈伤组织的胚外植物转移到进一步包含合适选择剂(如在p CIB3064情况下为10mg/l basta，在p SOG35情况下为2mg/l methotrexate)的再生培养基(MS+1mg/l NAA，5mg/lGA)。又在约一个月后，产生的芽转移到称为“GATS”并装有半强度MS，2％蔗糖，和相同浓度选择剂的无菌容器中。专利申请08/147,161中描述了小麦转化方法，本文引用作为参考。实施例24在大肠杆菌表达系统中选择对原卟啉原氧化酶抑制型除草剂有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因。
将玉米叶绿体原卟啉原氧化酶编码质粒p WDC-4转化到随机诱变株XL1-Red(Stratagene.la Jolla，CA)中。转化物接种到含50g/ml氨苄青霉素的L培养基上在37℃培养48h。转化细胞层从平板上刮下并用Wizard Megaprep试剂盒promega，Madison WI)提取质粒DNA。从此突变株分离的质粒DNA约含有2000个核苷酸一个碱基改变(见Greener等人，策略T(2)32-34(1994))。
突变质粒DNA转化到hemG突变株SAS×38(Sasarman等人，遗传微生物学杂志113297(1979)并平板接种含100g/ml氨苄青霉素的L培养基和包含各种浓度原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的相同培养基上。这些平板在37℃培养2-3天。质粒DNA从所有在含有能有效杀死野生型菌株的除草剂浓度上生长的克隆中分离出。分离到的DNA再转化到SAS×38，再平板接种到除草剂上确定抗性是质粒携带的。
突变的p WDC-4质粒DNA再从抗性克隆中分离，并用EcoR1和Xhol将原卟啉原氧化酶编码序列切下，切下的原卟啉原氧化酶编码序列再克隆到未突变的p Bluscript载体上并按上述同样方法测试其对原卟啉原抑制型除草剂的抗性。
该方法消除了提供抗性的非编码序列突变如启动子上升突变(即突变体的抗性是突变导致未修饰原卟啉原氧化酶表达上升)而仅留下抗性是由于原卟啉原氧化酶编码序列突变造成的突变体。对所有用此法测定为纯的除草剂抗性原卟啉原氧化酶基因DNA序列进行测定，并通过与野生型p WDC-4原卟啉原氧化酶序列比较鉴定突变。
通过上述过程，鉴定了一个在p WDC-4序列(SEQ ID NO 5)中498位核苷酸由C变为T的抗性突变。带有此突变的质粒命名为p MzC-1Val。这个在166氨基酸(SEQ ID NO.6)由丙氨酸密码子GCT变为缬氨酸密码子GTT的转变导致了在细菌测试中原卟啉原氧化酶对原卟啉原氧化酶抑制性除草剂抗性至少高10倍。在p Bluscript SK载体中的p MiC-1Val于1994年9月30以pWDC-8命称保存在农业研究培养物收集中心并给定保存号NRRL#21340。
同样的方法用于在各种载体中筛选拟南芥原卟啉原氧化酶-1基因的除草剂抗性形成。鉴定到一个在p WDC-2序列(SEQ IDNO.1)689核苷酸由C变为T的抗性突变。此质粒定为pAraC-1Val。这个改变与上面p MzC-1Val突变体相同，将在拟南芥protox蛋白序列相应位置的220氨基酸(SEQ ID NO.2)处丙氨酸密码子GCT变为缬氨酸密码子GTT。
第二个抗性基因包括在p WDC-2序列(SEQ ID NO.1)的1307核苷酸的A变为G，此质粒定为p AraC-2Cys。这个改变为在426氨基酸(SEQ ID NO.2)酪氨酸密码子TAC转变成胱氨酸密码子TGC。这个在玉米protox-1序列在核苷酸顺序1115-1117(SEQID NO.5，氨基酸位置372，SEQ ID NO.6)对应的酪氨酸密码子相似突变后会产生此酶的除草剂抗性形式。
第三抗性突变在p WDC-2序列(SEQ ID NO.1)691核苷酸由G变为A。此质粒命名为p Arac-3Ser。这个突变体在与p Arac-1突变体邻近的密码子位置221氨基酸(SEQ ID NO.2)甘氨酸密码子GGT变为Ser密码子AGT。在玉米protox-1序列497-499核苷酸位置(SEQ ID NO.5，氨基酸位置167 SEQ ID NO.6)对应的甘氨酸密码子可相似突变产生此酶的除草剂抑制形式。
上述突变产生的原卟啉原氧化酶在细菌测试中至少有10倍的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂抗性。
在p Fl61载体中的p Arac-2cys于1994年11月14日定为pWDC-7，保存在农业研究培养物收集中心，并给定保存号NRRL#21339N。实施例25在随机筛选鉴定的位置额外的除草剂抗性密码子替换在随机筛选中鉴定为除草剂抗性位点的氨基酸被其他氨基酸替代并在细菌系统中测定其功能和除草剂抗性。拟南芥Protox-1序列的寡聚核苷酸指导的突变通过Trahsformer Site-Directed Mu-tagonesis试剂盒(Clotech.Palo Alto，CA)实施。在氨基酸的改变通过序列分析证实后，突变的质粒转化到SAS×38并平板接种到L-amp100培养基上以测试其功能，在各种浓度原卟啉原氧化酶抑制型除草剂上测试其耐受性。
该方法用于拟南芥原卟啉原氧化酶序列(SEQ ID NO.1)在688-690核苷酸的丙氨酸密码子和1306～1308核苷酸的酪氨酸密码子。结果表明在688-690核苷酸的丙氨酸密码子能改变为缬氨酸，苏氨酸，亮氨酸或胱氨酸密码子都可产生有功能并对除草剂抗性的原卟啉原氧化酶。结果进一步表明在1306～1308核苷酸的酪氨酸密码子可改变为胱氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸或苏氨酸密码子而产生有功能并对除草剂有抗性的原卟啉原氧化酶。实施例26抗性突变对各种原卟啉原氧化酶抑制化合物的交叉耐受性选出对单一除草剂抗性的抗性突变质粒进行对其他原卟啉原氧化酶抑制化合物抗性谱的测试，包含野生型质粒的SAS×38株接种到有一个浓度范围的各种化合物上以测定各化合物的致死浓度。接种SAS×38的抗性突变质粒，并在含有至少10倍包含野生型质粒SAS×38株致死浓度的各种化合物上存活。
交叉耐受测试结果表明鉴定的突变体对各种原卟啉原氧化酶抑制型化合物有抗性。具体的说，结果表明1)AraC1-Val突变提供的原卟啉原氧化酶抗性包括但不限于此具有结构式IV，XI，XIII，XIV和XVII的化合物。2)AraC-2Cys突变提供对原卟啉原氧化酶抑制剂抗性包括，但不仅限于对具结构式XI，XIII，XV和XVII的化合物有抗性。3)MzC-1Val突变体提供对原卟啉原氧化酶抑制剂抗性包括，但不仅限于对具结构式XI，XII，XIII，XIV，XV，XVI和XVII的化合物有抗性。4)AraC-3Ser突变提供对原卟啉原氧化酶抑制剂抗性包括但不仅限于对具结构式IV，XII，XIII，XIV，XV和XVII的化合物有抗性。实施例27通过过度表达植物原卟啉原氧化酶基因产生除草剂耐受性植物来自野生型和抗性突变AraC-1Val基因的拟南芥Protox-1编码序列用EcoR1和Xhol部分消化而切出并克隆到植物表达质粒p CGN1761ENX上，这个包含两份35S-原卟啉原氧化酶基因融合区域的表达框用Xbal酶切出后克隆到双向载体p CIB200中。这个双向原卟啉原氧化酶质粒用电穿孔转化到土壤杆菌，再用真空过滤法(Bechtold等人，1993)转化入拟南芥。转化物在卡那霉素上选择，T2种子从一些独立株系上产生。这些种子接种到含有各种浓度原卟啉原氧化酶抑制型除草剂的GM培养基上并测定发芽和存活。过表达野生型或抗性突变原卟啉原氧化酶多转基因系在对空载体对照是致死的除草剂浓度下产生大量绿色幼苗。
本文描述的本发明的多种修改对本领域的技术人员而言是显而易见的。这些修改应在所附权利要求的范围内。
序列描述(1)一般信息(i)申请人(A)姓名CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)国家瑞士(F)邮政编码(ZIP)4002(G)电话+41 61 69 11 11(H)传真+41 61 696 79 76(I)电报962，991(ii)发明的题目真核生物中原卟啉原氧化酶活力的操作。(iii)序列的数目20(iv)计算计可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1719碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置31..1644
