专利名称：生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及转基因—克隆技术领域。
背景技术：
转基因动物研究是人类按着自已的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如遗传学家希望通过改变动物的遗传组成来观察其表型变化，生理学家希望通过特定基因的表达来研究该基因对机体生理状况的影响。与动物生产有关的转基因研究则希望通过转基因技术来赋予动物新的表型性状。该项研究在实验技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。
转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病毒感染发育早期的动物胚胎，精子载体法，ES细胞技术，PGCs技术，体细胞核移植技术，逆转录病毒载体感染MII期的卵母细胞，精子头与DNA合并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提高大大地促进了转基因动物研究由实验室向生产实践转化的进程。
其中最传统和最常用的方法是原核期胚胎的显微注射，该方法由美国人Gordon发明，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。即在显微操作仪下通过一毛细玻璃管将外源DNA注射进动物受精卵细胞的原核内，再将该受精卵细胞移植进受体细胞子宫内，在受精卵分裂时，外源DNA可能整合入宿主染色体组，待该受精卵发育成熟即可获得转基因动物。但是显微注射法获得的转基因家畜的效率极低，特别是牛，羊和猪等，往往低于1％，这将大大增加制作转基因家畜的成本。
随着体细胞克隆技术的发展，基因操作技术与克隆技术相结合是将成为转基因动物，特别是大家畜生产的主要方式。目前，取得的主要进展是转基因技术和靶位操作技术在克隆动物上的应用。首先，利用克隆进行转基因是指在核移植前，先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记基因的表现来筛选转基因的阳性细胞及其克隆，然后再移植。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊。利用胎儿成纤维细胞系，经过转染之后，再克隆。被转染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整编码区和β-BLG基因启动子，凝血因子IX能被高效表达，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率为100％。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。
由于动物转基因技术能按照人们的意愿改变动物的生产性状，得到人们所需要的产品，特别是一些蛋白药品及保健品，科学家们已经开始将动物转基因技术应用到实践当中，目前动物转基因技术主要有以下一些应用(1)、促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质，(2)、动物抗病育种，(3)建立诊断和治疗人类疾病的动物模型，(4)生产药用蛋白。
动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23克/升，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前，牛乳白蛋白基因人组织血纤维蛋白溶酶原因子，人生长激素基因，人体抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干扰素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表达。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的革命，可能会给社会带来巨大的经济效益。
