通过表达过氧化物酶在转基因植物中增加病原体抗性的方法

专利名称：通过表达过氧化物酶在转基因植物中增加病原体抗性的方法
技术领域：
本发明涉及产生具有增加的病原体抗性的转基因植物和/或植物细胞的方法，其特征在于将编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的DNA序列插入到植物中并且在植物中表达。本发明还涉及编码过氧化物酶的核酸用于产生具有增加的病原体抗性的转基因植物和/或植物细胞的用途。另外，本发明涉及编码大麦过氧化物酶的核酸序列。
由多种病原体如病毒、细菌和真菌引起的植物疾病可以一方面导致经济损失，即在栽培植物生长中大量的农作物减产，另一方面还对人类食物安全性造成威胁。自上世纪起使用了化学杀真菌剂以控制真菌疾病。尽管使用这些制剂减少了植物疾病的程度，但是到目前为止还不能排除这些化合物对人类、动物和环境的有害影响。为了将常规杀虫剂的使用减少到最小，因此重要的是检查多种植物对不同病原体的天然病原体防御，并且系统地使用遗传工程，如通过引入外源的抗性基因或通过操作植物中内源的基因表达，来产生病原体抗性植物。
抗性指的是植物预防或至少减少有害病原体的侵袭和建群的能力。
在天然存在的抗性中可以识别出不同的机制，植物用这些机制抵抗植物致病生物的建群。病原体和宿主之间的这些特异性的相互作用决定了感染过程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，SpringerVerlag，Berlin-Heidelberg，德国)。
对于品种特异性的抗性(也称作宿主抗性)，在相容相互作用(compatible interaction)和不相容相互作用(incompatible interaction)间存在着区别。在相容相互作用中，致病性强的病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体存活并且可以建立繁殖结构，同时宿主死亡。另一方面当病原体感染植物但是在较轻的症状发展之前或之后其生长被抑制时，发生不相容相互作用。在后一种情况中，植物对各自病原体有抗性(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，Springer Verlag，Heidelberg，德国)。在相容相互作用和不相容相互作用中都发生了宿主对病原体的防御反应。
基因对基因假设(Flor(1971)Annu.Rev.Phytopathology 9275 296)已经分别描述了相容或不相容宿主/病原体相互作用的遗传基础。品种特异性病原体识别的前提是植物的显性或半显性抗性基因(R基因)的产物和来自植物病原体的互补和显性的无毒基因(Avr基因)的产物之间直接或间接的相互作用(Keen(1992)Annu.Rev.Genet.24447-463；Staskawicz等人(1995)Science 268661-667)。但是，如果病原体缺乏互补的无毒基因，那么结果是疾病发作。对于很多锈菌、黑粉菌、白粉菌以及霜霉菌侵染已经证明了基因对基因模型的正确性，但是没有将其转移到所有的宿主/寄生虫相互作用。
但是在自然中，由于病原体快速的进化发展，此品种特异性的抗性通常被克服(Neu等人(2003)American Cytopathol.Society，MPMI 16 No.7626-633)。相对于此，非宿主抗性提供了强烈的、广泛的并且持久的保护以免受植物病原体侵害。非宿主抗性指的是病原体可以在某些植物物种中引起疾病，但是不在基因相似的植物物种中引起疾病的现象(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24259-264)。
除了此有趣的特征，非宿主抗性的遗传和分子生物学基础到目前为止仅很少了解。有迹象表明非宿主抗性由非特异性的介质引起，并且基因对基因相互作用类型的个体病原体蛋白质也引起了非宿主抗性反应(Heath(1981)Phytopathology 711121-1123；Heath(2001)Physiol.Mol.PlantPathol.5853-54；Kamoun等人(1998)Plant Cell 101413-1425；Lauge等人(2000)Plant J.23735-745；Whalen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856743-6747)。
植物病原体的植物建群仅仅很少发生的另一个原因是这样的事实，即由于缺乏感染进程所需的介质和结构，病原体不能发展感染结构。另外，由非特异性引起或执行的抗性屏障在病原体感染前就已经存在，阻止了感染结构的形成。这种抗性被称为基础抗性，或品种非特异性的抗性，通过被动的和主动的防御机制来维持。
通过以感染多种不同类型谷类的霉菌(禾布氏白粉菌(Blumeriagraminis))作为例子，说明了造成植物物种或其栽培种对某些植物病原体的抗性或易感性的不同抗性机制。霉菌是子囊菌属(Ascomycetes)的一部分，并且除了小麦和大麦外还会感染黑麦、燕麦以及多种草类。在某些情况下，造成的大麦和小麦农作物的损失在一些情况下总计可达25％。但是通常损失在5％和15％之间。另外，霉菌还为其他病原体(感染)提供机会(灰雪霉病(gray snow mold)、麦类颖斑病(Glume blotch)、镰孢菌枯萎症(Fusariumhead blight))。霉感染最普遍的症状是主要在叶子顶端和在叶鞘上出现白色“霉疱状突起(mildew pustule)”。白粉菌——禾布氏白粉菌是苛求活体营养的，即它只能以活物质为食并且不能在培养基上培养。真菌以刺激其自身生长的方式影响宿主的新陈代谢(Ferrari等人(2003)The Plant Journal35193-205)。霉菌仅侵袭大麦叶的表皮细胞层。真菌用入侵丝机械地和酶促地通过细胞壁侵入植物细胞，所述入侵丝是分生孢子，即无性产生的孢子。当真菌的补给器官吸器形成时，就实现了对大麦叶的成功感染。吸器从植物细胞中取出养分，这使得未被感染的相邻细胞要补偿细胞养分的这种损失从而保持其存活。通过养分向损伤细胞中的流动，真菌获得了其自身存活一段时间的基础。
霉菌作为物种包含几种专化型(formae speciales)，专化型取决于霉菌攻击例如小麦还是大麦。在感染大麦的情况下称其为大麦禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)，而在感染小麦的情况下称其为小麦禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)。另外，可以在多种专化型中鉴定不同的品种或致病型，宿主物种的不同的栽培种对于所述的专化型表现出不同的抗性。每种专化型仅攻击几种植物物种并且不攻击其他紧密相关的植物。因此称这种为不被某些专化型攻击的那些植物的非宿主抗性。
可以鉴别提供给大麦霉抗性的一些不同的遗传机制。品种特异抗性基于对大麦白粉菌的抗性基因(R基因)，所述基因仅对真菌大麦禾布氏白粉菌的单独分离菌有效，这是因为如上所述每种单个的R基因仅识别携带着互补无毒基因的分离菌(Collins等人(2002)The Powdery MildewAccomprehensive Treatise，American Phytopathological Society，Minnesota；Peterhnsel等人(1997)Plant Cell 91397-1409)。相反的，针对几种霉分离菌的广泛的、品种非特异性的抗性受到单个隐性基因的调控，称此基因为mlo基因(Schulze-Lefert和Vogel(2000)Trends in PlantScience 5343-348)。对mlo基因效果的现有假设是mlo野生型蛋白质是防御反应的负调节子，并且此蛋白质的缺失会因此导致更迅速、更强烈的防御反应以引起有效的病原体防御(Collins等人(2002)，同上)。Mlo介导的抗性导致亚细胞壁添附的形成，所述亚细胞壁添附称为乳突，直接在被称为附着器的真菌的入侵丝下面形成。由此抑制了真菌在乳突形成阶段的侵入尝试，即没有形成真菌养分补给及由此建立有效感染所必需的吸器。
和品种非特异性的抗性对比，在大麦对白粉菌小麦禾布氏白粉菌(Bgt)的非宿主抗性中引起了类似于用无毒型的大麦禾布氏白粉菌(Bgh)接种大麦的防御机制，所述的小麦禾布氏白粉菌攻击小麦却不攻击大麦。由于非宿主抗性是强烈、广泛并且长期持续的，所以尤其有兴趣的是鉴定负责非宿主抗性的基因。所以大麦的非宿主抗性还可以在农学上应用于其它宿主/病原体系统。因此，存在对这种植物或植物细胞的需要，即所述植物或植物细胞表达介导非宿主抗性的基因并因此表现出对真菌病原体如霉增加的抗性。
本发明的目标是提供对病原体具有增加的抗性的植物或植物细胞。本发明另外的目标是提供对不同病原体如霉具有非宿主抗性的植物或植物细胞。另外，本发明的一个目标是提供促进上述转基因植物或植物细胞产生的方法，所述植物或植物细胞对植物病原体如霉具有增加的(非宿主)抗性。
另外，本发明的一个目标是提供DNA序列，可以用所述DNA序列鉴定对病原体具有非宿主抗性的植物。
独立权利要求的特征用来解决在说明书中描述的这种及另外的目标。
本发明优选的实施方案通过从属权利要求的特征来定义。
在本发明的范围内发现大麦和小麦禾布氏白粉菌的相互作用引起了过氧化物酶的特异性诱导，所述过氧化物酶参与对霉的这一专化型的非宿主抗性的介导。
因此本发明所述的目标基本上是通过提供产生具有增加的病原体抗性的转基因植物的方法来解决，所述方法的特征在于将编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的DNA序列插入到植物中并在植物中表达。
在本发明中，通过寡核苷酸指纹法研究来鉴定基因，与作为对照目的的大麦和bgh的相互作用相比，所述基因通过大麦和bgt的相互作用转录激活。此基因的表达图式随后通过多种分子生物学方法确定，并且确定了最强诱导的基因的全长序列。随后鉴定出此基因为过氧化物酶并且称其为HvBgt1。在大麦和bgt的非宿主反应期间仅仅24小时后HvBgt1的表达强烈增加，而在宿主反应(大麦和bgh)的全部过程期间，仅观察到了表达的少量增加(对比表5和


图1)。
过氧化物酶是通过它将作为有机化合物分子接纳体的过氧化氢还原成水的酶。过氧化物酶在细胞壁合成和生物异源物质的解毒作用中有重要作用。在病原体感染期间产生了可以对植物具有副作用的活性氧类别。设想过氧化物酶酶促转化这些活性氧类别，从而使它们无害。
因此本发明的目标包括分离的核酸分子，其包含选自下列的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列片段编码的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含编码具有在SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列的蛋白质或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)与在SEQ ID No.1中所给出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在严格条件下与i)到iii)的核苷酸序列的互补链杂交，
并且所述核酸分子编码具有过氧化物酶活性的蛋白质。
核酸序列优选来自大麦(hordeum vulgare)。
本发明的另一个目标涉及由上述核酸分子编码的蛋白质或蛋白质片段。
本发明的目标还涉及产生具有增加的病原体抗性的植物或植物细胞的方法，其特征在于DNA序列选自下列i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或这些序列的片段编码的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含编码具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中描述的氨基酸序列或其片段的蛋白质的核苷酸序列，iii)与在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所描述的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在严格条件下与i)到iii)的核苷酸序列的互补链杂交，所述DNA序列编码具有过氧化物酶活性的蛋白质，被插入到植物或植物细胞中，并在那里表达。
本发明另外的目标涉及重组核酸分子，其在5’-3’方向包含-在植物细胞中有活性的启动子的调节序列，-有效连接到其上的上面给出的核酸序列，-任选地，有效连接到其上的在植物细胞中作用为转录、终止、和/或加A信号的调节序列。
本发明的主题还涉及依照根据本发明的方法之一产生的转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞比野生型具有增加的病原体抗性和更高的过氧化物酶含量。
同样，本发明的主题是在本发明中描述的核酸序列用于产生具有增加的病原体抗性的转基因植物和植物细胞的用途。
另外本发明的主题涉及在本发明中描述的一种核酸序列用于鉴定对病原体显示出非宿主抗性的植物的用途。
“病原体抗性”指的是减轻或削弱由病原体攻击引起的植物的致病症状。症状可以是多种，但优选地包括这些，即直接或间接导致损害了植物质量、收成大小、用作动物饲料或用于人类消费的食物的适宜性，或妨碍作物的播种、栽培、收获或加工。
根据本发明，术语“增加的病原体抗性”理解为指的是根据本发明的转基因植物或植物细胞受到病原体的攻击比在其他方面同样处理(如气候条件和栽培条件，病原体类型等)的未转化的野生型植物或植物细胞较不强烈和/或较不频繁。病原体的侵袭优选的至少减少到1/2，特别优选至少减少到1/3，尤其优选至少减少到1/5，以及最优选至少减少到1/10，表现为病原体症状发展的减少。侵入效率为定量病原体侵袭提供了一种可能性(见实施例9)。术语“增加的病原体抗性”也包括已知为瞬时病原体抗性的抗性，即，根据本发明的转基因植物或植物细胞只在有限的时期内比各自的野生型具有增加的病原体抗性。
“病原体”可以是通常攻击野生型植物的任何病原体，换句话说，是真菌病原体、细菌病原体、病毒病原体和动物病原体。优选地，它们是真菌病原体，例如霉。但是也可以假设依照本发明所使用的序列的过表达还可以对其他病原体引起抗性。
真菌病原体或类真菌病原体(如藻界(chromista))优选地来自根肿菌门(Plasmodiophoromycota)，卵菌门(oomycota)，子囊菌门(ascomycota)，壶菌纲(chytridiomycetes)，接合菌纲(zygomycetes)，担子菌门(basidiomycota)，和半知菌纲(deuteromycetes)(半知菌(fungi imperfecti))。在表1中所述的真菌病原体及与它们相关的疾病以实例的方式论及，但是并不局限于此。
表1植物真菌疾病