(D)其他信息/注＝“拟南芥的原卟啉原氧化酶-1 cDNA；序列来自pWDC-2”(xi)序列描述SEQ ID NO1TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG54Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro1 5ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA102Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu10 15 20AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA150Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro25 30 35 40ACC GTC GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG198Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr45 50 55ACG GAT TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT246Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala60 65 70CAG GCG CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG294Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val75 80 85ACC GAG GCT AAG GAT CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG342Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu90 95 100AAT GGT TTT CTC 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Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser1 5 10 15Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu20 25 30Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu35 40 45Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly50 55 60Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro65 70 75 80Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly85 90 95Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly100 105 110Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp115 120 125Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg130 135 140Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr145 150 155 160Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala165 170 175Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu180 185 190Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu195 200 205Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly 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Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr435 440 445TCT ATT CTG AAA CAA CTT GTG ACC TCT GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC 1452Ser Ile Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly450 455 460GTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA TAC TGG GGA AAT GCT 1500Val Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala465 470 475TTT CCT TTG TAT GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA 1548Phe Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu480 485 490 495AAG ATG GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG 1596Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys500 505 510GAT GGG CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT 1644Asp Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala515 520 525GAC CTT GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser530 535 540CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745His545CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA1805ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA1865AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC1925TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA1985ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA2045AAAAAAAAAA AAAAAA(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度544个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr1 5 10 15Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Leu20 25 30Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val35 40 45Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu50 55 60Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala65 70 75 80Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu85 90 95Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile100 105 110Asp Asp Leu Gly Leu Gln Asp Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His115 120 125Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Ala Leu Ile Pro Ser Asp130 135 140Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile145 150 155 160Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn165 170 175Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe180 185 190Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp Pro195 200 205Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg210 215 220His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val225 230 235 240Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln Thr325 330 335Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met340 345 350Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys355 360 365Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp370 375 380Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr Lys385 390 395 400Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser405 410 415Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr Thr420 425 430Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ser435 440 445Ile Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val450 455 460Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala Phe465 470 475 480Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu Lys485 490 495Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys Asp500 505 510Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp515 520 525Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser His530 535 540Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro Val245 250 255Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser260 265 270Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser Leu Ile Asn Ala Leu His Asn275 280 285Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu290 295 300Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser305 310 315 320(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度1697个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设无(iv)反义无(ix)特点(A)名称/键CDS(B)位置29..1501(D)其他信息/注＝“酵母原卟啉原氧化酶-3 cDNA；序列来自pWDC-5”(xi)序列描述SEQ ID NO9TTGGCATTTG CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA 52Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly1 5GGT ATA GCT GGT CTT AGT ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA100Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro10 15 20AAA TGT ACT ATT GAT TTG TAC GAA AAA GGT CCT CGT TTA GGT GGA TGG148Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp25 30 35 40CTT CAG TCG GTC AAA ATC CCG TGT GCA GAT TCT CCA ACA GGA ACG GTT196Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val45 50 55TTG TTT GAG CAA GGT CCT AGA ACT CTT CGT CCT GCT GGG GTT GCT GGC244Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly60 65 70TTA GCA AAC TTA GAT TTA ATT AGC AAG TTG GGC ATC GAA GAC AAG TTG292Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu75 80 85TTA AGG ATT TCG AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT340Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr90 95 100TAC CCA GAT CGC TTA AAT GAA ATT CCT TCA AGC ATT TTA GGG AGT ATA388Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile105 110 115 120AAG TCG ATT ATG CAG CCT GCT TTG CGT CCG ATG CCT TTG GCT ATG ATG436Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met125 130 135CTT GAG CCC TTT CGT AAA AGT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG 484Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val140 145 150GGT TCA TTT ATG AGA AGA AGA TTT GGT AAAA AC GTT ACG GAT AGA GTT 532Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val155 160 165ATG AGT GCA ATG ATA AAT GGT ATT TAT GCT GGT GAT TTG AAT GAT TTG 580Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu170 175 180TCT ATG CAT TCT AGC ATG TTT GGA TTT TTA GCG AAG ATT GAA AAA AAG 628Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys185 190 195 200TAT GGA AAC ATT ACT TTG GGA TTA ATT AGA GCT CTT CTT GCA CGT GAA 676Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu Ile Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu205 210 215ATA TTA TCT CCT GCT GAG AAA GCT