乳腺生物反应器生产药物的优越性让药物蛋白基因表达在某一特定部位，而不是随机地在身体任意表达。科学家们一致认为，就药物而言，理想的表达场所是乳腺。主要有以下原因1、动物乳腺是一个封闭的系统。乳腺组织表达的蛋白质绝大部分不会回到血液循环，这样就避免大量表达的外源性蛋白质对动物健康造成的危害。2、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250～300kg，一只绵羊和山羊可生产乳蛋白25～30kg，即使一只家兔，一年生产乳蛋白也可达到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成医用蛋白，其产量就十分可观。3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品的生物学活性接近天然产品。4、在动物乳腺表达的外源基因可以遗传。一旦获得一个生产某种有价值蛋白质的动物个体，可以用常规畜牧技术繁殖生产群体，研究技术虽然复杂，费用高昂，但其研究生产的放大过程却较容易5、缩短新药上市周期。从药物生产开发周期方面来看，目前一种新药从它的研制开发、药审，直到上市，整个过程需要10～15年，如果利用转基因动物乳腺反应器，新药生产的周期约5年。6、可以获取巨额经济利润。如荷兰金发马公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从乳汁中提炼出来营养奶粉销售额是50亿美元。
利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的功能，又有药用的功能，这种奶可以使孩子长得高大，促进大脑和神经发育，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。改善奶的营养成份或生理生化特征也是人们希望通过改变动物的遗传组成来实现的目标之一，即制造所谓的营养药品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工产品可提供人类30％的营养蛋白，含有丰富的必需氨基酸、钙和无机磷酸盐，以及消化率很高的酪蛋白，是人类高质量的营养来源；但乳用家畜奶在品质上还不尽如人意。因此，人们一直在研究如何改善奶品质。自Gordon创立动物转基因技术以来，世界各国都争先开展转基因育种及其相关技术研究。研究表明外源基因不仅能在转基因动物中得到整合与表达，而且能获得组织特异性(乳腺组织、输卵管)和发育特异性表达，并且现在能够利用分子技术找到调节乳成分的所有基因。
牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳为33g/L，而人乳仅为10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳铁蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。然而，牛乳中含有较高的各种酪蛋白，相应的乳清蛋白含量较少。蛋白牛乳中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是主要过敏原，新生儿大约7.5％有肠胃、皮肤和呼吸过敏反应，这有望通过转基因技术封闭、缺失β-乳球蛋白基因或在牛乳腺细胞中插入人乳蛋白基因来调节它的表达水平，从而使牛乳更加接近人乳，满足消费者需求。动物生物反应器是目前世界范围内转基因研究的热点之一，不仅各国政府投资，一些私人财团也不惜投入大量资金加以研究和开发。
人乳铁蛋白(Human lactoferrin，HLF)是一种属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白，由Sorensen首次发现，并由Blanc和Isliker命名。乳铁蛋白可以可逆性地结合两个铁离子，其离子结合强度是运铁蛋白(在体内对铁起运输作用的主要蛋白)的300倍。人乳铁蛋白由692个氨基酸组成，分子量约为80,000Da。在乳铁蛋白内有两个具有铁离子结合能力的叶状结构，一个是氨基端区，即N-叶(N-lobe)，另一个为羧基端区，即C-叶(C-lobe)。两区间有40％的同源氨基酸序列。每个区能结合一个铁离子，同时结合一个二价碳酸根阴离子。人乳铁蛋白为N端连接的糖基所修饰。经酶促反应，一个寡聚糖苷链以共价键结合在以Asn-Xaa-Thr/Ser顺序排列的天冬酰胺酸残基上。人乳铁蛋白有三个可能被糖基化的位点，分别位于C叶的第138的天冬酰胺酸残基、N叶的第479、624天冬酰胺酸残基上。在三个位点中，位于138、479的天冬酰胺酸残基优先被糖基化，第624的天冬酰胺酸残基的糖基化受第479位天冬酰胺酸残基糖基化的限制。乳铁蛋白广泛存在于哺乳动物的体液和嗜中性粒细胞的次级颗粒中，乳铁蛋白具有的生理功能主要包括广谱的抗菌功能、抗炎症功能和免疫生理调节功能。