特别优选地，过氧化物酶赋予下列物种以抗性-根肿菌门，例如根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)(十字花科植物根肿病)、马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)(马铃薯块茎粉痂病)、多粘霉(Polymyxa graminis)(谷类和草类的根病)；-卵菌门，例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣霜霉病)、霜霉属(Peronospora)(霜霉病)，其在金鱼草中(金鱼草霜霉(P.antirrhini))、在洋葱中(毁坏霜霉(P.destructor))、在菠菜中(散展霜霉(P.effusa))、在大豆中(东北霜霉(P.manchurica))、在烟草中(“青霉”；烟草霜霉菌(P.tabacina))、在苜蓿和三叶草中(车轴草霜霉(P.trifolium))、草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)(草霜霉病)、单轴霉属(Plasmopara)(葡萄霜霉病)(葡萄生单轴霉(P.viticola))、和向日葵中(霍尔斯单轴霉(P.halstedii))、指疫霉菌(谷类和草类的霜霉病)、腐霉属(种子腐烂病、苗期猝倒病以及根腐病和所有类型的植物黑根病例如由德巴利腐霉(P.debaryanum)引起的甜菜黑根病)、致病疫霉(Phytophthora infestans)(马铃薯和番茄晚疫病等)、白锈属(Albugo spec.)(十字花科植物白锈病)；-子囊菌门，例如Microdochium nivale(黑麦和小麦雪霉病)、禾本科镰孢、大刀镰孢(穗腐病，特别是小麦穗腐病)、尖镰孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麦白粉病(f.sp.hordei)和小麦白粉病(f.sp.tritici))、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆白粉病)、仁果癌丛赤壳菌(Nectria galligena)(果树溃疡)、葡萄钩丝壳(Uncinula necator)(葡萄树白粉病)、维管束假盘菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄树的“Rotbrenner”)、麦角菌(Clavicepspurpurea)(麦角病，例如黑麦和草类麦角病)、小麦全蚀病菌(小麦、黑麦和其它草类的全蚀病)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(稻瘟病)、麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麦叶条纹病)、圆核腔菌(Pyrenophorateres)(大麦网斑病(net blotch of barley))、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)(小麦褐斑病(黄斑病))、苹果黑星菌(Venturiainaequalis)(苹果黑星病)、油菜菌核病菌(白霉)、苜蓿假盘菌(Pseudopezizamedicaginis)(苜蓿、白色核红色三叶草褐斑病)；-担子菌纲，如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麦、黑麦、小麦雪腐病(灰雪霉病))、玉蜀黍黑粉菌(玉米黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilagonuda)(大麦散黑粉病)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦、斯卑尔脱小麦散黑粉病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦散黑粉病)、立枯丝核菌(马铃薯黑痣病)、轴黑粉菌(Sphacelotheca spp.)(高粱丝黑穗病)、亚麻栅锈菌(Melampsora lini)(亚麻锈病)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)(小麦、大麦、黑麦、燕麦杆锈病)、隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)(叶锈病)、散生柄锈菌(Puccinia dispersa)(黑麦叶锈病)、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)(大麦叶锈病)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronata)(燕麦冠锈病)、条形柄锈菌(小麦、大麦、黑麦以及多种草类的条锈病)、疣顶单孢锈菌(Uromycesappendiculatus)(菜豆锈病)、齐整小核菌(多种植物的根腐和茎腐病)；-半知菌纲(半知菌(fungi imperfecti))，如小麦颖枯壳针孢(小麦颖枯病)(小麦壳针孢)、小麦基腐病菌(小麦、大麦、黑麦眼斑病)、黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)(黑麦和大麦叶斑枯病)、早疫链格孢(Alternariasolani)(马铃薯、番茄早疫病)、菜茎点霉(Phoma betae)(甜菜黑根病)、菾菜生尾孢(Cercospora beticola)(甜菜叶斑病)、芸苔链格孢(Alternariabrassicae)(芸苔、甘蓝和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)(芸苔萎蔫和茎腐病)、豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病)、黑胫茎点霉(Phomalingam-black leg)(甘蓝黑腿病；芸苔茎溃疡)、灰葡萄孢(葡萄树、草莓、马铃薯、啤酒花等的灰霉病)。
最优选地，根据本发明的方法产生的植物对下列病原体有抗性致病疫霉(黑斑病、马铃薯晚疫病等)、Microdochium nivale(以前已知为雪腐镰孢(Fusarium nivale)；黑麦和小麦雪腐病)、禾本科镰孢、大刀镰孢(小麦颈腐病)、尖镰孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麦白粉病(f.sp.hordei)和小麦白粉病(f.sp.tritici))、稻瘟病菌(稻瘟病)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotium)(白霉、油菜籽溃疡)、颖枯壳针孢和小麦壳针孢(小麦颖枯病)、芸苔链格孢(芸苔、甘蓝和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、黑胫茎点霉(甘蓝黑腿病、株腐病、芸苔茎溃疡)。
在表2中所列的病原体及与它们相关的疾病以细菌病原体实例的方式论及，但是并不局限于此。
表2细菌疾病
特别优选地，根据本发明产生的转基因植物对下列病原细菌有抗性坏腐棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)(马铃薯细菌性环腐病)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(马铃薯黑腿病)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)(梨、苹果和榅桲的火疫病)、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)(马铃薯疮痂病)、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tabaci)(烟草野火病)、丁香假单胞杆菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola)(矮菜豆晕疫病)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tomato)(番茄细菌叶斑病)、油菜黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas campestris pv.Malvacearum)(棉花细菌性黑枯病)、和野油菜黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas campestris pv.Oryzae)(水稻和其他草类的细菌叶枯病)。
术语“病毒病原体”包括所有植物病毒，例如烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、环斑病毒(ringspotvirus)、坏死病毒(necrosis virus)、玉米矮花叶病毒(maize dwarf mosaicvirus)等等。
在表3中列出的病原体和与它们相关的疾病以病毒病原体的实例的方式论及，但是并不局限于这些。
表3病毒疾病
根据本发明的过氧化物酶还可以赋予对动物害虫(例如昆虫和线虫)的抗性。昆虫如甲虫、毛虫、虱或螨可以以实例的方式论及，但是不局限于此。
根据本发明的过氧化物酶优选地赋予对下列属的昆虫的抗性鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等等。特别优选的昆虫属为鞘翅目和鳞翅目、如欧洲玉米螟(European corn borer(ECB))、巴氏根叶甲(Diabrotica barberi)(长角叶甲(Northern corn rootworm))、南方玉米根叶甲(Diabroticaundecimpunctata)、玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、Feltia ducens(番茄褐夜蛾，dingy cutworm)、泥背地老虎(Agrotis gladiaria)、梳爪叩头虫(Melanotusspp.)、Aeolus mellillus(捻转血矛线虫(wireworm))、Aeolus mancus(麦金针虫(wheat wireworm))、砂地金针虫(Horistonotus uhlerii)、玉米长喙象(Sphenophorus maidis)、Sphenophorus zeae(牛草长象喙(timothy billbug))、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南方玉米长喙象(Sphenophoruscallosus)、食叶鳃金龟(Phyllogphaga spp.)、(蛴螬(white grubs))、Anuraphismaidiradicis(玉米根蚜(corn root aphid))、灰地种蝇(Delia platura)(玉米种蝇，seedcorn maggot)、葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)、Stenolophuslecontei(玉米籽栗褐步甲(seedcorn beetle))和玉米籽细步甲(Cliviniaimpressifrons)。
其它是黑角负泥虫(Oulema melanopus)、欧洲麦秆蝇(Oscinella frit)、捻转血矛线虫(Agrotis lineatus)和蚜虫(如燕麦蚜虫禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、谷物蚜虫禾谷网蚜(Sitobion avenae))。
在表4中列出的病原体和与它们相关的疾病以线虫害虫实例的方式指出，但是并不局限于这些。
表4.寄生虫线虫
根据本发明的转基因植物特别优选地对下列有抗性马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.Pallida)(马铃薯、番茄和其它茄科草本的孢囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜和饲用甜菜、芸苔、甘蓝等的甜菜胞囊线虫)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)(燕麦和其它禾谷类胞囊线虫)、鳞球茎茎线虫(茎和鳞茎线虫，黑麦、燕麦、玉米、三叶草、烟草和甜菜的甜菜头线虫)、小麦粒线虫(Anguina tritici)(小麦粒线虫病，小麦(斯卑尔脱小麦、黑麦)的种瘿和叶瘿)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)(胡萝卜、黄瓜、莴苣、番茄、马铃薯、甜菜、苜蓿的北方根结线虫)。
对于在农业中特别重要的特定物种，根据本发明所用的过氧化物酶优选地对下列病原体有效
对于大麦，针对下面的真菌病原体、细菌病原体和病毒病原体有效大麦禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.hordei)(大麦杆锈病)、大麦禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.hordei)(大麦白粉病)、大麦黄矮病毒(BYDV)、以及致病昆虫/线虫玉米螟(Ostrinia nubilalis)(欧洲玉米螟)；小地老虎；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)；麦长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)；褐美洲蝽(Euschistus servus)；灰地种蝇(Deliaplatura)；麦瘿蚊(Mayetiola destructor)；麦岩螨(Petrobialatens)。
对于大豆，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效Phytophthora megasperma fsp.glycinea、菜豆壳球孢、立枯丝核菌、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖镰孢、菜豆间座壳大豆变种(Diaporthephaseolorum var.Sojae)(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.Caulivora)、齐整小核菌、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、东北霜霉、束状刺盘孢(Colletotrichum dematium)(平头刺盘孢(Colletotrichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆壳针孢(Septoriaglycines)、大豆生叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、Microsphaera diffussa、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus)、大豆小丛壳(Glomerella glycines)、烟草环斑病毒(tobacco ring spot virus)、烟草条点病毒(tobacco streak virus)、豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)、瓜果腐霉、终极腐霉(Pythiumultimum)、德巴利腐霉、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、腐皮镰孢、以及致病昆虫/线虫大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)；玉米螟(欧洲玉米螟)；小地老虎；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)；烟芽夜蛾(Heliothis virescens)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)；桃短尾蚜(Myzuspersicae)；蚕豆小绿叶蝉(Empoasca fabae)；拟绿蝽；红足黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)；特异黑蝗(Melanoplus differentialis)(特异黑蝗(differentialgrasshopper))；种蝇(Hylemya platura)；Sericothrips variabilis(大豆蓟马(soybean thrips))；棉蓟马(Thrips tabaci)；土耳其斯坦叶螨(Tetranychusturkestani)；二点叶螨(Tetranychus urticae)。
对于油菜，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效白锈菌(Albugo candida)、芸苔链格孢、十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯丝核菌、核盘菌、芸苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassiccola)、终级腐霉、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、粉红镰孢、链格孢。