TTG GAA AGC AGC ACT ACT CGC AGA 724Ile Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala Leu Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg220 225 230GCC AAA AAC AGC AGA GCT GTC AAA CAG TAT GAA ATC GAC AAG TAT GTT 772Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val235 240 245GCT TTC AAG GAA GGG ATT GAG ACT ATT ACA TTG TCA ATA GCA GAT GAA 820Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr Ile Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu250 255 260TTA AAA AAA ATG CCG AAT GTC AAG ATA CAT CTA AAC AAA CCG GCC CAA 868Leu Lys Lys Met Pro Asn Val Lys Ile His Leu Asn Lys Pro Ala Gln265 270 275 280ACT TTG GTT CCA CAT AAA ACT CAG TCT CTT GTA GAC GTC AAT GGT CAA 916Thr Leu Val Pro His Lys Thr Gln Ser Leu Val Asp Val Asn Gly Gln285 290 295GCT TAC GAG TAT GTT GTG TTT GCA AAC TCT TCT CGC AAT TTA GAG AAT 964Ala Tyr Glu Tyr Val Val Phe Ala Asn Ser Ser Arg Asn Leu Glu Asn300 305 310CTA ATA TCT TGT CCT AAA ATG GAA ACT CCG ACG TCG AGT GTT TAT GTC 1012Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val315 320 325GTC AAC GTT TAT TAT AAG GAC CCT AAT GTT CTT CCA ATC CGT GGT TTT 1060Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe
330 335 340GGG CTT TTG ATT CCA TCA TGC ACT CCA AAT AAT CCG AAT CAT GTT CTT 1108Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu345 350 355 360GGT ATC GTT TTT GAT AGT GAG CAA AAC AAC CCT GAA AAT GGA AGC AAG 1156Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys365 370 375GTC ACT GTC ATG ATG GGA GGG TCT GCT TAT ACA AAA AAT ACT TCT TTG 1204Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu380 385 390ATT CCA ACC AAC CCC GAA GAA GCC GTT AAC AAT GCT CTC AAA GCT TTG 1252Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu395 400 405CAG CAT ACT TTA AAA ATA TCC AGT AAG CCA ACA CTC ACG AAT GCA ACA 1300Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr410 415 420TTA CAA CCA AAT TGC ATC CCT CAA TAT CGT GTT GGG CAT CAA GAT AAT 1348Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn425 430 435 440CTT AAT TCT TTG AAA TCT TGG ATT GAG AAA AAT ATG GGA GGG CGA ATT 1396Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile445 450 455CTT CTA ACT GGA AGT TGG TAT AAT GGT GTT AGT ATT GGG GAT TGT ATT 1444Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile460 465 470ATG AAT GGA CAT TCA ACA GCT CGA AAA CTA GCA TCA TTG ATG AAT TCT 1492Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser475 480 485TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA1548Ser Ser490TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC 1608GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA 1668GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT 1697(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度490氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala1 5 10 15Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu20 25 30Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys35 40 45Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr50 55 60Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser65 70 75 80Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro85 90 95Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile100 105 110Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu115 120 125Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys130 135 140Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe145 150 155 160Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile165 170 175Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly180 185 190Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu195 200 205Ile Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu Ile Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala210 215 220Leu Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys225 230 235 240Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr245 250 255Ile Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Pro