专利名称：作为芥酸生物反应器的转基因油菜的生产方法
技术领域：
本发明涉及植物育种，特别是利用基因工程技术改变油菜籽粒脂肪酸合成途径，以利用油菜作为芥酸的生物反应器。
背景技术：
除食用外，世界上生产的植物油近三分之一用于非食用制品。从油料植物种子中分离和提取各种油脂化合物非常简便，避免了对环境有害物质的产生[1，2]。
芥酸是重要的化工原料。油菜种子含有约40％(w/w)的油脂，是所有油料作物中油脂含量最高的[3]，其中芥酸含量的理论最高值占油脂的66.6％(w/w)。以油菜作为芥酸的生物反应器，培育高芥酸特种工业用油菜品种，不仅为农业生产开辟了一个崭新的领域，也为工业生产提供了廉价、可再生的原料。目前美国、加拿大、德国等主要油菜生产国家都投入巨资，应用基因工程技术培育超高芥油菜[4]。现已取得的主要研究结果有1.筛选到了具有高芥酸含量的植物材料高芥品种油菜其籽粒的芥酸含量占所含油脂总量的50％左右，而生长在太平洋西北地区的一年生草本植物草地泡沫(Limnanthesa1b1)种子贮藏脂中C20脂肪酸和C22脂肪酸之和大于95％，在美国已开始进行该植物的培育、选种、种质评价和油的开发利用等方面的研究。此外，海甘兰(Crambe abyssinica，芥酸含量为油脂量的55～63％)、锻花(Lunaria annua，)、旱金莲(Tropaeolum majus，芥酸含量为油脂量的78％，是迄今为止发现的唯一芥酸含量高于66％的植物资源)等也很有研究价值[5]。目前海甘兰在中国的四川省已有小规模种植，并进行开发和研究[6]。
B、对芥酸生物合成途径及相关酶系、基因有了较为完整的了解在油菜种子的发育过程中，光合器官合成的碳源转运到种子细胞后，通过糖酵解途径经磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等前体，转化成乙酰辅酶A，进入脂肪酸合成途径。在质体中经乙酰Co-A羧化酶(ACCase)将乙酰Co-A合成为丙二酸单酰Co-A，在脂肪酸合成酶系复合体(FAS)作用下，经多次聚合，形成C181脂肪酸；碳链的延伸在酰基-ACP硫脂酶的作用下终止。C181脂肪酸从质体转运到内质网或胞质中，在酮酯酰Co-A合成酶(KCS，即延伸酶)的作用下，C181脂肪酸转化成C221脂肪酸，最后在内质网上通过三种不同的酰基转移酶，即甘油3-磷酸酰基转移酶(G3PAT)、溶磷脂酰基转移酶(LPAAT)和二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)，分别在甘油上附连脂肪酸以合成甘油三酯(TAG)[7， 8，9，10，11，12]。该“从头合成”途径的多个关键酶基因已被克隆，其中PEP基因参与籽粒蛋白质、油脂含量比率调控；LPAAT基因调控芥酸与3-磷酸甘油结合成TAG的能力；而KCS基因与油菜籽粒贮藏脂中芥酸含量有很直接的关系[13，14，15，16]。综上所述，可以认为，油菜籽粒中芥酸的高含量积累，主要依赖于如下几个方面的因素1、籽粒油脂的高含量积累；2、C181脂肪酸向芥酸的高效转化能力；3、合成的芥酸与3-磷酸甘油各位高效结合形成甘油三酯的能力。
C、探明了制约油菜芥酸含量的限制因素自然界的油菜，其芥酸的最高含量均在66％以下，这是由于十字花科植物中的溶磷脂酰基转移酶(LPAAT)对181脂肪酸具有很强的底物特异性，不能在3-磷酸甘油的sn-2位上插入芥酸，使油菜籽粒中芥酸含量占油脂量的理论最高值为66.6％[17]。必须在油菜中导入能在3-磷酸甘油sn-2位置上插入芥酸的LPAAT基因，才能使其芥酸含量极限值从66.6％提高至100％。这样的基因已在池花属植物草地泡沫(Limnanthes alba)和酵母中发现并被克隆，导入该基因的油菜转化植株其油脂sn-2位上的芥酸含量的确明显提高，最高可占芥酸总量的22.3％[18，19，20]。
虽然利用基因工程技术培育超高芥油菜的研究已有诸多报道，但获得的转基因油菜，其油脂中芥酸含量也都在60％以下。国外现有高芥酸油菜(HEAR)品种其油脂中芥酸含量一般在53％左右，油脂量则约为42％，均为常规育种方法选育而成。国内有关工业用高芥酸油菜的育种近年来已开始受到重视，并通过常规育种途径育成多个高芥酸油菜新品种，其油酯中芥酸含量为53～55％，但其籽粒油脂含量较低，一般在37％～40％之间。