对于苜蓿，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效Clavibater michiganese subsp.insidiosum、终级腐霉、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、华丽腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、车轴草霜霉(Peronosporatrifoliorum)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis var.Medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochilamedicaginis)、镰刀菌、野油菜黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonascampestris p.v.alfalfa)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、草本匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfa)。
对于小麦，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效丁香假单胞菌atrofaciens致病变种(Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)、冰草条黑粉菌(Urocystis agropyri)、油菜单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假单胞菌丁香致病变种、链格孢、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、禾本科镰孢、燕麦镰孢、大刀镰孢、小麦散黑粉菌、小麦壳二孢、麦类条斑病菌(Cephalosporiumgramineum)、禾生炭疽菌、小麦禾白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麦禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、小麦隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita f.sp.tritici)、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)、偃麦草核腔菌、颖枯壳针孢、小麦壳针孢、燕麦壳针孢(Septoria avenae)、小麦基腐病菌、立枯丝核菌、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.Tritici)、瓜果腐霉、禾根腐霉、终级腐霉、小麦根腐病菌、大麦黄矮病毒、雀麦草花叶病毒、小麦土传花叶病毒(soilborne wheat mosaic virus)、小麦条纹花叶病毒、小麦梭斑病毒(wheatspindle streak virus)、美洲小麦条点花叶病毒、麦角菌、小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)、小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麦散黑粉菌、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯丝核菌、Pythium arrhenomannes、禾生腐篱(Pythium gramicola)、瓜果腐霉、高原病毒(High Plains Virus)、欧洲小麦条点病毒(European wheat striate virus)、小麦禾柄锈菌(小麦秆锈病)、小麦禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.tritici)(小麦白粉病)、以及致病昆虫/线虫粘虫(Pseudaletia unipunctata)；秋夜蛾(Spodopterafrugiperda)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)；苍白西部地老虎(Agrotis orthogonia)(西部地老虎(Western cutworm))；ElasmopalpusZignosellus(lesser cornstalk borer)；黑角负泥虫；车轴草叶象(Hyperapunctata)；南方玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；俄罗斯麦长管蚜；麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)；红足黑蝗；特异黑蝗；迁飞黑蝗(Melanoplus sanguinipes)；麦瘿蚊；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana)；美洲麦秆蝇(Meromyza americana)；冬作种蝇(Hylemyacoarctata)；烟褐蓟马(Frankliniella fusca)；麦茎蜂(Cephus cinctus)；郁金香瘿螨(Aceria tulipae)。
对于向日葵，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效霍尔斯单轴霉(Plasmophora halstedii)、核盘菌、翠菊黄化(aster yellows)、向日葵壳针孢(Septoria helianthi)、向日葵拟茎点霉(Phomopsis helianthi)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、百日草链格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢、茎点霉黑茎病菌(Phoma macdonaldii)、菜豆壳球孢、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉、匍枝根霉、向日葵柄锈菌(Puccinia helianthi)、大丽花轮枝孢、胡萝卜欧文氏软腐杆菌胡萝卜致病变种(Erwinia carotovorum p.v.Carotovora)、顶头孢霉、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白锈(Albugo tragopogonis)，以及致病昆虫/线虫Suleima helianthana；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus)；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)。
对于玉米，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效亚粘团串珠镰孢、斯氏欧文氏菌、串珠镰孢、玉蜀黍赤霉(禾本科镰孢)、Stenocarpella maydi(玉米色二孢)、畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉、华丽腐霉、终级腐霉、瓜果腐霉、黄曲霉、玉米小斑病菌0、T(异旋孢腔菌)、炭色长蠕孢I、II&III(玉米圆斑病菌)、玉米大斑病菌I、II&III、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍节壶菌、玉米黄叶枯病菌、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢、玉蜀黍黑粉菌、高粱柄锈菌、多堆柄锈菌、菜豆壳球孢、草酸青霉、稻黑孢、多主枝孢、弯孢、不等弯孢、苍白弯孢、Clavibacter michiganese subsp.nebraskense、绿色木霉、玉米矮花叶病毒A&B、小麦条纹花叶病毒、玉米褪绿矮化病毒、高粱麦角(Claviceps sorghi)、Pseudonomas avenae、菊欧文氏菌玉米致病变种、胡萝卜软腐欧文氏菌、Cornstunt spiroplasma、Diplodia macrospora、指疫霉菌、高粱指霜霉、菲律宾指霜霉、玉蜀黍指霜霉、甘蔗指霜霉、Spacelothecareiliana、玉米壳锈菌、玉米晚枯病菌、顶头孢霉、玉米褪绿斑驳病毒、高原病毒(High Plains virus)、玉米花叶病毒、玉米雷亚多非纳病毒、玉米条纹病毒(MSV)、玉米线条病毒、玉米粗矮病毒，以及致病昆虫/线虫玉米螟(欧洲玉米螟)；小地老虎；美洲棉铃虫；秋夜蛾；西南玉米秆草螟(Diatraeagrandiosella)；南美玉米苗斑螟；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；Diabroticavirgifera(Western corn rootworm)；长角叶甲(Diabrotica longicornisbarberi)；南方玉米根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；梳爪叩头虫；圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)(圆头犀金龟、蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)(南方圆头犀金龟、蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)；玉米长喙象；Anuraphis maidiradicis(玉米根蚜)；麦长蝽；红足黑蝗；迁飞黑蝗；种蝇；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis)；美洲锥尾蓟马(Anaphothripsobscrurus)；窃蚁(Solenopsis molesta)；二点叶螨。
对于高粱，针对下面的真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体有效玉米大斑病菌、禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)、高粱尾孢、高粱胶尾孢、高粱生壳二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假单胞菌丁香致病变种、油菜黄单胞菌高粱致病变种、须芒草假单胞菌、紫柄锈菌(Pucciniapurpurea)、菜豆壳球孢、高粱根腐病菌、串珠镰孢、链格孢、Bipolarissorghicola、高粱生长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、弯孢、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、燕麦假单胞菌(白沉淀假单胞菌(Pseudomonasalboprecipitans))、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachora sacchari)、丝孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)(丝轴黑粉菌)、高粱轴黑粉菌(Sphacelothecacruenta)、高粱坚孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花叶H(Sugarcanemosaic H)、玉米矮花叶病毒A&B、高粱麦角(Claviceps sorghi)、立枯丝核菌、点枝顶孢菌、指疫霉菌、高粱指霜霉、菲律宾指霜霉、禾生指梗霉、禾本科镰孢、尖镰孢、禾根腐霉、禾生腐霉，以及致病细菌/线虫斑禾草螟(Chilo partellus(sorghum borer))；秋夜蛾；美洲棉铃虫；南美玉米苗斑螟；粒肤地老虎(Feltia subterranea)；Phvllophaga crinita(蛴螬)；Eleodes spp、宽胸金针虫Conoderus spp.和Aeolus spp.(捻转血矛线虫)；黑角负泥虫；玉米铜色跳甲；玉米长喙象；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)(玉米缢管蚜)；黄伪毛蚜(Siphaflava)(蔗黄伪毛蚜)；麦长蝽；高粱瘿蚊(Contariniasorghicola)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)；二点叶螨。
对于棉花，针对下面的致病昆虫/线虫有效烟芽夜蛾；美洲棉铃虫；甜菜夜蛾；棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)；墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis grandis)；棉蚜(Aphis gossypii)(cotton aphid)；棉伪斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)；结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris)；红足黑蝗；特异黑蝗；棉蓟马；烟褐蓟马(Franklinkiella fusca)；朱砂叶螨；二点叶螨；对于稻，针对下面的致病昆虫/线虫有效小蔗螟；秋夜蛾；美洲棉铃虫；葡萄肖叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)；米象(Sitophilusoryzae)；Nephotettix nigropictus(黑尾叶蝉)；麦长蝽；拟绿蝽；对于芸苔，针对下面的致病昆虫/线虫有效甘蓝蚜(Brevicorynebrassicae)；萝卜菜跳甲(phyilotreta cruciferae)；披肩粘虫(Mamestraconjgurata)；菜蛾(Plutella xylostella)；种蝇(Delia ssp.)(根蛆)。
根据本发明，术语“野生型”理解为各自的非遗传修饰的亲本生物。
根据本发明的方法在转基因植物和/或在植物细胞中引起过氧化物酶含量的增加。含量的这一增加至少为5％，优选至少为20％，还优选至少为50％，特别优选至少为100％，还特别优选至少为5倍，尤其优选的至少为10倍，还尤其优选至少为50倍，以及最优选为100倍。
本文用到的术语“DNA片段”理解为编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的DNA区段，其中由DNA区段编码的蛋白质基本具有和由完整DNA序列编码的蛋白质相同的过氧化物酶活性，并且应用这些片段可以实现在根据本发明的转基因植物中增加病原体抗性。
本文用到的术语“蛋白质片段”指的是具有过氧化物酶活性的蛋白质区段，其中蛋白质区段和全长蛋白质基本具有相同的过氧化物酶活性，并且应用这些片段可以实现在根据本发明的转基因植物中增加病原体抗性。
在根据本发明的方法中所用的过氧化物酶的基本相同的酶活性指的是与由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列所编码的酶及其衍生物相比，所述酶活性仍然至少是50％，优选至少是60％，特别优选至少是70％，并且尤其优选至少是80％，并且最优选至少是90％。因此具有基本相同的酶活性的过氧化物酶也能在转基因植物中产生增加的病原体抗性。
过氧化物酶的活性可以通过本领域技术人员已知的简单方法测定，如广泛应用的guajacol过氧化物酶活性测定(Chance和Maehley(1955)Method Enzymol.11764-775)或丁香醛连氮活性测定(Pandolfini等人(1992)Plant Cell Environ.15719-725)。