Asn Val Lys260 265 270Ile His Leu Asn Lys Pro Ala Gln Thr Leu Val Pro His Lys Thr Gln275 280 285Ser Leu Val Asp Val Asn Gly Gln Ala Tyr Glu Tyr Val Val Phe Ala290 295 300Asn Ser Ser Arg Asn Leu Glu Asn Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu305 310 315 320Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro325 330 335Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr340 345 350Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln355 360 365Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser370 375 380Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala385 390 395 400Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser405 410 415Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln420 425 430Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile435 440 445Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn450 455 460Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg465 470 475 480Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser Ser Ser485 490(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO11AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T 41(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO12AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明用于构建pSOG10的引物SON003(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO13CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG31(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG10的引物SON0004(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO14ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG19的引物SON0031(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO15CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG19的引物SON0010(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO16AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG19的引物SON0016(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO17GCTACCATGGCCACATAGAACACC 24(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG19的引物SON0017(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO18CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG23(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG30的引物SON0039(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO19CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA 28(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其他核酸(A)说明用于构建pSOG30的引物SON0041(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO20ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC 2权利要求
1.一种控制不需要的植被生长的方法，该方法包括给包括其子代的植物种群施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂，所说的植物包含一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(a)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(b)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代；其中所说的DNA分子在所说的植物中被表达并使所说的植物能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂。
2.权利要求1的方法，其中所说的220位丙氨酸被选自缬氨酸，苏氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的氨基酸替代。
3.权利要求1的方法，其中所说的221位甘氨酸被丝氨酸替代。
4.权利要求1的方法，其中所说的426位酪氨酸被选自胱氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和苏氨酸的氨基酸取代。
5.权利要求1的方法，其中所说的166位丙氨酸被选自缬氨酸，苏氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代。
6.权利要求1的方法，其中所说的167位甘氨酸被丝氨酸替代。
7.权利要求1的方法，其中所说的372位酪氨酸可被选自胱氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和苏氨酸的氨基酸取代。
8.权利要求1的方法，其中所说的DNA分子，它是植物基因组的一部分。
9.权利要求1的方法，其中所说的DNA分子与在植物中有活性的启动子可操作地连接。
10.权利要求9的方法，其中所说的DNA分子与信号序列可操作地连接，其中所说的信号序列能够将所说的DNA分子所编码的蛋白质导入叶绿体。
11.权利要求9的方法，其中所说的DNA分子与信号序列可操作地连接，其中所说的信号序列能够将所说的DNA分子所编码的蛋白质导入线粒体。
12.权利要求1的方法，其中所说的植物选自大豆，棉花，烟草，甜菜，油菜，玉米，小麦，高粱，黑麦，燕麦，苔草(turf grass)和水稻。
13.权利要求1的方法，其中所说的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂选自芳基尿嘧啶，二苯基醚，噁二唑(oxidiazole)，亚胺，苯基吡唑，吡啶衍生物，3-取代-2-芳基-4，5，6，7-四氢吲哚，吡落草(phenopylate)和邻-苯基吡咯烷-与哌啶子基氨基甲酸酯的吡落草类似物。
14.权利要求1的方法，其中所说的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂是具以下结构式的二酰亚胺类 (结构式V)其中Q等于 (结构式VI) (结构式VII)(结构式VIII) (结构式IX) (结构式IXa) (结构式IXb)其中R1代表H，Cl或F，R2代表Cl，R3为可被选择性取代的醚，硫醚，酯，氨基或烷基，并且其中R2和R3可一起形成5或6元杂环。