综上所述，可以认为，油菜籽粒中的芥酸含量(％)＝籽粒油脂含量(％)×油脂中芥酸含量(％)。油菜籽粒中芥酸的高含量积累，主要依赖于以下几个方面的因素1)籽粒油脂的高含量积累；2)C181脂肪酸向芥酸的高效转化能力；3)合成的芥酸与3-磷酸甘油各位高效结合形成贮藏酯的能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在筛选的高芥酸油菜基因组中导入新的基因，并增强或抑制其原有基因的表达，获得一种油菜品系，以提高其油脂合成能力并使之特异地高效合成和积累芥酸，使其籽粒中能超量蓄积芥酸，使这种油菜成为芥酸的生物反应器。
本发明采用的技术方案其一是包括筛选高芥酸油菜品种，其特殊之处是采用步骤①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并将其构建成Anti-PEP基因植物表达载体，②运用基因转化技术将所述的Anti-PEP基因导入油菜基因组，获得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，并与植物表达载体中启动子正向连接，构建成LPAAT基因植物表达载体，④运用基因转化技术将所述的LPAAT基因导入油菜基因组，获得籽粒具有芥酸与3-磷酸甘油高效结合特性的“高芥酸”油菜，⑤将所述的“高油”油菜和“高芥酸”油菜杂交，产生具有“高油”+“高芥酸”的“双高”特性的F1代油菜植株。
本发明可以对所述的F1代植株进行筛选，以获得稳定表达LPAAT基因和Anti-PEP基因的油菜植株。
所述的制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成该基因，也可以是从低等生物克隆该基因。
所述的籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，是指经导入Anti-PEP基因，使油菜合成油脂/蛋白质过程中产生调控性，具有比原先更高效地合成油脂的特性所获得的油脂含量高的油菜。
所述的“高芥酸”油菜，是指经导入LPAAT基因，油菜合成的芥酸能与3-磷酸甘油sn-2位高效结合所获得的芥酸含量高的油菜。
所述的Anti-PEP基因导入油菜，此油菜优选的是人工筛选的籽粒油脂含量相对高的油菜，所述的LPAAT基因导入油菜，此油菜优选的是人工筛选的芥酸含量相对高的油菜。
本发明的技术方案其二是包括筛选高芥酸油菜品种，其特殊之处是采用步骤①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并将其构建成Anti-PEP基因植物表达载体，②制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，并与植物表达载体中启动子正向连接，构建成LPAAT基因植物表达载体，③将Anti-PEP基因、LPAAT基因转入同一高芥酸油菜基因组，获得其种子能超量合成和积累芥酸的双转基因油菜。
所述的制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成该基因，也可以是从低等生物克隆该基因。
所述的同一油菜，优选的是人工筛选的籽粒油脂和芥酸含量相对高的油菜。
具体地说，首先筛选出油脂含量相对高的油菜品种，在这种油菜中导入Anti-PEP基因，调控籽粒蛋白质/油脂含量比率，使更多糖酵解产物流入油脂合成途径，以提高油菜种子油脂含量，获得所述的“高油”油菜；筛选出芥酸含量相对高的油菜品种，以利用其高活性的KCS酶活性，使油菜籽粒能高效合成芥酸，在这种油菜菜中导入人工合成或从低等生物中克隆的能将芥酸连接到3-磷酸甘油sn-2位的LPAAT基因，使油菜籽粒中合成的芥酸能高效合成三芥酰甘油。Anti-PEP转基因高油油菜与LPAAT转基因高芥酸油菜杂交产生F1代油菜可同时表达anti-PEP基因与LPAAT基因，同时具有油脂高效合成能力、芥酸高效合成能力和将芥酸高效结合成三芥酰甘油的能力，因此能够超量蓄积芥酸。将Anti-PEP基因、LPAAT基因转入同一油菜基因组，获得双转基因油菜种子具有超量合成和积累芥酸的特性。
通过对油菜基因组进行的上述改造，可大幅度提高油菜种子中芥酸的含量，使之成为芥酸的生物反应器。
本发明所述的人工筛选的籽粒油脂含量相对高的油菜和芥酸含量相对高油菜可通过常规育种途径或转基因途径获得。
本发明所述的PEP基因或其片段包括全基因，3｀或5｀端非翻译区，内含子序列或编码序列。所述的基因或其片段可以用市售的DNA合成仪人工合成。或者从油菜基因文库筛选得到。或者采用PCR法扩增得到。优选的是套组PCR。PCR所用的引物是根据油菜PEP基因序列设计的。
本发明所述的LPAAT基因可为全基因。可从低等生物基因文库中筛选得到，或者是经PCR扩增出的DNA、DNA片段，或采用人工合成的方法获得。