这些功能是通过乳铁蛋白直接获取铁离子或结合在细胞表面而使菌体细胞通透性增加实现的。乳铁蛋白可结合发生炎症区域的铁离子，从而阻止游离的铁离子参与催化有害的氧化反应。乳铁蛋白同时也能影响T细胞的扩增反应。一些研究表明，乳铁蛋白在体内的抗菌作用远比体外强。这可能是由于乳铁蛋白上存在着抑菌和潜在的免疫调节功能区。在体内，乳铁蛋白通过与体内的细胞结合而发挥抗菌和免疫调节作用。人乳铁蛋白的许多生理功能的发挥有赖于与特异性细胞受体的结合。现已发现人乳铁蛋白受体存在于多种细胞，如肠细胞，血小板，哺乳动物上皮细胞，淋巴细胞等。其它人乳铁蛋白潜在的功能还包括对骨髓细胞生成的调节，有氧代谢的产生，生长因子作用，DNA结合功能，以及潜在的RNA酶功能。但有些关于乳铁蛋白功能的研究结果是有争议的。它的某些生物学功能还不甚明了，尚有待于进一步的研究工作阐明。
乳铁蛋白具有着广泛的生物学活性其主要表现在(1)..对婴儿铁代谢的作用。一些实验说明乳铁蛋白能够促进婴儿的铁吸收，在恒河猴和人的实验中则发现乳铁蛋白对铁吸收没有明显的促进作用。(2).抗微生物作用。乳铁蛋白是人体内的一种广谱抗微生物蛋白，对病原性的细菌，真菌，原生动物，病毒均有杀伤作用。(3).在炎症反应中的作用。乳铁蛋白可以通过多种不同的途径来调节炎症反应。a.调节补体激活途径。乳铁蛋白可以阻断经典途径中的C3转换酶，使补体因子C3沉积，从而阻止补体介导的红细胞裂解。b.脱铁乳铁蛋白可以强烈地结合自由铁，从而限制了活性氧自由基的产生，并进一步抑制了活性氧自由基对细胞的损害，阻止细胞膜脂类的过氧化。c.乳铁蛋白可以快速动员多形核单核细胞迁移至炎症部位。d.乳铁蛋白可以影响多种细胞因子的产生，这些细胞因子在炎症反应中发挥着极重要的作用。体外实验表明，乳铁蛋白可以抑制脂多糖诱导的单核细胞产生IL-1，IL-6和TNF-α，IL-1的减少引起了GM-CSF的减少，进一步抑制了骨髓细胞的生成。此外，乳铁蛋白可以增强人多形核白细胞对IL-8的分泌。e.乳铁蛋白可以与脂多糖结合。其结合部位位于N端1-5和28-34两个空间位置邻近的区域。乳铁蛋白与脂多糖结合蛋白竞争结合脂多糖，因此降低了脂多糖结合蛋白介导的脂多糖与CD14的结合，起到调节炎症反应的作用。(4).其它作用。在患有帕金森氏综合症鼠的脑中，检测到乳铁蛋白的增强表达，说明乳铁蛋白在机体防御帕金森氏综合症中发挥一定的作用。此外在多自身免疫疾病病人身上检测了乳铁蛋白的抗体，如类风湿性关节炎、脉管炎、系统性狼疮、初级硬化脉管炎，说明乳铁蛋白在这些疾病的治疗和诊断中具有一定的作用。最近，有人还发现乳铁蛋白可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。
人乳铁蛋白的多功能属性引发了人们对其编码基因的研究，以便在此基础上对该蛋白进行大规模生产。M.J.Powell等人和M.W.Rey等人在1990年首次分别发表了人乳铁蛋白的cDNA序列和部分基因组序列。后来的研究表明，人乳铁蛋白位于人的第三号染色体q21-q23的位置，全长约35kb，共有17个外显子组成，内含子的大小在300bp-3.3kb之间。基于人乳铁蛋白基因的研究，许多研究者开始致力于人乳铁蛋白转基因的研究，以了解通过转基因的方式大量生产重组人乳铁蛋白的可能性及重组人乳铁蛋白的性质。人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是通过转基因技术生产大量功能上与人乳铁蛋白相同或相近的重组人乳铁蛋白，使之为人类造福。
过去人们曾以真菌、酵母菌、植物、动物细胞系、动物为宿主，进行了人乳铁蛋白转基因研究。下表概括了该方面研究的情况。
表1 人乳铁蛋白转基因研究的概况Table 1 The outline of the HLF transgenic studyTransgenic hLF Promoter rhLF ExpressingPublished year &
host sequence level authorFungi2.3kb300bp5μg/ml(total) 1992，Pauline P.
(Aspergillus cDNA A.nidulans alcA 1.5μg/ml(secreted)Ward，et alnidulans) promoter (ELISA analysis)1Fungi2.1kb1.1kb 2,000μg/ml(secreted) 1995，Pauline P.