本文用到的术语“核酸(分子)”在优选的实施方案中另外包括位于编码基因区域的3’和5’端的未翻译的序列编码区5’端上游该序列的至少500、优选地200、特别优选地100个核苷酸，以及编码基因区域的3’端下游该序列的至少100、优选地50、特别优选地20个核苷酸。“分离的”核酸分子从在核酸的天然贮库中存在的其它核酸分子中分离出来。“分离的”核酸优选地没有天然与该核酸来源生物的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(例如，位于此核酸5’和3’端的序列)。在多种实施方案中，分离的过氧化物酶分子可以包含例如小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位于核酸来源细胞的基因组DNA中该核酸分子的侧翼。所有在此提及的核酸分子可以是例如RNA、DNA或cDNA。
在本方法中使用的核酸分子，例如具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的核苷酸序列的核酸分子，可以使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离。借助于可以在如NCBI主页(http://www.ncbi.hlm.nih.gov)下找到的比较算法，还可以在DNA或氨基酸水平上鉴定出例如同源序列或同源的保守序列区域。此序列的基本部分或完整的同源序列可以用作杂交探针，使用标准杂交技术(如在Sambrook等人中所描述的，见上)通过筛选cDNA和/或基因组文库从可用于本方法的其它生物中分离另外的核酸序列。此外，使用以在此给出的序列或其一部分为基础的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应可以分离包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的完整序列的核酸分子(例如，使用基于相同序列生成的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应可以分离包含完整序列或其部分的核酸分子)。例如，可以从细胞中分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人(1979)Biochemistry 185294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，并且cDNA可以从所述mRNA中用逆转录酶(例如Moloney-MLV逆转录酶，购自Gibco/BRL，Bethesda，MD，或AMV逆转录酶，购自SeikagakuAmerika，Inc.，St.Petersburg，FL)产生。用于通过聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物可以根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示序列的一种生成，或借助于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列生成。根据本发明的核酸可以通过使用cDNA，或备选地使用基因组DNA作为模板，并且使用适当的寡核苷酸引物，通过标准PCR扩增技术来扩增。以此方式扩增的核酸可以克隆到适当的载体中并且用DNA序列分析来鉴定。对应于过氧化物酶核苷酸序列的寡核苷酸可以通过标准的合成方法产生，如通过自动DNA合成仪。由这些核酸序列编码的蛋白质的过氧化物酶活性之后可以通过上述的酶测定法来测定。使用在此所描述的方法，还可以通过检测根据本发明所鉴定的过氧化物酶的存在来鉴定表现出非宿主抗性的植物。
在本发明的上下文中，术语“在严格条件下杂交”意思是杂交在能确保特异性杂交的足够严格的条件下体外进行。严格体外杂交条件为本领域技术人员所已知并且可以在文献(如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)中查到。术语“特异性杂交”指的是这种事实，即在严格条件下，分子优选地结合到某一核酸序列(靶序列)上，但是如果靶序列是例如DNA或RNA的复杂混合物的一部分，那么所述分子不结合到或至少以相当小的程度结合到其它序列上。
严格条件决定于多种条件。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。通常选择严格条件，使在确定的离子强度和确定的pH值下杂交温度比特定序列的解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在平衡状态下与靶序列互补的分子的50％杂交到靶序列时的温度(处于确定的pH值，确定的离子强度和确定的核苷酸浓度)。通常，严格条件是指那样的条件，其中在7.0到8.3的pH下盐浓度为至少大约0.01到1.0M钠离子浓度(或另一种盐的浓度)，并且对于短的分子(例如10到50个核苷酸)，温度为至少30℃。此外，严格条件可以包括添加去稳定化杂交分子的试剂，如甲酰胺。在本文用到的严格条件下的杂交中，相互具有至少60％同源性的核苷酸序列通常保持相互杂交。优选地，按照以下方式选择严格条件，即相互同源性至少为大约65％，优选地至少为大约70％，并且特别优选地至少为大约75％，或更高的序列通常保持相互杂交。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在大约45℃下杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS、50℃到65℃下进行一步或多步洗涤步骤。温度范围，例如在标准杂交条件下的温度范围决定于核酸的类型，在浓度为0.1到5×SSC(pH 7.2)的水性缓冲液中为42℃到58℃。
如果有机溶剂如50％甲酰胺存在于上述缓冲液中，在标准条件下的温度为大约42℃。优选地，DNADNA杂交分子的杂交条件为例如0.1×SSC和20℃到45℃，优选地为30℃到45℃。优选地，DNA:RNA杂交分子的杂交条件为例如0.1×SSC和30℃到55℃，优选地在45℃到55℃之间。为在例如没有甲酰胺时具有大约100个碱基对长度和G/C含量为50％的核酸确定上述杂交温度。本领域的技术人员已知如何应用上述或下列教科书确定所需的杂交条件，所述教科书为Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，Hames和Higgins(publisher)1985，Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(publisher)1991，Essential MolecularBiologyA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本发明中的术语“序列同一性”指的是同一性，即在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所述的核酸序列的完整序列中，在相同的5’-3’序列中相同的核苷酸至少为80％，优选地至少为85％，特别优选地至少为90％，最优选地至少为95％。
序列同一性用基于多种算法的一些程序确定。Needleman和Wunsch的算法或Smith和Waterman的算法提供了尤其可靠的结果。对于序列比较，使用了程序PileUp(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evolution 25351-360；Higgins等人，(1989)CABIOS 5151-153)，或程序Gap和Best Fit(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol. Biol. 48443-453，以及Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482-489)，所述程序包含在GCG软件包中(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美国)。
以上以百分数描述的序列同一性值使用GAP程序跨越完整的序列区确定，使用下列设置缺口权重50，长度权重3，平均匹配10000以及平均错配0.000。
除非另外说明，这些设置用作序列比较的标准设置。
与在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所给的核酸序列背离的核酸序列可以例如通过向SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的核苷酸序列中插入一个或多个核苷酸替代、添加或缺失来产生，由此产生的蛋白质与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中所述的序列相比插入了一个或多个氨基酸替代、添加或缺失。可以使用标准技术如位点专一诱变和PCR介导的诱变将突变插入到SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的序列之一中。优选地，在一个或几个预测的非必需氨基酸残基处产生保守氨基酸替代，非必需氨基酸残基是不影响过氧化物酶酶活性的氨基酸残基。在“保守氨基酸替代”中，氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代。在专业知识领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有下列侧链的氨基酸碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。因此根据本发明所用的过氧化物酶中预测的非必需氨基酸残基将优选地被来自同样侧链家族的另一个氨基酸残基所替代。备选地，在另一个实施方案中，例如通过饱和诱变，突变可以在编码过氧化物酶的完整序列或其一部分中随机地插入，并且得到的突变体可以通过重组表达所编码的蛋白质来筛选过氧化物酶的活性，从而鉴定保留过氧化物酶活性的突变体。蛋白质的过氧化物酶活性可以例如使用本文描述的测定法测定。
在本发明的术语中，“转基因的”或“重组的”意思是对于如核酸序列、表达盒(＝基因构建体)、或包含根据本发明的核酸序列的载体、或用分别的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有那些构建体都用基因技术产生，其中a)根据本发明的核酸序列，或b)功能性地连接到根据本发明的核酸序列上的遗传控制序列，如启动子，或c)a)和b)的任一种不在其天然遗传环境中，或用基因技术进行了修饰，修饰是例如一个或几个核苷酸残基的替代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境意思是在亲本生物中的天然基因组或染色体基因座，或在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地是至少部分保守的。此环境与核酸序列的至少一侧侧面相接，并且具有的序列长度至少为50bp，优选地至少为500bp，特别优选地至少为1000bp，尤其优选地至少5000bp。当天然发生的表达盒(例如过氧化物酶的天然启动子与各自的过氧化物酶基因的天然发生的组合)用非天然、合成的(“人工的”)方法(如诱变)修饰时，它就成为了转基因表达盒。相应的方法在例如US5,365,350或WO 00/15815中描述。
根据本发明，如上所述的术语转基因植物或植物细胞意思是本方法使用的核酸没有在植物或植物细胞基因组中它们的天然位点上，由此所述核酸可以同源或异源地表达。然而，转基因还指的是虽然根据本发明的核酸位于生物基因组中它们的天然位点上，但是相对于天然序列此序列已经改变，和/或天然序列的调节序列已经被修饰。优选地，转基因理解为根据本发明的核酸在基因组的非天然位点上表达，即核酸同源地或优选异源地表达。
本领域技术人员显而易见的是，用于产生转基因植物或植物细胞、编码过氧化物酶的核酸序列需要被调整以适应生物特异性的密码子选择。密码子选择可以用所选生物的其它已知基因的计算机分析确定。
在产生根据本发明的具有增加的病原体抗性的转基因植物或植物细胞的优选方法中，将编码根据本发明的过氧化物酶的核酸序列分别转移到植物或植物细胞中。所述转移使得过氧化物酶的表达或活性比野生型的植物或野生型的植物细胞增加，并且相应地使得转基因植物或植物细胞的病原体抗性增加。
根据本发明，所述方法一般包括下列步骤a)产生包含5’-3’方向上下列核酸序列的载体-在植物细胞中有活性的启动子的调节序列，-有效连接到其上的编码根据本发明的过氧化物酶或过氧化物酶的部分的DNA序列，-有效连接到其上的在植物细胞中作为转录、终止和/或加A信号的调节序列，b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞中，并且任选地，整合到植物基因组中；并且c)任选地，从转化的植物细胞中再生完整植物。
在插入到植物细胞或植物中后，本方法中所用的核酸可以位于单独的质粒上，或优选地整合到宿主细胞的基因组中。在整合到基因组的情形中，整合可以是随机发生的，或通过用插入的拷贝替换天然基因的重组(它引起细胞过氧化物酶表达的调节)，或通过使用反式(in trans)基因从而将此基因功能性地连接到功能表达单元上，所述功能表达单元包含确保基因表达的至少一种序列和确保功能性转录基因的多聚腺苷化作用的至少一种序列。
根据本发明，编码过氧化物酶的核酸的基因表达的增加也表示对植物内源过氧化物酶表达的操作。这可以通过例如修饰过氧化物酶编码基因的启动子DNA序列来实现。这种修饰导致内源过氧化物酶基因的表达速率的改变，优选增加，所述修饰可以依靠DNA序列的缺失或插入来发生。内源过氧化物酶基因的启动子序列的修饰通常导致过氧化物酶基因表达量的改变，并且因此还导致在细胞或植物中可检测到的过氧化物酶活性的改变。
增加内源过氧化物酶活性和含量的另一种可能是上调参与内源过氧化物酶基因转录的转录因子，例如通过过表达。本领域的技术人员已知转录因子过表达的方法，并且这些方法在本发明中公开以用于过氧化物酶。
此外，可以实现增加内源过氧化物酶基因表达，因为未转化的生物中不存在的调节子蛋白质与这些基因的启动子相互作用。所述的调节子可以是由DNA结合结构域和转录激活结构域组成的嵌合蛋白质，例如在WO96/06166中描述。
除了要被转移的过氧化物酶的核酸序列，用于过氧化物酶表达的重组核酸分子还包含另外的调节元件。这些载体需要包含哪些精确的调节元件决定于每种情况下使用这些载体的方法。本领域技术人员熟悉用于产生蛋白质表达增加的转基因植物多种上述方法，知道这些载体必须包含哪些调节元件和其它元件。
通常，作为载体的部分的调节元件允许用于转录并且如果需要，在植物细胞中用于翻译。这意味着，例如根据所选择的植物，基因只能在诱导后表达和/或过表达，或其立即表达和/或过表达。例如，这些调节序列是诱导物或阻抑物结合、从而调节核酸表达的序列。除了这些新的调节序列，或代替这些序列，实际的结构基因上游序列的天然调节仍可以存在，也可能已经被基因修饰从而使天然调节失去功能，并且基因的表达增加。然而重组核酸分子也能以更简单的方式构建，即在核酸序列的上游不插入额外的调节信号并且不除去天然启动子与其调节。而是将天然调节序列以调节不再发生和/或基因表达增加的方式突变。为了增加活性，可以将这些改变的启动子以部分序列的形式单独的插入天然基因的上游。另外，基因构建体还可以有利地包含一个或多个所称作的增强子序列，所述增强子序列功能性地连接启动子并且允许核酸序列的表达增加。其它有用的序列，如另外的调节元件或终止子，也可以插入到DNA序列的3’端。
原则上，有可能使用具有其调节序列的任意天然启动子用于根据本发明的方法。但是也有可能并且有利地仅使用合成启动子或另外使用合成启动子。
启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子。启动子以及其它调节序列的选择决定了区域和时间表达图式，并且由此也决定了转基因植物中过氧化物酶的表达。