15.权利要求14的方法，其中所说的二酰亚胺类选自 (结构式X) (结构式XI) (结构式XII) (结构式XIII) (结构式XIV) (结构式XV) (结构式XVI)；和 (结构式XVII)其中R表示(C2-6-链烯氧基)羰基-C1-4-烷基。
16.权利要求1的方法，其中所说的原卟啉原氧化酶抑制型除草剂具有从以下选出的结构式 (结构式XVIII) (结构式XIX) (结构式XX)，和 (结构式XXI)
17.一种鉴定对存在于细胞群体中的原卟啉原氧化酶抑制剂有抗性的修饰的原卟啉原氧化酶的方法，所说的细胞包含一种编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子，所说的方法包括步骤(a)将所说的群体在能抑制该酶未修饰形式的量的所说的原卟啉原氧化酶抑制剂存在的条件下培养；(b)从步骤(a)中选出生长未受抑制的细胞；和(c)分离和鉴定存在于选自步骤(b)的细胞中的原卟啉原氧化酶，其中所说的真核生物是拟南芥种，所说的蛋白质包括选自SEQID Nos.2和4的氨基酸序列，或所说的真核生物是玉米，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.6和8的氨基酸序列，包括与所说的DNA分子同源并选择性杂交的DNA分子。
18.权利要求17的方法，其中所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.2和4的氨基酸序列，包括与其同源的氨基酸序列。
19.权利要求18的方法，其中所说的DNA分子包括选自SEQ IDNos.1和3的核苷酸序列。
20.权利要求17的DNA分子，其中所说的蛋白质包括选自SEQID Nos.6和8的氨基酸序列，包括与其同源的氨基酸序列。
21.权利要求20的DNA分子，其中所说的DNA分子包括选自SEQ ID Nos.5和7的核苷酸序列。
22.一种从非转化的植物中选择用感兴趣的转移基因转化的植物，植物组织或植物细胞的方法，该方法包括步骤(a)用能被植物表达的感兴趣的转移基因和一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子转化植物，植物组织或植物细胞，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代；(b)将如此转化的植物或植物细胞转移到含有原卟啉原氧化酶抑制剂的培养基中；和(c)选择在此培养基中存活的植物或植物细胞。
23.一种产生包含编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子的宿主细胞的方法，包括用下述DNA分子转化所述宿主的细胞(a)一种编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子，其中所说的真核生物是拟南芥种，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.2和4的氨基酸序列，或所说的真核生物是玉米，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.6和8的氨基酸序列，包括与所说的DNA分子同源并选择性杂交的DNA分子；或(b)一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代。
24.一种产生包含编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子的植物细胞的方法，包括用下述DNA分子转化所述的植物细胞(a)一种编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子，其中所说的真核生物是拟南芥种，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.2和4的氨基酸序列，或所说的真核生物是玉米，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.6和8的氨基酸序列，包括与所说的DNA分子同源并选择性杂交的DNA分子；或(b)一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代。
25.一种产生包含编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子的转基因亲本植物的转基因后代的方法，包括用下述DNA分子转化所说的亲本植物(a)一种编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子，其中所说的真核生物是拟南芥种，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.2和4的氨基酸序列，或所说的真核生物是玉米，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.6和8的氨基酸序列，包括与所说的DNA分子同源并选择性杂交的DNA分子；或(b)一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子，其中所说的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(i)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(ii)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代；和用已知植物育种技术将除草剂耐受性特征转移到所说转基因亲本植物的后代中去。
26.一种产生编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子的方法，包括(a)建立合适真核生物来源的基因组或cDNA文库；(b)用一种能与编码来自真核生物的具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的DNA分子或其mRNA特异性杂交的探针分子探测所说的文库，其中所说的真核生物是拟南芥种，所说的蛋白质包括选自SEQID Nos.2和4的氨基酸序列，或所说的真核生物是玉米，所说的蛋白质包括选自SEQ ID Nos.6和8的氨基酸序列，其中所说的探针包括与所说的DNA分子邻接的部分，并至少有10个核苷酸的长度。
27.一种编码修饰的原卟啉原氧化酶，包括具有至少一个氨基酸修饰的真核原卟啉原氧化酶的DNA分子在将对抑制自然产生的原卟啉原氧化酶活性的量的除草剂的耐受性从亲本植物传递给其子代上的应用，包括首先通过将所述的DNA分子稳定掺入所说亲本植物基因组中而用所述DNA分子稳定地转化亲本植物，随后采用已知植物育种技术将除草剂耐受性特征转移到所述转基因亲本植物的子代中去，其中所述的修饰的原卟啉原氧化酶能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂，其中所说的真核原卟啉原氧化酶包括(a)SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.2的220位丙氨酸，221位甘氨酸和426位酪氨酸的氨基酸取代；或(b)SEQ ID No.6中所示的氨基酸序列并且其中所说的至少一个氨基酸修饰是选自SEQ ID No.6的166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸取代；其中所说的DNA分子在所说的植物中被表达并使所说的植物能耐受抑制所说的真核原卟啉原氧化酶量的除草剂。
全文摘要
本发明提供编码自然原卟啉原氧化酶(protox)及其除草剂耐受性的修饰形式的新的真核DNA序列。也提供了具有改变的原卟啉原氧化酶活力,并对除草剂有耐受性的植物。这些植物可以是培养或基因工程处理后而对原卟啉原氧化酶抑制剂有抗性,这通过将自然原卟啉原氧化酶基因突变成抗性形式或通过提高自然原卟啉原氧化酶基因表达水平,或用修饰的真核或原核原卟啉原氧化酶编码序列或除草剂耐受性野生型原核原卟啉原氧化酶序列转化实现。还描述了新的真核原卟啉原氧化酶序列在诊断及其他方面的用途。还公开了编码野生型和改变了的原卟啉原氧化酶的植物基因,纯化的植物原卟啉原氧化酶,从植物中分离原卟啉原氧化酶的方法,使用原卟啉原氧化酶编编基因的方法。
文档编号A01N43/54GK1382377SQ0111183
公开日2002年12月4日 申请日期2001年3月21日 优先权日1994年6月16日
发明者E·R·瓦德, S·沃勒拉茨 申请人:诺瓦提斯公司