(Aspergillus cDNA glucoamylase gene(ELISA analysis) Ward，et alawamori) promoterYeastFull length Yeast 20-30μg/ml(total)1993，Qianwa(Saccharomyces cDNA chelatin promoter 1.5-2.0μg/ml Liang，et alcerevisiae) (secreted)2Baby-hamster 2.3kb full MT-1 20μg/ml(secreted)1991，Stowellkidney cells length cDNA promoter (Determined by theK.M.，et alA280 of the pooled columnfractions)Tobacco cellsFull length CaMV 35s 0.6-2.5％ of the total1994，Amitava(Nicotiana tabacum cDNA promoter cellular protein Mitra，et alL.)Tobacco 2.1kb full DP35ScaMV(1)0.1％ of total 1998，ValériePlantlength cDNA promoter extracted leaf proteinsSalmon，et al.
(2)0.3％ of totalextracted leaf proteins3(ELISA)Potato plant 2.3kb full 1.Mas P2 (1)0.01％of total 2000，Daniel K.X.
length cDNA promoter soluble proteinet al2.CaMV 35s (2)0.1％of totalpromoter soluble protein4(ELISA analysis)Mice Full length 7.7kb0.1-36μg/ml 1994，Gerard
cDNAasl-casein (RIA analysis) J.Platenburg，et alpromoterMice Genomic 6.2kb＞1,000μg/ml1993，De Wit，sequenceasl-casein gene I.C.M，et alpromoterMice 1.hLF asl-casein 400-1,300μg/ml 1997，Jan H.
cDNAgene promoter300-3,800μg/ml Nuijens，et al.
2.hLF (RIA analysis)6genomicsequenceMice 2.5kb hLF 2kb bovine 1-200μg/ml&71994，1997，SuncDNAβ-casein gene (ELISA analysis) Jung Kim et alpromoterMice 27kb10kb bovine 60-6,600μg/ml8 1999，Sun Junggenomic β-casein gene (ELISA analysis) Kim，et alsequencepromoterCattle Genomic 6.2kb300-2,800μg/ml9 2002，Patrick H.C.
sequenceasl-casein gene (ELISA analysis) Van Berkelpromoter在过去的研究中，人乳铁蛋 cDNA曾广泛用于各类转基因研究中。这主要是因为人乳铁蛋白cDNA比基因组全序列基因更易获得，由于cDNA序列较短，也更易于被构建到表达载体中去。同时，cDNA可用于原核生物的表达，也使它较早地被用于转基因研究中。Qianwa Ling等1993年首次报道了重组人乳铁蛋白在酵母菌中表达的研究。在该研究中，人乳铁蛋白和酵母菌蔗糖酶信号序列区分别用于引导重组人乳铁蛋白的分泌。含酵母菌蔗糖酶信号序列的酵母菌有较高的重组人乳铁蛋白表达量，而含人乳铁蛋白信号序列的酵母菌则重组人乳铁蛋白的表达量很低。在真菌中，Aspergillus菌种在自然条件下分泌糖基化蛋白，这种属性使它成为一种理想的表达重组糖基化蛋白的宿主，现在它已经用于糖基化蛋白的商业化生产。已经有用人乳铁蛋白基因转化Aspergillus nidulans和Aspergillus awamori的报道。在此两项研究中，在宿主中高表达的基因的启动子用于引导重组人乳铁蛋白的表达。在Aspergillusawamori中，人乳铁蛋白cDNA和在Aspergillus awamori高效表达的葡糖糖化酶基因连接在一起，中间用KEX-2切割位点隔开。经过翻译，融合蛋白用KEX-2切割，形成单独的重组人乳铁蛋白。在此研究中，在表达重组人乳铁蛋白的转化子中引入突变，可获得较高的重组人乳铁蛋白的表达量(2,000μg/ml)。此表达量是迄今为止在酵母菌、真菌、细胞系的人乳铁蛋白转基因研究中重组人乳铁蛋白表达量最高的。这可能是因为采用了融合的方法进行转染并把Aspergillus awamori作为转基因宿主的缘故。根据以往研究的结果，转基因所用宿主、启动子和分泌信号区序列显著影响着重组人乳铁蛋白在酵母菌、真菌、细胞系中的表达水平。由于人乳铁蛋白抗菌的作用，影响了一些酵母菌和真菌的正常生长，在培养后达不到较高的浓度，它们的生长被分泌的重组人乳铁蛋白所抑制。这样，选择对重组人乳铁蛋白抑菌作用不敏感的细菌就显得很重要。当转基因寄主的自身基因的启动子和信号区序列用于转基因研究时，往往会得到较高的外分泌重组人乳铁蛋白的表达水平。到目前为止，还没有人乳铁蛋白全基因在真菌和细胞系内进行转基因研究的报道。在这方面还有进一步研究的余地。