组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子以及在WO99/43838和美国专利号6,072,050中描述的其它组成型启动子、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature313810-812)、肌动蛋白启动子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2163-171)、泛蛋白启动子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18675-689)、pEMU启动子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS启动子(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)、ALS启动子(美国申请号08/409.297)，以及类似的启动子。当使用组成型启动子时，也可以通过在不需要此基因表达的细胞或组织中抑制该基因表达来实现细胞特异性或组织特异性的表达，抑制基因表达通过如形成结合到该基因产物上的抗体并且由此阻止产物的活性，或通过在这些细胞中作用的适当的抑制剂实现。
优选地，过氧化物酶基因通过诱导型启动子表达，并且特别优选地是通过病原体诱导型启动子表达。此种启动子包括病原体感染后诱导的致病相关蛋白(PR蛋白)的启动子，所述致病相关蛋白为例如PR蛋白、SAR蛋白质、β-1，3葡聚糖酶、几丁质酶等(例如参见，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4111-116)。
另外特别重要的启动子是在病原体感染部位上或其附近局部表达的启动子，如在Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.9335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.293-98；Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9314972-14977；Chen等人(1996)Plant J.10955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912507-2511；Warner等人(1993)Plant J.319l-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968中所描述的启动子。
此外，由于病原体通常通过创伤进入，创伤诱导型启动子也优选地用在根据本发明的方法中。此种创伤诱导型启动子包括马铃薯的蛋白酶抑制剂(pin II)的启动子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology 14494-498)、wun1和wun2的启动子(美国专利Nr.5,428,148)、win1和win2的启动子(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215200-208)、系统素的启动子(McGurl等人(1992)Science 2251570-1573)、WIP1的启动子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22783-792；Eckelkamp等人(1 993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因的启动子(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)141-150)、FGAM-合酶的启动子(Vaghchhipawala等人(2004)Genome 47(2)404-413)、prxC2的启动子(Kaothien等人(2002)Plant Mol.Biol.49(6)591-599)、poxA的启动子(Ito等人(2000)Plant Science 155(1)85-100)、FAD7的启动子(Nishiuchi等人(1999)Plant Physiol.121(4)1239-1246)、TR2′的启动子(WO 03/093483)。
通过应用外源化学调节子，可以使用化学调节的启动子来调节在植物中的基因表达(见在Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，4889-108中的综述)。当希望基因表达以时间特异的方式发生时，化学诱导型启动子是特别适合的。此类的实例包括苯磺酰胺激活的玉米In2-2启动子、疏水亲电化合物诱导的玉米GST启动子、水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其它化学调节的启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如在Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)247-257中的糖皮质素诱导的启动子)、乙醇诱导的启动子和四环素诱导的启动子(参见，例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227229-237；美国专利号5,814,618和5,789,156)。
本领域的技术人员已知诱导型启动子的使用允许产生仅瞬时表达根据本发明的序列的植物或植物细胞。此类瞬时表达允许产生仅表现出瞬时病原体抗性的植物。例如当病原体污染的危险迫在眉睫并且因此植物只在某段时期内需要对病原体有抗性时，需要此类瞬时抗性。本领域的技术人员已知需要瞬时抗性的另外的情况。此外，本领域的技术人员还知道通过使用载体可以实现瞬时表达以及由此产生的瞬时抗性，所述载体在植物细胞中不稳定地复制并且携带表达过氧化物酶的各自序列。
也可以使用组织特异性的启动子来实现在某一植物组织中增加的过氧化物酶表达。适当的组织特异性的启动子是例如允许叶特异性表达的启动子。这些包括在Yamamoto等人(1997)Plant J.1(2)255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol 105357-367；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.35(5)773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3509-518；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；Stockhaus等人(1987)Proc.Natl.Acad.G.USA 847943-7947；Stockhaus等人(1989)EMBO J.82445-2451中所描述的启动子。
由于作为高等植物地上器官的外组织的表皮的任务之一是阻止病原体侵入到植物中，因此表皮特异性的启动子的使用也是特别优选地。恰当的表皮特异性启动子包括拟南芥(Arabidopsis)的CER6(CUT1)基因的启动子(Hooker等人(2002)Plant Physiol.129(4)1568-1580和Kunst等人(2000)Biochem.Soc.Trans.28(6)651-654)。
其它优选地启动子为在果实中特别有活性的启动子。这些包括，例如多聚半乳糖醛酸酶基因的启动子(例如马铃薯的)(Nicholass等人(1995)Plant Mol.Biol.28423-435)、ACC氧化酶的启动子(例如苹果的)(Atkinson等人(1998)Plant Mol.Biol.38449-460)或马铃薯的2A11启动子(vanHaaren等人(1991)Plant Mol.Biol.17615-630)。
还优选叶肉特异性启动子，如稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人(1993)Plant Physiol.102(3)991-1000)、玉米的PPCZm1启动子(Kausch等人(2001)Plant Mol Biol.45(1)1-15)、拟南芥的CAB2启动子(Thain等人(2002)Plant Physiol.130102-110)、或稻的AldP启动子(Kagaya等人(1995)Mol Gen Genet.248(6)668-674)。
另外，本领域技术人员能够用常规方法分离另外适当的启动子。因此，使用当前的分子生物学方法如杂交实验或DNA蛋白质结合研究，本领域的技术人员能够鉴定如另外的表皮特异性调节核酸元件。在此，例如，第一步从所需的生物中分离所需的组织，从所述组织中分离出调节序列、分离出完整的聚(A)+RNA，并且产生cDNA文库。在第二步中，使用基于聚(A)+RNA分子从另一组织得到cDNA克隆，这些克隆依靠杂交从第一个文库(bank)中鉴定出来，其相应的聚(A)+RNA分子仅在所希望的组织中积累。之后使用鉴定出的cDNA，将具有组织特异性调节元件的启动子分离出来。本领域的技术人员还可以使用额外的基于PCR的方法用来分离适当的组织特异性启动子。
根据本发明的载体作为调节元件，可以另外包含如增强子元件。它们还可以包含抗性基因、复制信号和附加的DNA区域，所述的这些使载体在细菌如大肠杆菌(E.coli)中能增殖。调节元件还包含实现载体在宿主中稳定化的序列。此类调节元件特别包含以下序列，即所述序列促进载体稳定整合到植物的宿主基因组中，或促进载体在植物细胞中自主复制。本领域的技术人员已知此类调节元件。
所称作的终止序列是确保转录或翻译恰当终止的序列。如果要翻译所转移的核酸，那么终止序列一般为终止密码子和各自的调节序列；如果转移的核酸仅被转录，那么它们通常为聚腺苷酸序列。
本文用到的术语“载体”涉及能够将结合到其上的另一核酸转运到细胞中的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，其表现为附加的DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。另一种载体类型是病毒载体，其中附加的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体可以在它已经插入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它载体在插入到宿主细胞中时有利地整合到宿主细胞的基因组中，并且从而和宿主基因组一起复制。而且，某些载体可以调控其功能性连接的基因的表达。这些载体在此称作“表达载体”。通常，适于DNA重组技术的表达载体是质粒类型的载体。由于质粒是最常用的载体类型，所以在本说明书中“质粒”和“载体”可以互换使用。但是，本发明也意在包含其它类型的表达载体，如完成类似功能的病毒载体。此外，术语“载体”还意在包含本领域技术人员已知的其它载体，如噬菌体、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、转座子、插入序列、噬粒、噬菌粒、黏粒、线性或环状DNA。
在重组表达载体中，术语“有效连接到其上”意思是将目标核苷酸序列以该核苷酸序列表达可能发生的方式连接到调节序列上，并且两种序列都以使得序列完成预测的功能的这种方式互相连接。
术语“调节序列”意在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如加A信号)。这些调节序列在如下中进行了描述例如GoeddelGeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)或在Gruber和Crosby，在Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，Florida，publisherGlick和Thompson，第7章，89-108。调节序列包含那些在多种类型的宿主细胞中调节核苷酸序列组成性表达的序列，以及那些只在某些宿主细胞中在某些条件下调节核苷酸序列直接表达的序列。本领域的技术人员已知表达载体的设计决定于一些因素，如要转化的宿主细胞的选择、蛋白质表达的所希望的程度等。
用于过氧化物酶表达的重组表达载体在原核细胞和真核细胞中都有活性。这是有利的，因为为了简单起见，通常将载体构建的中间步骤在微生物中进行。这些克隆载体包含用于各自微生物的复制信号、以及用于选择成功转化的细菌细胞的标记基因。本领域的技术人员知道用于在原核生物中表达的适当载体；它们包括例如大肠杆菌pLG338、pACYC184、pBR系如pBR322、pUC系列，如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、或pBdCl、链霉菌pIJ101(Streptomyces pIJ101)、pIJ364、pIJ702、或pIJ361、芽孢杆菌pUB110(Bacillus pUB110)、pC194、或pBD214、棒杆菌pSA77(Corynebacterium pSA77)、或pAJ667。
在另一实施方案中，表达载体代表酵母表达载体或杆状病毒(bacillovirus)表达载体。
上述提到的载体仅提供了可能适当的载体的少量概括。其它质粒为本领域的技术人员已知并且在例如Cloning Vectors(publisher Pouwels，P.H.等人Elsevier，Amsterdam，New York-Oxford，1985)中描述。对于适合原核细胞和真核细胞的另外的表达系统，参见Sambrook和Russell的第15和16章(见上)。
在本方法的另一实施方案中，过氧化物酶可以在单细胞的植物细胞如藻类中表达，见Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)239-251和在本文中引用的文献，也可以在高等植物的植物细胞中表达(例如种子植物，如作物植物)。植物表达载体的实例包括在以下文献广泛描述的那些Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.(1992)，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)，Nucl.Acids Res.128711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中。
由于植物基因的表达通常并不限于转录水平，植物表达盒除了上述的元件还优选地包含其它功能性连接的序列，如翻译增强子，例如包含烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的超驱动序列，所述的超驱动序列增加了蛋白质/RNA的比例(Gallie等人(1987)Nucl.Acids Research 158693-8711)。
如上所述，必须将要表达的基因功能性连接到适当的启动子上，所述启动子以时间特异性、细胞特异性或组织特异性的方式调节基因表达。已经在上文描述了适当的启动子。
在基因表达盒的功能性连接中所用的其它优选地序列是在基因产物靶向到各自的细胞隔室中所需的靶序列(见在Kermode(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15(4)285-423中的综述和其中引用的文献)，例如在进入到液泡、细胞核、所有类型的质体(如造粉体、叶绿体、色质体)、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体以及植物细胞的其它隔室中所需的靶序列。
有利地，将过氧化物酶序列按照已知的方式扩增和连接以插入到表达载体中。优选地，按照Pfu DNA聚合酶或Pfu/Tag DNA聚合酶混合物的方案进行。根据将要被扩增的序列来选择引物。有利地，选择引物要使得扩增产物(amplificate)包含从起始密码子到终止密码子的完整编码的序列。有利地，在扩增后分析扩增产物。例如在凝胶电泳分离后进行关于质量和数量的分析。之后根据标准方案(如Qiagen)将扩增产物纯化。之后纯化的扩增产物的整分试样用于随后的克隆。