本发明所述的构建anti-PEP基因植物表达载体和LPAAT基因植物表达载体包括从亚克隆中酶切出目的基因片段，电泳回收后与植物表达载体，例如pIG121或pBI121连接成转化质粒，然后转化大肠杆菌例如E.coliHB101感受态细胞，并进行抗性筛选。参见(Sambrook，T，TanaKa K，Monma T.Molecular CloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory après，New York，1989)。
本发明所述的转基因方法，可采用农杆菌介导法、基因枪法或花粉管引入法。其中，优选农杆菌介导法(参见，Sambrook T，TanaKaK，Monma T.Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory après，New York，1989)。经由农杆菌感染的油菜外植体(如无菌苗下胚轴)再生为正常植株(参见文献22)。
本发明用于作为anti-PEP基因、LPAAT基因转化受体亲本的芥酸含量相对高的油菜可以是同一品种或不同品种，也可是杂交油菜组合。
具体实施例方式
以下举例详细说明利用本发明的实施方案，但本发明不限于下面提供的应用，以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。
材料植物材料采用油脂和芥酸含量相对高的甘蓝型油菜(Brassicanapus)品种。
菌株和质粒E.coli HB101、E.coli JM109、根癌农杆菌A.Tumefaciens EHA101、质粒pBS SK+、pUC19、超级双元载体pIG121和pBI121。
酶和化学试剂限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4-DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自MBI公司，DNA分子量标记λDNA/HindIII、PCR Marker购自华美生物技术公司，PCR引物由Sangon生物技术公司合成，X-gal、IPTG、X-glue购自Sigma公司，随机引物标记试剂盒购自TaKaRa公司，γ-32PdCTP购自亚辉生物工程公司。
分子生物学技术除非另有说明，所有分子生物学技术一般按Sambrook T等在分子克隆实验手册(Sambrook T，TanaKa K，Monma T.MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratoryaprès，New York，1989)中提供的方法进行。
步骤与结果1.PEP基因片段的克隆根据Yanai等(Biosci Biotech Biochem，58(5)147-159)报道的油菜PEP基因序列，设计内外两组引物Primer PEP1(5’-引物)5’-GGAATCTAAAGTAAACCGGC-3’(20-mer)Primer PEP2(5’-引物)5’-CTCTCTGAATCCTTCTGTAG-3’(20-mer)
Primer PEP3(3’-引物)5’-AACCGACGGCCGTGACTGTA-3’(20-mer)。
PCR反应条件50μl的反应体系中，含10×PCR buffer5μl，25mmol/L Mg2+3μl，2mmol/L dNTP5μl，Primer5’-、Primer3’各2.5μl，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA50μg，94℃预变性10min后，94℃、30S，55℃、30S，72℃、30S，经30轮循环后，72℃延伸5min。
先用外侧引物(Primer1，Primer3)扩增到了约610bp的DNA片段，再以此为模板，用内侧引物(Primer2，Primer3)扩增到了一个530bp的DNA片段，与预期片段长度相符。扩增片段经T4DNA聚合酶补平3′端，用平端克隆法克隆至载体pBS SK+，用CaCl2法转化E.coli JM109株感受态细胞。转化子在含Amp、X-gal/IPTG的选择平板上37℃生长过夜，挑取白色阳性重组菌落。提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切，进行琼脂糖制备性电泳。挑选克隆片段长度正确的重组子，进行Sanger的末端终止法(MBI公司370测序仪)DNA测序。其中一重组子的外源DNA片段序列与报道的油菜PEP基因相应的序列完全一致，以此重组子pPEP8作为进一步工作之用。