1993年，Gerard J.Platenburg等首次报道了人乳铁蛋白基因转基因小鼠获得了成功。早期该领域的研究仅局限于人乳铁蛋白cDNA。后来的研究发现，携带有人乳铁蛋白基因组全序列的转基因小鼠分泌的重组人乳铁蛋白的量远高于携带有人乳铁蛋白cDNA的量。1997年Jan H.Nuijens等分别用人乳铁蛋白cDNA和人乳铁蛋白全基因组序列片段与ALPHAsl-casein基因启动子相连接构建成乳腺组织特异性表达载体。结果显示，cDNA转基因小鼠重组人乳铁蛋白的表达范围为400-1,300μg/ml，而在基因组全基因片段的转基因小鼠中为300-3,800μg/ml。在1999年Sun Jung Kim等进行的转基因实验中显示，在同时用Beta-casein作为启动子的情况下，含人乳铁蛋白基因全序列片段的转基因小鼠的泌乳量最高可达6,600μg/ml，而用cDNA得到的转基因小鼠的重组人乳铁蛋白的表达量不超过30μg/ml。在有些情况下，用cDNA作为转基因材料可得到较高的重组蛋白的表达量。如人体蛋白C的cDNA[51]，人IGF-1cDNA，和人EPO cDNA等。但在另外一些情况下，用cDNA转基因得不到高表达量。为此，有研究采用了模式附着元件(matrix attachment elements，MARs)，位点控制区域(locus control regions，LCRs)，或YAC克隆等克服位置效应，以获得高表达量的重组外源蛋白。以往的工作表明，有一些基因的内含子内存在着正向的或负向的调控元件，调控着基因的表达。人乳铁蛋白转基因的研究表明，在人乳铁蛋白基因内部存在着重要的调控元件，对人乳铁蛋白的表达发挥着正向的调控作用。现在尚需进一步的研究以调查人乳铁蛋白内含子内调控元件对表达起调控作用的机理。过去，对哺乳动物的人乳铁蛋白转基因的研究主要局限在小鼠上，对大家畜少有涉及。对牛、羊等大家畜进行人乳铁蛋白的转基因研究将是下一步的发展方向。
发明内容
本发明针对上述现有技术的空白，拟将基因工程技术，细胞转染技术与体细胞克隆技术相结合，采用含有完整人乳铁蛋白基因的长约150kb的BAC序列作为转基因结构，提供一种生产转有人乳铁蛋白基因的转基因克隆大型家畜的方法，用以大规模生产具有生物活性的重组人乳铁蛋白。
生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下(1)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体，(2)将hLF BACDNA与双标记选择载体或单标记选择载体按比例混合，导入动物体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞，(3)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因克隆动物。
所述特异性表达载体是长约150kb的hLF BAC DNA，重组人乳蛋白的转基因小鼠模型中表达的人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白大小一致，具有与天然人乳中乳铁蛋白相同的免疫活性。
所述转基因小鼠的人乳铁蛋白基因表达量为0.5-7.8g/l。
所述双标记选择载体是pEGFP-NEO，所述单标记选择载体是pNEO。
所述hLF BAC DNA与双标记选择载体或单标记选择载体混合的摩尔比为1∶3。
所述导入方法是体细胞显微共注射。
所述转基因细胞是通过G418进行筛选获得的阳性细胞。
所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。
所述大型家畜为牛。
本发明利用含有人乳铁蛋白基因的长约150kb的HLF BAC(包括约90kb的5’调控区，约30kb的编码区及30kb的3’调控区)作为转基因结构，通过受精卵原核胚显微注射法获得转有全长HLF BAC DNA的转基因小鼠，重组人乳铁蛋白在每只阳性母鼠乳腺重都检测到稳定表达，表达量为0.5-7.8g/l，表明利用完整的人乳铁蛋白基因表达系统可以在其它哺乳动物乳腺中获得高效特异的表达，也表明用长片断DNA可以减少位置效应对转基因表达的影响。
对于大片段DNA(100kb以上)的细胞转染国内外鲜有文献报道，本发明也尝试了很多方法，但由于目的基因太长，采用电击方法和其它细胞转染方法进行细胞转染难以获得阳性细胞。本发明将在小鼠乳腺中得到高效表达的HLF BAC DNA与双标记选择载体pEGFP-NEO或单标记选择载体pNEO按摩尔比例(1∶3)混合，进行细胞转染，通过显微共注射法导入动物体细胞基因组中，通过G418进行筛选获得阳性细胞。阳性细胞再单克隆培养及扩增，经PCR检测有150kb的HLF BAC NDA的转基因细胞才能进行体细胞克隆，获得转基因克隆牛。经PCR和Southern检测，共获得两头转有含全长人乳铁蛋白基因的HLF BAC的转基因克隆牛。根据转基因小鼠中重组人乳铁蛋白表达情况，可以推测这些转基因牛也将高效表达具有生物活性的人乳铁蛋白。这些转基因奶牛乳腺特异表达的重组人乳铁蛋白将可以开发成保健品和药品，含重组人乳铁蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。