本领域的技术人员通常知道适当的克隆载体。这些克隆载体特别包括在微生物系统中可复制的载体，例如尤其是在细菌、酵母或真菌中允许有效克隆以及允许植物的稳定转化的载体。尤其值得提及的载体是适合于T-DNA介导的转化的多种二元载体系统和共整合载体系统。通常此类载体系统的特征在于它们至少包含土壤杆菌介导的转化所需的毒力基因以及T-DNA限制序列(T-DNA边界(T-DNA border))。优选地，这些载体系统还包含另外的顺式调节区，如启动子和终止子和/或用于鉴定各自的转化生物的选择标记。在共整合载体系统中毒力基因和T-DNA序列排列在同一个载体上，而二元系统则基于至少两种载体，其一携带毒力基因但不携带T-DNA，以及另一个携带T-DNA而不携带毒力基因。因此后一载体相对较小，在大肠杆菌以及土壤杆菌中易于操作和复制。这些二元载体包括载体系列pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen。根据本发明，优选地为Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。Hellens等人(2000)Trends inPlant Science 5，446-451提供了二元载体及其应用的综述。
对于载体制备，可以首先通过限制性内切核酸酶将载体线性化，然后以任何合适的方式进行酶促修饰。之后纯化载体并且将整分试样用于克隆。在克隆期间，通过连接酶将酶切和纯化(如果需要)后的扩增产物连接到用相似方法制备的载体片段上。某些核酸构建体、或载体构建体或质粒构建体可以具有一个或甚至几个编码的基因区。优选地，将这些构建体中编码的基因区功能性地连接到调节序列上。调节序列尤其包括植物序列，如上述启动子和终止子。构建体有利地可以在适当的培养基中在微生物尤其是大肠杆菌和根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中培养，并且在选择条件下稳定增殖。之后收获并且裂解细胞并从中提取质粒。这可用于将异源DNA转移进植物或微生物中。
关于克隆载体的有利的用途，可以将根据本发明的方法中所用的核酸、根据本发明的核酸和核酸构建体插入到生物中，如微生物、或优选地如植物，并且将它们用于植物转化，如在下面文献中所公开和引用的PlantMolecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F. White，Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization中，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，Bd.1，Engineeringand Utilization中，publisherKung等人R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus(1991)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42205-225。因此在本方法中所用的核酸、根据本发明的核酸和核酸构建体、和/或载体可以用于广谱生物的遗传修饰，优选地用于植物的遗传修饰。
有很多已知的技术可用于将DNA插入植物宿主细胞，并且本领域的技术人员可以不困难的找到每种情况下最适当的方法。这些技术包括应用根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rguzogenes)作为转化剂，用T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、分离的DNA到原生质体中的直接基因转移、DNA的电穿孔、依靠生物射弹方法的DNA插入以及其它可能。稳定转化和瞬时转化都可以以这种方式产生。
对于植物中DNA的注射和电穿孔，本质上对于所使用的质粒没有特殊的要求。类似的对于直接基因转移也是这样的。可以使用简单质粒如pUC衍生物。但是如果要从这种转化的细胞中再生出完整植株，那么需要选择性标记基因的存在。本领域的技术人员已知最常用的选择性标记，并且对于他来说选择适当的标记并不存在困难。常用的选择性标记是使转化的植物细胞对杀生物剂或对抗生素有抗性的那些选择性标记，如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、N-膦酰甲基甘氨酸、链霉素、磺酰脲、艮他霉素或膦丝菌素等。单独选择的标记可以用于选择转化细胞(相对于缺少插入DNA的细胞)。为此目的，备选的标记如营养标记或筛选标记(如GFP，绿色荧光蛋白)也是适当的。当然，也可以完全省却选择性标记，但是这会极大的增加对筛选的需要。如果需要无标记的转基因植物，本领域的技术人员也可用允许随后除去标记基因的方法，如共转化、或序列特异性重组酶。一旦插入的DNA整合进入植物细胞的基因组中，它通常在那里是稳定的，并且还将保留在最初转化细胞的后代中。
如果土壤杆菌用于转化，如上说明的，必须将要插入的DNA克隆到特定的质粒(居间载体或二元载体)中。由于居间载体中与T-DNA的序列同源的序列，居间载体可以通过同源重组整合到土壤杆菌的Ti或Ri质粒中。质粒还包含T-DNA转移所必需的致病区(vir region)。居间载体不能在土壤杆菌中复制。可以依靠辅助质粒将居间载体转移到根瘤土壤杆菌中(接合作用)。二元载体可以在大肠杆菌以及土壤杆菌中复制。它们包含用左右T-DNA边界区域围住的选择性标记基因和接头或多聚接头。它们可以直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人(1978)，Molecular and General Genetics163，181-187)。作为宿主细胞起作用的土壤杆菌应当包含携带致病区的质粒。致病区对于T-DNA转移到植物细胞中是必需的。还可以存在T-DNA。以这种方式转化的土壤杆菌用于植物细胞的转化。
在EP 120 515中已经广泛分析和充分描述了T-DNA用于植物细胞转化的用途。
对于DNA到植物细胞中的转移，有利地可以用根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌培养植物外植体。之后在包含用于转化细胞选择的抗生素或杀生物剂的适当的培养基中，可以从感染的植物材料(如叶切片、柄节、根，还有原生质体或悬浮培养的植物细胞)中再生完整植株。根据常规的再生方法，应用已知的培养基进行植物的再生。以这种方式得到的植物或植物细胞可以通过已建立的方法如DNA印迹法或PCR来分析插入DNA的存在。
本领域的技术人员已知使用生物射弹方法或原生质体转化来插入外源DNA的其它可能性(见L.Willmitzer(1993)Transgenic Plants在Biotechnology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise中(publisherH.J.Rehm等人)，第2卷，627-659，VCH Weinheim，德国)。
其间，通过Ti质粒载体系统依靠根瘤土壤杆菌不仅很好的建立了双子叶植物或其细胞的转化，还建立了单子叶植物或其细胞的转化(见Chan等人(1993)，Plant Mol.Biol.22，491-506等等)。
单子叶植物或其细胞转化的备选系统包括依靠生物射弹方法转化(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.104，37-48；Vasil等人((1993)Bio/Technology 11，1553-1558；Ritala等人(1994)Plant Mol.Biol.24，317-325；Spencer等人(1990)，Theor.Appl.Genet.79，625-631)、原生质体转化、部分透化的细胞的电穿孔以及通过玻璃纤维插入DNA。
转化细胞在植物中以通常方式生长(另外见McCormick等人(1986)，Plant Cell Reports 5，81-84)。得到的植物可以正常培养，或与具有相同的转化遗传密码或不同的遗传密码的植物进行品种间杂交。得到的杂种个体具有相应的表型特征。应当培养2代或更多代以确保表型特征稳定的保留和传递。同样，应当收获种子以确保已经将各自的表型或其它特征保留。
类似的，根据常规方法可以鉴定转基因系，所述转基因系对于新的核酸分子是纯合的，并且可以分析它们关于病原体反应性的存在或缺乏的表型行为以及将所述的表型行为与半合子系的行为比较。
当然，包含根据本发明的核酸分子的植物细胞还可以另外以细胞培养物的形式(包含原生质体、愈伤组织、悬浮培养物等)培养。
根据本发明的方法可以有利地与赋予病原体抗性(例如针对昆虫、真菌、细菌、线虫等的抗性)、胁迫抗性或植物特征的另一种改进的另外的方法组合。实施例和其它在Dunwell JM(2000)J Exp Bot.51487-496中提及。
根据本发明，术语转基因植物包含完整的植物以及植物的所有部分，其中根据本发明的植物过氧化物酶蛋白质的表达增加。这包括植物和植物器官的所有部分，例如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、柄、胚、愈伤组织、子叶(cotelydons)、叶柄、农作物材料、植物组织、繁殖组织、来自转基因植物的细胞培养物和/或可以用来产生转基因植物的部分。
根据所用的载体系统，还可以根据本发明生成转基因植物，其中要转移的核酸作为独立的复制系统包含在植物细胞或植物中。用于植物转移的载体之后必须具有相应的DNA序列，所述的DNA序列会促进在细胞中用于转移的质粒的复制。
在植物或植物细胞中的过氧化物酶蛋白质的特异性表达根据本发明可以通过常规的分子生物学和生物化学方法证实和跟踪。本领域的技术人员知道这些技术并且能容易地选择适当的检测方法，如用于检测过氧化物酶特异性RNA或用于测定过氧化物酶特异性RNA积累的量的RNA印迹分析，或用于检测编码过氧化物酶的DNA序列的DNA印迹或PCR分析。用于此目的的探针或引物序列既可以与在SEQ ID No.1或3中给出的序列相同，也可以表现出与这些序列微小的不同。
当然，上述技术还可以用于鉴定由于存在本发明所鉴定的过氧化物酶而具有非宿主抗性的另外的植物。
用于根据本发明的方法的植物原则上可以是任何要使其对病原体侵袭产生抗性的植物。优选地，其为单子叶或双子叶农业植物、食用植物或饲料植物。
单子叶植物的实例是属于下列属的植物燕麦(Avena)、小麦(Triticum)、黑麦(Secale)、大麦(Hordeum)、稻(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草(Pennisetum)、Setaria(狗尾草)、高粱(Sorghum(millet))、玉米(Zea)等。
双子叶农业植物包括棉花、豆科植物(如豆类)，并且特别是苜蓿、大豆、油菜、芸苔、番茄、甜菜、马铃薯、向日葵、观赏植物及树。另外的农业植物可以包含水果(特别是苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘、菠萝和香蕉)、油椰、茶树、可可和咖啡树、烟草、剑麻、以及药用植物萝芙木(Rauwolfia)和洋地黄(Digitalis)。特别优选谷类小麦、黑麦、燕麦、大麦、稻、玉米和黍以及双子叶植物甜菜、芸苔、大豆、番茄、马铃薯和烟草。另外的农业植物可以从美国专利号6,137,030中收集。
优选的植物为金盏花、向日葵、拟南芥、烟草、辣椒、大豆、番茄、茄子、胡椒、胡萝卜、马铃薯、玉米、莴苣和甘蓝的类型、谷类、苜蓿、燕麦、大麦、黑麦、小麦、小黑麦、黍、稻、苜蓿、亚麻、棉花、大麻、Brassicacaes如油菜或芸苔、甜菜、甘蔗、坚果和果酒物种(wine species)或树，如杨树或紫杉。
本发明的另一个目标涉及根据本发明的转基因植物以及来自它的细胞、细胞培养物、部分、转基因繁殖材料用于产生食物和饲料、药物或精细化学品的用途。
将来自大麦的过氧化物酶鉴定为介导大麦对小麦禾布氏白粉菌隔离群的非宿主抗性的基因及其在转基因植物或植物细胞中用来介导病原体抗性的用途将分别在下文中解释。下列实施例应不解释为限制。在本专利申请中引用的所有文献、专利申请、专利和公布的专利申请的内容在此引用作为参考。
实施例实施例1常规克隆方法克隆方法如限制性消化、琼脂糖凝胶电泳，DNA片段的纯化、核酸到硝化纤维素膜和尼龙膜的转移、DNA片段的连接、大肠杆菌细胞的转化、细菌的培养和重组DNA的序列分析按照在Sambrook等人(2001)(见上)中所描述的进行。
实施例2重组DNA的序列分析根据Sanger(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)的方法使用ABI的激光荧光DNA序列分析仪进行重组DNA分子的测序。
实施例3通过寡核苷酸指纹图谱法鉴定大麦的HvBgt1
用寡核苷酸指纹法(Radelof等人(1998)Nucleic Acids Res.26(23)5358-64)鉴定大麦过氧化物酶基因HvBgt1为Bgt诱导的基因。这一方法允许鉴定即使是非常低表达的基因的表达图式。
在用小麦霉感染的大麦植物的mRNA生成的文库中鉴定HvBgt1(Bgt；叶组织的收获时间6、24、48和72 h.p.i)。使用BASF公司开发的软件HyStac，比较在此文库中的个体簇的多度和作为参考的两个另外的大麦文库(用大麦霉(Bgh)接种的大麦和未接种的大麦)的多度。这一分析表明对于HvBgt1，在大麦+Bgt文库中多度增加了大约10倍。
实施例4大麦品系的培养和霉感染大麦野生型品系Ingrid MLOBc用于实验。种子由Dr.PatrickSchweizer，IPK Gatersleben提供。
在将种子放在土壤上后，4℃培育24小时以用于分层的目的。之后将植物在受控制的生长条件下放置在温室(Agrarzentrum Limburgerhof，BASFAG)中。平均温度是23℃，湿度在40％到70％之间。昼夜节律分别是10小时和14小时。播种7天后，用Bgh或Bgt接种植物。用于本实验的病原体大麦禾布氏白粉菌的隔离群FA6h由ETH Zurich at Heckenholz的研究工作站提供。病原体小麦禾布氏白粉菌是在the Agrarzentrum ofBASF AG在小麦变种Kanzler上培养的田间隔离群。对于感染，用Bgh严重感染的大麦植物或Bgt严重感染的小麦植物分别保持在需要被感染的大麦或拟南芥植物上面，并且将霉抖落使分生孢子转移到植物上。
实施例5被感染的大麦植物的总RNA的分离在4天的时期后，每隔24小时收获被感染的大麦材料和未被感染的对照，用铝箔包住并且在干冰中深度冷冻。叶子材料储存在-80℃下。在将叶子材料破碎为小片后，根据制造商的说明借助于RNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen，Hilden，德国)分离总RNA。用2×0.6ml的无RNA酶的水进行纯化的RNA的洗脱。用EPPENDORF BioPhotometer 6131确定浓度，并且随后用2体积的98％的乙醇和1/10体积的醋酸钠(3M，pH 5.2)沉淀RNA，并将其调整到大约2μg/μl的浓度。
实施例6通过定量PCR分析确定过氧化物酶的表达分离自叶子材料的RNA样品用于定量PCR。首先，将仍残余在RNA样品中的任何DNA消化。用来自AMBION(Huntingdon，美国)的DNA-freeTM按照下述准备消化RNA 50μl10x DNA酶I缓冲液6μlDNA酶I(2U/μL) 2μlH2O加到60μl2μl将混合物在37℃下温育30分钟。之后加入9μl的DNA酶灭活试剂并且充分混合溶液。在室温下进行2分钟额外的温育时间后，将溶液在10,000g下离心1分钟以沉淀DNA酶灭活试剂。将RNA转移到新的容器中并且储存在-20℃下。
在DNA酶消化后，将RNA逆转录为cDNA。使用APPLIEDBIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德国)的TaqMan Reverse Transcription Reagents进行测定RNA6μl25mM MgCl24.4μldNTP-Mix(10mM) 4μl50μM随机六聚体1μl10x RT缓冲液 2μlRNA酶抑制剂0.4μlMultiscribe RT(50U/μL)1.5μl无核酸酶的H2O 0.7μl混合物在25℃下温育10分钟，之后在37℃下温育60分钟。最后，在95℃下将混合物热灭活5分钟。
转录的DNA用20μl的H2O稀释并且将其中的2.5μl用于定量PCR。将18S rRNA确定为内标。对所有样品进行重复三次测定。将混合物移液到96孔板中。首先单独移液cDNA，之后单独向SYBR GreenMaster Mix中添加引物和相应量的水，并且将溶液混合。
cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip162，200nM0.09μl反向引物，Gip163，200nM0.14μl无核酸酶的H2O添加到25μl 9.77μlGip162CGAGGCCCTTGTGACATACATGip163ACTTAGGTGTCGTTACTTGGACCAT感染前各自的对照值作为参考样品(0小时)。对Bgh感染后24小时、48小时和72小时取得的样品进行转录量的测定。
18S rRNA的准备cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip63，200nM 0.12μl反向引物，Gip64，200nM 0.13μl无核酸酶H2O9.75μlGip63CGTCCCTGCCCTTTGTACACGip64AACACTTCACCGGACCATTCA平板在室温和2,500转/分钟(rpm)下离心1分钟并且将样品在来自APPLIED BIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德国)的ABI PRISM 7000装置中直接测量。使用APPLIED BIOSYSTEMS公司的ABI PRISM 7000 SDS程序进行评估。
在表5和
图1中说明了使用定量PCR测定的表达数据。测量进行了2次并且对单独的测量值重复三次测定。所显示的是各自的平均值以及相关的标准差。
表5在非宿主相互作用(大麦和Bgt)和宿主相互作用(大麦和Bgh)中HvBgt1的表达的时间进程的说明对于每种相互作用测量的0小时值作为比较值或校准物。
结果显示了三种系统对照、非宿主相互作用和宿主相互作用之间HvBgt1表达的显著性差异。记录到对照中测量起始后直到48小时，转录量显著增加了大约28倍，之后直到72小时的时间后这种增加几乎保持恒定。另一方面，在非宿主相互作用(大麦Bgt)中，24小时后察觉到几乎110倍的增加，之后这种增加在72小时后缓慢下降到10倍量。相比，在宿主相互作用(大麦Bgh)中，全部时间内只察觉到了最大仅为3倍的转录量的增加。
实施例7通过RACE-PCR对大麦HvBgt1的全长序列的分离将从感染的叶子材料中分离的RNA用于RACE-PCR。根据制造商的说明用Invitrogen(Karlsruhe，德国)的GeneRacerTM-Kit产生RACE cDNA文库。作为基因特异性的引物(GSP)，引物M207用作5’RACE引物，并且引物M208用作嵌套引物。
M207GCTTATTCAGCAGCCAACAAAGTAACM208CTGTTTCACAAGTTTATGGTCCAAGTAA样品PCR的准备10x聚合酶缓冲液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(Hv-RACE文库) 1μlGSP，M 207(10pmol)4μlGeneRacer X′Primer(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl)1μLH2O 33μlPCR程序 样品嵌套PCR的准备10x聚合酶缓冲液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(PCR准备) 5μlGSP，M207(10pmol) 4μl
GeneRacer X′nested primer，M 208(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl) 1μlH2O33μlPCR程序 基因HvBgt1的全长序列在一些部分步骤中扩增，随后测序，并且之后在计算机芯片上汇编。由于序列的一部分通过3’RACE用聚腺苷酸延伸扩增并且序列的另一部分通过5’RACE来扩增，所以新的序列可以通过重叠群(contig)与原始序列连接。完整序列大约是1,000bp。序列所有可能的ORF依靠计算机程序ContigExpress(INFORMAX，Maryland，美国)显示。发现了一个延伸945bp长的ORF。在起始的上游搜索另外的终止密码子以检验该基因是否是完整的。在5’方向的3个三联体后发现了终止密码子。
为了得到作为全长克隆的基因，选择允许完整基因扩增(末端-末端PCR)的引物。之后将PCR片段从琼脂糖凝胶中纯化出来并且克隆到pCR4-TOPO载体中。HvBgt1的全长核酸序列在SEQ ID No.1中说明，并且氨基酸序列在SEQ ID No.2中说明。
实施例8在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中与HvBgt1同源的基因的鉴定和克隆在得到大麦过氧化物酶(HvBgt1)的全长序列后，用此序列进行拟南芥基因组的BLAST搜索。鉴定了2种同源基因AtBgt1-1和AtBgt1-2。将这两种基因用来自拟南芥cDNA的适当引物通过PCR扩增，并且克隆到植物表达载体pCambia中，所述载体具有组成启动子以促进在拟南芥中过表达。
首先，使用Superscript First Strand Synthesis System forRT-PCR(INVITROGEN，Karlsruhe，德国)将总RNA转录成cDNA，所述总RNA来自未被感染的拟南芥植物和用链格孢和芸苔生链格孢(Alternaria brassicola)感染的拟南芥植物的混合物。
为了用铂Pfx聚合酶(INVITROGEN，Karlsruhe，德国)通过PCR从cDNA中扩增出基因的全长序列，根据AtBgt1-1或AtBgt1-2序列设计引物。AtBgt1-2要被扩增的片段大小应当是1015bp。根据下列方案用两种引物Fra335和Fra336进行AtBgt1-2序列的扩增10x聚合酶缓冲液，STRATAGENE(La Jolla，美国) 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN(Karlsruhe，德国) 1μlcDNA1μlFra335(20pmol) 1μlFra336(20pmol) 1μlTaq聚合酶(5U/μl) 1μlH2O 40μlFra335AGAAGTATGTTAAAGGTGGTGTTGTTGFra336TGACGAAGAGGTGATTATTGAGCPCR程序
在PCR片段从凝胶中纯化后，将此序列亚克隆到pCRBlunt-II-TOPO载体(INVITROGEN，Karlsruhe，德国)中，并且转化到TOP10大肠杆菌细胞中。通过蓝白筛选选择出包含构建体的菌落。从这些菌落中接种微量培养物以分离质粒DNA。每种片段用三个克隆进行了测序(DNA Laboratory，BASF AG，Ludwigshafen，德国)。克隆显示为100％匹配序列，并且将片段用EcoRI从TOPO载体上切下并用凝胶电泳分离。将片段从凝胶中纯化出来并且连接到用EcoRI切开的载体pCambia中。
实施例9大麦细胞的瞬时转化、真菌病原体发育的过表达和评估用HvBgt1-DNA与GFP表达载体一起转化大麦cv Pallas的叶节。之后用Bgh接种叶子并且依靠光学显微术和荧光显微术在48小时后分析结果。GFP表达细胞的侵入依靠检测活细胞中的吸器和通过评估在这些相同的细胞中真菌的发育来估计。在所有6个实验中，与用外源对照DNA(人甲状腺激素受体，TR)轰击的细胞相比，用HvBgt1轰击大麦cv Pallas使得Bgh成功侵入的细胞量减少。
对于大麦细胞的瞬时转化，使用了已经描述的关于在大麦叶的表皮细胞中生物射弹插入DNA的方法(Schweizer P等人(1999)Mol PlantMicrobe Interact 12647-54)。用HvBgt1-DNA和作为转化标记的载体pGFP的质粒DNA(GFP被pUBI启动子调控)一起来包被直径为1.1μm的钨颗粒(颗粒密度25mg/ml)。每次喷射使用下列量的DNA或报道基因质粒用于包被1μgpGFP和2μg DNA。
对于微载体的制备，55mg的钨颗粒(M17，直径1.1μm；Bio-Rad，Munich，德国)用1ml高压灭菌的蒸馏水洗涤两次并用1ml无水乙醇洗涤一次，干燥并且重悬浮在1ml 50％的甘油中(大约50mg/ml的贮存液)。将此溶液用50％的甘油稀释到25mg/ml，使用前充分混合并且悬浮在超声浴中。对于微载体的包被，将(每次喷射)1μg质粒，2μgHvBgt1 DNA(1μL)，12.5μl钨颗粒悬液(25mg/ml)，12.5μl 1M Ca(NO3)2溶液(pH 10)滴加到一起，同时持续搅拌，允许室温下放置10分钟，迅速离心并且从上清中移出20μl。包含钨颗粒的剩余物重悬浮在超声浴中并且在实验中使用。
对于转化，使用长度约4cm的大麦初生叶节。将组织放在培养皿(6.5直径)中的0.5％phytagar(GibcoBRLTMLife TechnologiesTM，Karlsruhe，Germany)和20μg/ml的苯并咪唑上，并且在颗粒轰击前在边缘用具有尺寸为2.2cm×2.3cm的矩形剪切块的模板直接覆盖。将培养皿一个接一个放在真空室的底部(chweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact12647-54)，穿过真空泵在穿孔板上(底部上面5cm，巨载体下11cm，见下)插入作为扩散器(diffusor)的尼龙网眼(网眼宽度0.2mm，Millipore，Eschborn)以分散任何的颗粒团并且减缓颗粒流。粘贴在顶部的巨载体(塑料无菌滤器附件，13mm，Gelman Sciences，Swinney，英国)用每次喷射5.8μl的DNA包被的钨颗粒(微载体，见下)装填。通过膜真空泵(Vacuubrand，Wertheim，德国)将室中的压力减少至0.9巴，并且用9巴的氦气压将钨颗粒喷射到植物组织的表面。之后立即向室中通风。对于转化细胞的标记，用质粒pGFP(基于pUC18的载体，具有插入的GFP基因的CaMV 35S启动子/终止子盒；Schweizer P等人(1999)Mol Plant MicrobeInteract 12647-54；Dr.P.Schweizer(Institute for Plant Genetics(IPK)，Gatersleben，德国)提供)喷射叶子。在每次喷射另一质粒前，用水彻底清洗巨载体。轰击后，在培养皿轻微开启、室温和日光照射下培育4小时的时间后，用100个分生孢子/mm2的白粉病真菌(大麦禾布氏白粉菌，品种A6)接种叶子，并且在进行感染迹象分析前在同样的条件下培育额外的36到48小时。
用荧光显微术和光学显微术测定结果(例如侵入效率，定义为显示出成熟吸器和二级延伸菌丝的被攻击细胞的百分比)。用100个分生孢子/mm2接种导致转化的细胞大约为50％的感染频率。对于每个单独实验，要估计最少100个相互作用区域。当用蓝光刺激时鉴定转化(GFP表达)的细胞。鉴定了三类不同的转化细胞1.包含大麦可识别吸器的被侵入的细胞。具有多于一个吸器的细胞按一个细胞评估。
2.已经被真菌附着器攻击却不含吸器的细胞。被Bgh重复攻击但是不含吸器的细胞按一个细胞评估。
3.未被Bgh攻击的细胞。
本评估排除了气孔细胞和气孔次级细胞。依靠光学显微术，或用0.1％的calcofluor(w/v在水中)将真菌荧光染色30秒来分析Bgh的表面结构。在用calcofluor染色后，依靠荧光显微术可以容易地评估真菌的发育。尽管在HvBGt1-DNA转化的细胞中真菌发育了初级和附着芽管，但是它没有发育吸器。吸器发育是次级菌丝形成的先决条件。
相对侵入效率(RPE)计算为用HvBgt1转化的细胞中侵入效率和用对照DNA转化的细胞中的侵入效率之间的比。百分比RPE(％-RPE)计算为RPE减去1并乘以100。
％-RPE＝100×(RPE-1)％-RPE值(与对照的平均侵入效率的偏差)用来测定用HvBgt1 DNA转染的细胞的易感性。
在5个独立的实验中，关于Bgh侵入效率，在用对照DNA转染和水转染之间没有观察到差异。
为了排除HvBgt1 DNA影响感染细胞的转化率和生存率的可能性，对比了对照实验和HvBgt1 DNA实验间GFP表达细胞的数量。有趣的是，HvBgt1的过表达对总数目或受感染的GFP表达细胞的数目没有影响。
实施例10用HvBgt1对拟南芥的转化，以及真菌抗性分析在Bechtold等人的真空渗入法(Bechtold N等人(1993)CR Acad SciParis，Life Sciences 3161194-1199)的改良方法(Steve Clough和AndrewBent(1998)Plant J 16(6)735-743)的基础上，用根瘤土壤杆菌菌株(EHA105)转化野生型的拟南芥植物(Columbia)。使用适用于根瘤土壤杆菌转化的二元表达载体如pCambia。
土壤杆菌转化的初级转化体的种子根据卡那霉素抗性进行筛选。将抗生素抗性的幼苗种植在土壤中，并且用作完全发育的植物用于生物化学分析。
为了分析转基因拟南芥植物对病原体真菌的抗性，用活体营养的真菌寄生霜霉和二孢白粉菌进行接种。
a)寄生霜霉用分生孢子孢子悬液(大约106个孢子/ml)喷雾5到8周龄的植物。将接种的植物用塑料袋覆盖并且在大约16℃下冰箱中保持黑暗和潮湿过夜。第二天，轻轻打开塑料袋，并且随后完全移除。接种6天后，再次用塑料袋覆盖过夜，这能诱导孢子形成。在第二天，检测叶子分生孢子梗的出现。在后面的几天中，真菌的细胞间生长导致在叶子中引起较轻的缺绿症直到强坏死。将这些症状定量并且测试了显著性。
b)二孢白粉菌在拟南芥植物上培养活体营养的霉真菌。对于4周龄的表述转基因HvBgt1的拟南芥植物的感染，用细小的刷子将分生孢子载体从叶子表面除去，并且刷到转基因植物的叶子上。植物在20℃下培育7天。接种7天后，分生孢子载体在叶子上可见，并且在随后的几天后出现缺绿症和坏死。将这些症状定量并且测试显著性。
c)结果相比非转基因野生型植物，表达HvBgt有义序列的转基因拟南芥植物在大多数情况下表现出对寄生霜霉和对二孢白粉菌显著增加的抗性。
相比非转基因野生型植物，表达AtBgt1或HvBgt1反义序列的转基因拟南芥植物表现出对寄生霜霉和对二孢白粉菌显著增加的易感性。
1在非宿主相互作用(大麦(Ingrid)和Bgt)和宿主相互作用(大麦(Ingrid)和Bgh)中HvBgt1表达的时间进程的说明。
在表5中所示的相对表达数据用相关的标准差说明。结果显示了在分析过程中非宿主相互作用中转录物的增加。
序列表<110>巴斯福植物科学有限公司<120>通过表达过氧化物酶在转基因植物中增加病原体抗性的方法<130>B 7661<160>12<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>945<212>DNA<213>大麦(Hordeum vulgare)<400>1atggcctcta cttcgtccct atcagtggtg ttgctcttgt gcctggccgt ggcggcgtcg 60gcgcagctgt cgccgacgtt ctaccaaacg acgtgcccga acgctctgtc caccatcaag 120gccgccgtga cggccgccgt gaacaatgag aaccgcatgg gcgcgtcgct gctccggctg 180cacttccacg actgcttcgt ccaaggttgt gacgcgtctg ttctgctgtc tggcatggaa 240caaaacgcgg cgccgaacgt catgtccctg cgaggcttcg aagtcataga cagcatcaag 300gcgaagctcg agaccatgtg caagcagacc gtctcctgcg ccgacatcct caccgtcgct 360gcccgcgatt ccgtcgtcgc cttgggaggg ccatcgtgga cggttccgct aggaaggagg 420gactccacca atgcaaacga agcagcggcg aactccgacc tacctccccc gttcttcgac 480ctcgtcaacc tcacccaatc cttcggcgac aagggcttca ccgtcaccga catggtcgcg 540ctctccggtg cccacaccat cggacaggcg cagtgccaga acttcaggga taggctctac 600aacgagacta acatcaactc cggcttcgcg acgtcgctca aggccaactg cccccggccg 660accggctccg gcgaccgcaa cctggccaat ctggacgtgt ctaccccgta ctcattcgac 720