2.Anti-PEP(反义PEP)基因植物表达载体的构建选择Xbal位点定向。在从pPEP8质粒中分离PEP基因片段时，先用内切酶EcoRI进行酶切，将酶切产物的5′粘性末端用T4-DNA聚合酶补平，再用XbaI酶切3′末端。用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段。同理，用内切酶SmaI切开超级双元载体pIG121产生平端，然后用XbaI酶切其3′末端。用T4DNA聚合酶将这两个片段连接。这样构建的重组质粒保证了PEP基因片段位于CaMV35S启动子下游、GUS报告基因下上游，并与35S启动子反向连接，得到重组质粒pPEPA5。
3.LPAAT基因的人工合成参照酵母LPAA(S)基因编码的氨基酸序列，根据草地泡沫LPAAT(M)芥酸结合位点序列特征，改变活性部位氨基酸，使产生的溶磷脂酸酰基转移酶在3一磷酸甘油sn-2位具有强的芥酸结合活性；选择油菜偏好密码子，设计并人工合成LPAAT基因，并在5′端和3′分别加上BamH I限制性酶切位点。将合成产物克隆到pUC19的BamH I位点，用CaCl2法转化E.coli JM109株感受态细胞。转化子在含Amp、X-gal/IPTG的LB选择平板上37℃生长过夜，挑取白色阳性重组菌落。小量提取质粒，经BamHI酶切，琼脂糖电泳验证。挑选克隆片段长度正确的重组子，采用Sanger的末端终止法用MBI公司370测序仪进行DNA测序。挑选外源DNA片段序列与预期的LPAAT基因序列完全一致的重组子作为进一步工作之用。
4.LPAAT基因植物表达载体的构建超级双元载体pBI121含有由35S启动子驱动的GUS基因及NOS启动子驱动的NPTII基因，在其35S启动子中加入种子特异性和发育调控元件SDRE，改造成种子特异表达载体质粒p189。质粒p189带有籽粒特异表达启动子ProSDRE，该质粒用Hind III+BamHI双酶切，酶切产物经0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳后回收含ProSDRE的DNA片段F189(长度为1.1kb)；质粒pLPAAT用BamHI酶切，0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收LPAAT基因片段FLPAAT(长度为～900bp)；FLPAAT用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)脱磷，F189、FLPAAT采用T4DNA连接酶连接，连接产物亚克隆到SK+载体；LPAAT-A基因5′端375位有一Bgl II酶切位点，小量提取各重组子质粒，用Hind III+Bgl II双酶切，获得1.4～1.5kb长度DNA片段的质粒为连接方向正确的重组子，选择该重组子(pLPAAT2)作为后继工作之用。
质粒pLPAAT2用Hind III+Sac I双酶切，酶切产物用0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收启动子ProSDRE与LPAAT基因的连接片段(2.1kb)。植物表达载体pIG121用Hind III+Sac I双酶切，切除载体原有的35S启动子+GUS基因部分，酶切产物用0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收21kb片段，回收产物用CIAP脱磷。脱磷后的载体与ProSDRE+LPAAT基因片段用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒。用以上重组质粒转化E.coli HB101感受态细胞，在含100μg/ml Km的LB平板上进行抗性筛选，阳性克隆用PCR法进行鉴定。分别在pLPAAT中籽粒特异表达启动子部分和LPAAT基因中选择部分序列来设计PCR引物。
Primer LPAAT 1(5’-引物)5’-CACCAACTCAACCCATCA-3’(18-mer)，Primer LPAAT 2(3’-引物)5’-GGGTCTATATACTACTCT-3’(18-mer)。
经PCR鉴定为正确的重组子(命名为pLPAAT)，即为LPAAT基因籽粒特异表达载体。用三亲交配法将pLPAAT导入根癌农杆菌EHA101，获得EHA101/pLPAAT，用作进行植物转化。
5.Antu-PEP、LPAAT基因导入油菜基因组①植物表达载体导入根癌农杆菌用碱法从大肠杆菌HB101/pPEPA5和HB101/pLPAAT中分别提取质粒pPEPA5和pLPAAT。