利用乳腺特异表达的基因调控元件与目的基因构建成乳腺特异表达载体，将该载体导入动物基因组，从而获得能在乳腺特异高效表达外源药用蛋白的转基因动物即动物乳腺生物反应器。乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品的生物学活性接近天然产品，因此动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。这样，转基因克隆动物就成为了“制药工厂”，为医用蛋白和蛋白保健品的开发和生产开辟了广阔的应用前景。
本发明探索和完善了细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合生产携带完整长片断的外源功能基因的转基因动物的途径，并极大提高了转基因动物，特别是转基因大家畜的制作效率，本发明所使用的技术路线适于利用这种长片断DNA作为转基因结构进行转基因牛、山羊、绵羊、猪和兔的基础群生产和扩繁。
图1hLF转基因小鼠Southern杂交结果数字代表小鼠号，P代表阳性对照，N代表阴性对照。
图2减性缓冲液变性后hLF转基因小鼠乳清样SDS/PAGE胶电泳泳道5，6为hLF转基因阳性小鼠的乳清样，泳道7为人乳清样，泳道9为人乳铁蛋白标准样，泳道10为蛋白分子量标准物，其它泳道为非转基因小鼠乳清样。
图3减性缓冲液变性后hLF转基因小鼠乳样western杂交结果第l至7泳道为hLF转基因阳性小鼠的乳清样8泳道为人乳清样，作为阳性对照；9泳道为非转基因小鼠乳清样，作为阴性对照；第10泳道为蛋白分子量标准物。
图4双标记选择载体pEGFP-NEO的结构图EGFP为增强绿色荧光蛋白基因，NEO为新霉素抗性基因，IRES为核糖体结合位点，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，CMV-IE Enhancer为CMV-IE增强子，pEF321为EF321启动子。
图5单标记选择载体pNEO的结构图
NEO为新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，pPGK为PGK启动子，Amp为氨苄抗性基因。
图6hLF转基因克隆牛的PCR检测M100bp marker，A为hLF 5’引物，B为hLF引物，ChLF 3’引物.1为铁娃，2为祥娃，3为阳性对照，4为阴性对照，5为空白对照。
图7hLF转基因克隆牛的Southern结果。1铁娃；2祥娃；3阴性对照；4-6分别为1，5和10个拷贝的阳性对照。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1实验材料1.1质粒及菌株宿主菌大肠杆菌DH5α和DH10B，pIRES-NEO和pCMV-EGFP-IRES-NEO购自Clontech公司。
1.2实验动物Holstein奶牛约3月龄的胎儿取自屠宰场，黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。
1.3主要试剂DMEM/F12粉末、DMEM粉末培养基、台盼蓝(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418为Gibco公司产品胎牛血清为Hyclone公司产品；dNTP以及PCR引物购于上海生物工程公司；Taq酶购于中国农业大学农业生物技术实验室；内切酶SspI和BamHI为华美生物工程公司产品；IPTG、X-gal、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血蓝蛋白(KLH)均购自华美生物公司饱和酚为鼎国生物工程公司产品；胰蛋白酶、青霉素链霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明质酸酶，HEPES，无脂肪酸BSA，细胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸钠，肝素钠，矿物油和其它无机盐等均为Sigma公司产品。
1.4培养基的配制SOB培养基配置每升培养基，应在950ml去离子水加入蛋白胨20g酵母提取物5g NaCl 0.5g.摇动容器室溶质完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/LNaOH调节到pH7.0。灭菌。
LB液体培养基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，调节PH值至7.5，定容制1000ml，高压灭菌。
LB固体培养基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，调节pH值至7.5，定容至1000ml，高压灭菌。
1.5试剂的配制DMEM培养液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，链霉素100mg，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。使用时加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用灭菌的Mill-Q超纯水溶解，定容至100ml，用0.2μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。
DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.2，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。
无钙镁PBS溶液KCl0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4 12H2O 2.88g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。
Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油将Gimsa粉末在研钵中充分研磨。再加入甘油至总量为22ml，56℃保温2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色试剂瓶中，备用。
细胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K贮存液蛋白酶K100mg，溶于5mL灭菌水中，分装，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高压灭菌。
G418贮液1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，过滤灭菌，-20度保存。
两倍电击缓冲液(2×HeBS)280mMNacl、10mMKcl、1.5mMNa2HPO4、12mMGlucose、50mMHepes，PH7.0-7.4，过滤灭菌，1mL分装，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris碱溶于800ml水中，用HCl调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二钠加入到800ml水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
RNase溶液将RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
TE缓冲液10mMol/LNaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌。
5mol/L LiCl30.2g氯化锂二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高压灭菌。
50×TAE242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100m10.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。
氨苄青霉素(Amp)贮存液将氨苄青霉素钠溶于灭菌水后用0.22μm的滤器过滤除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g无水乙酸钠溶于80ml水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2.6H2O，过滤除菌，分装成10ml每份，贮存于-20℃，制备感受态时取出一份稀释至100ml，过滤除菌，预冷备用。
溴化乙锭贮存液在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。
DNA提取抽提缓冲液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等体积苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培养液称TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸钠0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超纯水定容，PH7.2-7.4，正压过滤灭菌，4℃保存。培养用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
冲卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明质酸酶透明质酸酶0.2g，溶于10ml无钙DPBS溶液中，过滤灭菌，-20℃贮存。
工作液用冲卵液稀释10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，调PH至7.2-7.4，过滤灭菌。
成熟培养液M199培养液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
CR1aa培养液成份终浓度(mM) 加入量g/100mlNaCl 114.7 0.67KCl 3.10.023NaHCO326.2 0.22Na Pyruvate 20.4 0.002Phenol Red1μl/ml100μl将上述成份加入90ml ddH2O中，待所有试剂彻底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。调整pH为7.4，用ddH2O加到100ml，渗透压为265-285mOsm之间。过滤灭菌。
1.6主要仪器设备1)CO2培养箱美国Forma Scientific Inc.