aacgcctact acagcaacct caagtcccag aaggggctcc tgcactctga ccaggtgctc 780ttcaccggca cgggcggcgg cacggacaac atcgtcaaca acttcgcgag caacccagct 840gcgttcagcg gcgcctttgc ctcggccatg gtgaagatgg ggaacctcag cccattgact 900ggctctcagg ggcaggtcag gctgagctgc tccaaggtga attaa 945<210>2<211>314<212>PRT<213>大麦<400>2Met Ala Ser Thr Ser Ser Leu Ser Val Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala1 5 10 15Val Ala Ala Ser Ala Gln Leu Ser Pro Thr Phe Tyr Gln Thr Thr Cys20 25 30Pro Asn Ala Leu Ser Thr Ile Lys Ala Ala Val Thr Ala Ala Val Asn35 40 45Asn Glu Asn Arg Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp50 55 60Cys Phe Val Gln Gly Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Ser Gly Met Glu65 70 75 80Gln Asn Ala Ala Pro Asn Val Met Ser Leu Arg Gly Phe Glu Val Ile85 90 95Asp Ser Ile Lys Ala Lys Leu Glu Thr Met Cys Lys Gln Thr Val Ser100 105 110
Cys Ala Asp IIe Leu Thr Val Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu115 120 125Gly Gly Pro Ser Trp Thr Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Thr Asn130 135 140Ala Asn Glu Ala Ala Ala Asn Ser Asp Leu Pro Pro Pro Phe Phe Asp145 150 155 160Leu Val Asn Leu Thr Gln Ser Phe Gly Asp Lys Gly Phe Thr Val Thr165 170 175Asp Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Ala Gln Cys180 185 190Gln Asn Phe Arg Asp Arg Leu Tyr Asn Glu Thr Asn Ile Asn Ser Gly195 200 205Phe Ala Thr Ser Leu Lys Ala Asn Cys Pro Arg Pro Thr Gly Ser Gly210 215 220Asp Arg Asn Leu Ala Asn Leu Asp Val Ser Thr Pro Tyr Ser Phe Asp225 230 235 240Asn Ala Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Ser Gln Lys Gly Leu Leu His Ser245 250 255Asp Gln Val Leu Phe Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Asp Asn Ile Val260 265 270Asn Asn Phe Ala Ser Asn Pro Ala Ala Phe Ser Gly Ala Phe Ala Ser275 280 285
Ala Met Val Lys Met Gly Asn Leu Ser Pro Leu Thr Gly Ser Gln Gly290 295 300Gln Val Arg Leu Ser Cys Ser Lys Val Asn305 310<210>3<211>951<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3atgttaaagg tggtgttgtt gatgatgata atgatgttgg cgtcacagtc cgaggctcag 60ctgaaccgtg acttttacaa ggaaagctgt ccatcattgt tccttgtcgt gagacgagtc120gtgaaacggg ccgtggccag agagcctcgc atgggtgctt ctctccttcg tttgttcttc180catgattgtt ttgtcaatgg gtgtgacgga tccttactgt tggatgacac accgtctttt240ttgggagaga aaacctcagg acccagcaat aactctgtga gggggttcga agtgatcgac300aaaatcaagt ttaaggttga gaaaatgtgc ccgggcatcg tctcatgcgc agacattcta360gccatcactg ctcgggactc cgttctcctc ctaggtggac cggggtggag cgtgaaactt420ggaagaagag actctacgac ggcgaacttc gcggccgcga actccggagt catccctcct480ccgatcacta cccttagcaa cctcataaac cgtttcaaag cacaaggttt gtccacacgt540gacatggtcg ccctctctgg tgctcacacc attggacgag cccaatgtgt tacattcaga600aaccgaatct acaacgcaag caatatcgac acctctttcg ccatctctaa acggaggaac660tgtcctgcca ccagtggctc cggagacaac aagaaagcca atcttgacgt ccgctctccc720gataggttcg accacggctt ctacaagcaa cttctgagca aaaaaggttt gcttacgtca780gaccaagtcc tctttaataa tggtcctacc gactcgctcg tcatagctta cagccacaat840ctcaatgcct tctaccgcga ctttgcaagg gcaatgatta agatgggaga catcagcccc900
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Ser Thr Thr Ala Asn Phe Ala Ala Ala Asn Ser Gly Val Ile Pro Pro145 150 155 160Pro Ile Thr Thr Leu Ser Asn Leu Ile Asn Arg Phe Lys Ala Gln Gly165 170 175Leu Ser Thr Arg Asp Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly180 185 190Arg Ala Gln Cys Val Thr Phe Arg Asn Arg Ile Tyr Asn Ala Ser Asn195 200 205Ile Asp Thr Ser Phe Ala Ile Ser Lys Arg Arg Asn Cys Pro Ala Thr210 215 220Ser Gly Ser Gly Asp Asn Lys Lys Ala Asn Leu Asp Val Arg Ser Pro225 230 235 240Asp Arg Phe Asp His Gly Phe Tyr Lys Gln Leu Leu Ser Lys Lys Gly245 250 255Leu Leu Thr Ser Asp Gln Val Leu Phe Asn Asn Gly Pro Thr Asp Ser260 265 270Leu Val Ile Ala Tyr Ser His Asn Leu Asn Ala Phe Tyr Arg Asp Phe275 280 285Ala Arg Ala Met Ile Lys Met Gly AspIle Ser Pro Leu Thr Gly Ser290 295300Asn Gly Gln Ile Arg Gln Asn Cys Arg Arg Pro Asn305 310 315
<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5agaagtatgt taaaggtggt gttgttg27<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6tgacgaagag gtgattattg agc23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7cgaggccctt gtgacataca t 21<210>8<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8acttaggtgt cgttacttgg accat 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9cgtccctgcc ctttgtacac20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10aacacttcac cggaccattc a 21<210>11<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gcttattcag cagccaacaa agtaac 26<210>12<211>28
<212>DNA<2l3>人工的<220>
<223>引物<400>12ctgtttcaca agtttatggt ccaagtaa28
权利要求
1.产生分别具有增加的病原体抗性的转基因植物和植物细胞的方法，其特征在于将选自由i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或这些序列的片段编码的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含编码具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中给出的氨基酸序列或其片段的蛋白质的核苷酸序列，iii)与在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所给出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在严格条件下与i)到iii)的核苷酸序列的互补链杂交，构成的组并且编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的DNA序列插入到植物或植物细胞中并且在其中表达。
2.分离的核酸分子，其含有选自由下列DNA序列构成的组的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列的片段编码的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含编码具有在SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列的蛋白质或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)包含核苷酸序列的DNA序列，所述的核苷酸序列与在SEQ IDNo.1中所给出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在严格条件下与i)到iii)的核苷酸序列的互补链杂交。
3.根据权利要求2的核酸分子，其中所述核酸序列来自大麦。
4.重组过氧化物酶蛋白质，其由在权利要求1中给出的核酸序列编码。
5.在5’-3’方向上包含下列元件的重组核酸分子-在植物细胞中有活性的启动子的调节序列，-有效连接到其上的权利要求1给出的DNA序列，-任选地，有效连接到其上的在植物细胞中作为转录、终止、和/或加A信号的调节序列。
6.根据权利要求5的重组核酸分子，其特征在于DNA序列在组成型启动子，优选在35S CaMV或泛蛋白启动子的控制下表达。
7.根据权利要求5的重组核酸分子，其特征在于DNA序列在组织特异性启动子的控制下表达。
8.根据权利要求7的重组核酸分子，其特征在于组织特异性启动子是表皮特异性启动子、叶肉特异性启动子或叶特异性启动子。
9.根据权利要求5的重组核酸分子，其特征在于DNA序列在诱导型启动子的控制下表达。
10.根据权利要求9的重组核酸分子，其特征在于诱导型启动子是病原体诱导型启动子或创伤诱导型启动子。
11.根据权利要求1的产生具有增加的病原体抗性的转基因植物的方法，其特征在于该方法包括下列步骤a)产生根据权利要求5到10的任意一项的重组核酸分子，b)将步骤a)的重组核酸分子转移到植物细胞中，并且任选地整合到植物基因组中，以及c)从转化的植物细胞中再生植物。
12.转基因植物细胞，其含有在权利要求1中所描述的核酸序列，或根据权利要求5到10的任意一项的重组核酸分子或通过根据权利要求1或11的方法得到。
13.根据权利要求12的转基因植物细胞，它比野生型细胞具有增加含量的根据权利要求4的蛋白质。
14.根据权利要求12或13的转基因植物细胞，它比野生型细胞具有增加的病原体抗性。
15.根据权利要求14的转基因植物细胞，它对霉、锈菌和/或壳针孢真菌具有增加的抗性。
16.根据权利要求15的转基因植物细胞，它对霉的专化型具有增加的抗性。
17.转基因植物，其含有根据权利要求12到16的任意一项的植物细胞或根据权利要求11产生、以及这些植物的部分、这些植物的转基因收获产物和转基因繁殖材料，如原生质体、植物细胞、愈伤组织、种子、块茎、插条以及此植物的转基因后代。
18.根据权利要求17的转基因植物，其特征在于转基因植物是单子叶植物，优选地属于下列属燕麦、小麦、黑麦、大麦、稻、黍属、狼尾草、狗尾草、高粱、玉米等的植物。
19.根据权利要求17的转基因植物，其特征在于转基因植物是双子叶植物，优选地是棉花、豆科植物如豆类并且特别是苜蓿、大豆、油菜、芸苔、番茄、甜菜、马铃薯、观赏植物、向日葵、烟草及树。
20.在权利要求1中给出的DNA序列用于产生具有增加的病原体抗性的转基因植物和植物细胞的用途。
21.权利要求1中给出的DNA序列用于鉴定对病原体表现出非宿主抗性的植物的用途。
22权利要求1中给出的DNA序列用作谷类中非宿主抗性标记的用途。
全文摘要
本发明涉及产生具有增加的病原体抗性的转基因植物和/或植物细胞的方法，其特征在于将编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的DNA序列插入植物中并且在其中表达。本发明还涉及编码过氧化物酶的核酸在产生具有增加的病原体抗性的转基因植物或植物细胞中的用途。本发明还涉及来自大麦的编码过氧化物酶的核酸序列。
文档编号A01H5/02GK1973045SQ200580020556
公开日2007年5月30日 申请日期2005年6月14日 优先权日2004年6月24日
发明者M·弗兰克, R－M·史密特, S·施托伊德 申请人:巴斯福植物科学有限公司