用电击法将pPEPA5导入根癌农杆菌EHA101，获得EHA101/pPEPA5，将pLPAAT导入根癌农杆菌EHA101，获得EHA101/pLPAAT，将pPEPA5和pLPAAT同时导入同一根癌农杆菌EHA101，获得EHA101/pPEPA5+pLPAAT；以上导入植物表达载体的农杆菌分别用作油菜转化。
②油菜的转化及植株再生载体pIG121带有由35S启动子驱动的GUS基因和潮霉素抗性基因及NOS启动子驱动的NPTII基因，因此转基因油菜植株可用潮霉素进行筛选，并可通过GUS基因的检测来判断外源基因的整合。超级双元载体pBI121含有由35S启动子驱动的GUS基因及NOS启动子驱动的NPTII基因，转化油菜植株可用潮霉素进行筛选，后代可通过PCR方法检测。以生长8天的油菜无菌苗下胚轴为转化外源基因的受体，用生长至对数期限的农杆菌EHA101/pPEPA5(或EHA101/pLPAAT或EHA101/pPEPA5+pLPAAT)感染外植体，共培养2天后，转至含500mg/L羧苄青霉素(Cb)的MS培养基上，一周后转到含500mg/LCb和10mg/L潮霉素(hgr)的MS分化培养基上进行抗性筛选。经3～4周的培养，下胚轴两端长出小愈伤，并逐渐产生绿色的抗性芽和白色的非抗性芽。待芽长至1cm高，转入含相同抗生素的生根培养基，2周后出根长成完整小植株。小植株经炼苗后，移栽入土中，植株可进一步生长，发育并产生种子。
6.转基因油菜的鉴定PCR方法可以快速地测定外源基因在转化再生植株中的整合。
Anti-PEP转基因植株的PCR扩增由于油菜本身带有内源PEP基因，因此，在用PCR方法检测anti-PEP转基因植株时，不能用PEP基因本身的序列来设计引物。本研究采用GUS报告基因的两端引物来进行PCR扩增。
Primer GUS1(5’-引物)5’-CGTAAGGGATGACGCACAAT-3’(20-mer)，Primer GUS2(3’-引物)5’-CGCAAGACCGGCAACAGG-3’(18-mer)。
提取再生植株总DNA，以此为模板，进行PCR。Anti-PEP转基因植株扩增出了与含Anti-PEP基因的重组质粒PEPA5扩增片段相同分子量的条带，而对照植株未扩增出相应条带。
LPAAT基因转基因植株的PCR扩增分别在pLPAAT中籽粒特异表达启动子部分和LPAAT基因中选择部分序列来设计PCR引物。
Primer LPAAT 1(5’-引物)5’-CACCAACTCAACCCATCA-3’(18-mer)，Primer LPAAT2(3’-引物)5’-GGGTCTATATACTACTCT-3’(18-mer)。
LPAAT转基因植株扩增出了与含LPAAT基因的重组质粒pLPAAT扩增片段相同分子量的条带，而对照植株未扩增出相应条带。
Anti-PEP基因、LPAAT基因双价双转植株的PCR检测由于质粒pLPAAT中不带有GUS基因，对GUS引物和LPAAT引物PCR扩增均为阳性的植株同时具有Anti-PEP基因和LPAAT基因。
7.Anti-PEP转基因油菜×LPAAT转基因油菜杂交法以Anti-PEP转基因油菜和LPAAT转基因油菜分别为父母本，进行杂交制种。
制种技术①掌握父母本的行比母本适当密植，促使开花集中，并抑制后期再发可育分枝。父母本行比均以2∶3较为适宜。父本行株距33cm×33cm，母本行株距26-33×13-17cm，父母本间行距40cm。
②适当调整播种期，促使父母本花期相遇。
③对母本进行辅助授粉，提高制种量花期采取推株并垄，使父母本花序接近。在上午10-12时，拨动父本花序使花粉散落于母本花序上。可起到辅助授粉、提高结实率的作用。
④成熟时在母本行收F1代杂交种子。
双价双转油菜的筛选收获的F1代种子播种后，用PCR方法对F1代植株进行筛选，对GUS引物和LPAAT引物PCR扩增均为阳性的植株为Anti-PEP×LPAAT双价双转油菜。
8.LPAAT-A/anti-PEP基因双转法将采用上述步骤与结果中1.-4.所述方法构建的pPEPA5和p LPAAT用电击法导入同一根癌农杆菌EHA101，采用5.-②所述方法，用带有pPEPA5和pLPAAT两个双元载体的根癌农杆菌转化高芥酸油菜，并采用6.所述方法进行PCR检测对GUS引物和LPAAT引物PCR扩增均为阳性的植株同时具有Anti-PEP基因和LPAAT基因，为LPAAT-A/anti-PEP基因双价双转油菜。
9.转基因油菜种子油脂、芥酸含量的测定种子含油量测定 采用改良索氏法测定。
种子芥酸含量测定 按GB10219，采用气相色谱法测定。
表1.Anti-PEP转基因油菜含油量株系含油量(％干重) 含油量提高值(％)对照141.7超油2-1 52.826.6超油2-2 51.824.2超油2-3 51.523.5超油2-4 51.122.5表2.LPAAT转基因油菜芥酸含量株系芥酸含量(W/W) 芥酸提高值(％)对照245.48超芥1-1 53.9418.6超芥1-2 52.1114.6超芥1-3 51.6013.5超芥1-4 50.9612.0
以上以举例方式详细描述了本发明的实施过程，但对本领域熟练技术人员来说，显而易见的是，在实施过程中可进行许多等效的修改和替换。因此，本发明的范围仅以权利要求书的限定为准。
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22.陈锦清等.1999，反义PEP基因调控油菜籽粒油脂蛋白质含量比率的研究.农业生物技术学报，7(4)316-320.
权利要求
1.作为芥酸生物反应器的转基因油菜的生产方法，其特征是采用步骤①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并将其构建成Anti-PEP基因植物表达载体，②运用基因转化技术将所述的Anti-PEP基因导入油菜基因组，获得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，并与植物表达载体中启动子正向连接，构建成LPAAT基因植物表达载体，④运用基因转化技术将所述的LPAAT基因导入油菜基因组，获得籽粒具有芥酸与3-磷酸甘油高效结合特性的“高芥酸”油菜，⑤将所述的“高油”油菜和“高芥酸”油菜杂交，产生具有“高油”+“高芥酸”的“双高”特性的F1代油菜植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是对所述的F1代植株进行筛选，获得稳定表达LPAAT基因、Anti-PEP基因的油菜植株。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，是指人工合成该基因或从低等生物克隆该基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是供Anti-PEP基因导入的油菜是人工筛选的籽粒油脂合成量相对高的油菜，供LPAAT基因导入的油菜是人工筛的籽粒芥酸含量相对高的油菜。
5.作为芥酸生物反应器的转基因油菜的生产方法，其特征是采用步骤①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并将其构建成Anti-PEP基因植物表达载体，②制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，并与植物表达载体中启动子正向连接，构建成LPAAT基因植物表达载体，③将Anti-PEP基因、LPAAT基因转入同一油菜基因组，获得籽粒具有“双高”特性的双转基因油菜。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述的制取能将芥酸高效连接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，是指人工合成该基因或从低等生物克隆该基因。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的同一油菜是人工筛选的籽粒油脂和芥酸含量相对高的油菜。
全文摘要
作为芥酸生物反应器的转基因油菜的生产方法，采用步骤①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEP片段，将其构建成Anti－PEP基因植物表达载体，②运用基因转化技术将Anti－PEP基因导入油菜基因组，获得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能将芥酸高效连接到3－磷酸甘油sn－2位的溶磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，并与植物表达载体中启动子正向连接，构建LPAAT基因植物表达载体，④运用基因转化技术将LPAAT基因导入油菜基因组，获得籽粒具有芥酸与3－磷酸甘油高效结合特性的“高芥酸”油菜，⑤将“高油”油菜和“高芥酸”油菜杂交，产生具有“高油”+“高芥酸”特性的F
文档编号A01H1/02GK1436849SQ0210297
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月9日 优先权日2002年2月9日
发明者陈锦清, 黄锐之, 朗春秀, 刘智宏, 胡张华 申请人:浙江绿洲农业股份有限公司