2)倒置显微镜和荧光显微镜日本Nikon公司3)培养皿、培养瓶、离心管和细胞冻存管Nunc公司4)电击仪美国BTX公司(ECM 2001)5)电泳仪DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂6)超净工作台北京净化设备厂7)-80℃超低温冰箱日本SANYO公司8)制冰机日本SANYO公司9)超纯水仪美国MILLIPORE公司10)低温离心机Eppendorf公司11)高速冷冻离心机BECKMAN公司12)凝胶成像系统ALPHA INNOTECH公司13)PHS-3C酸度计上海虹益仪器厂14)自动灭菌锅日本SANYO公司15)测序仪ABI 377型DNA sequencer，美国PERKIN ELMER公司16)恒温水浴仪美国LIFESCIENCE公司17)9700型PCR仪美国PERKIN ELMER公司18)ABI 377 DNA测序仪美国PERKIN ELMER公司1.7分析工具软件及网址同源性分析软件DNAMANPCR引物设计软件Oligo6.0DNA序列分析软件ChromasDNA及蛋白序列数据库NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2实验方法2.1 BAC DNA的准备及转基因小鼠模型的建立2.1.1 hLF基因BAC阳性菌株通过PCR从Genome Systems Inc的人BAC文库中筛选获得hLF基因BAC阳性菌株，所用PCR引物如表2。BAC的骨架载体为pBeloBAC11，其的长度为7.35kb。其上有两个NotI位点，用于连接外源片段。本实验中所用的hLF基因片段长度约为150kb。其中5’端侧翼序列长度约为90kb，3’端侧翼序列长度约为35kb。经酶切分析和测序表明，该BAC片段含有17个外显子在内的完整hLF编码基因。
2.1.2 BAC的大量提取及纯化BAC的大量提取参见《分子克隆实验指南》从细菌中大量提取细菌所述。BAC提取后经NotI酶切，酶切后的hLF基因片段脉冲电泳后电洗脱回收。
设计一对引物，扩增hLF基因3’端以对基因进行鉴定。引物序列如下HLF55’CCTGGGCAACAAAGCGAGAC 3’HLF65’GCTATGGCTCCTTCTCTACTG 3’PCR的退火温度分别为68℃。PCR产物的长度为1313bp。
2.1.3显微注射制备转基因小鼠回收的完整的hLF片段，经显微注射制备转基因小鼠2.1.4转基因小鼠PCR和Southern鉴定对于转人乳铁蛋白小鼠的PCR鉴定，我们在hLF基因编码区5’端和3’端分别设计了一对引物，引物序列及反应条件如表2；表2转人乳铁蛋白基因小鼠的PCR鉴定引物及反应条件引物名 引物序列 产物 退火温度长度BAC70FSL5’-TTGACTGGATCCCGTAGAGG-3’ 310bp 60℃BAC70FSR5’-TCAGTCCAGGGTAAGGAGGA-3’BAC70RSL5’-CACTAAACTCATCGCCACCA-3’ 303bp 60℃BAC70RSR5’-CACCTCTCCCTTTTCTTCCTG-3’PCR的检测表明，在经显微注射后得到的152只原代小鼠中，有11只PCR验测呈阳性，阳性率约为7％，其中4只为公鼠。
Southern检测取PCR检测为阳性的转基因克隆牛DNA约10μg用EcoRI消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P32dCTP同位素标记的2.5kb的hLF基因编码区片段。
结果如图12.1.5转基因小鼠奶样的Western分析对转基因小鼠的乳样用重蒸灭菌水稀释三倍，进行去乳脂、去酪蛋白的处理，最后得到乳清部分。乳铁蛋白即存在于乳清中。图2为上样量为2μl，用减性(reducing)SDS上样Buffer变性后的PAGE胶图。从图中可看到，第5，6泳道的转基因小鼠乳样和非转基因小鼠乳样之间存在着明显的差异。
hLF转基因小鼠乳样用减性(reducing)SDS上样Buffer变性的PAGE胶电泳后，进行转膜，然后进行Western杂交处理，得到如图3所示的结果。从图3中可得，转基因小鼠乳中的rhLF与对照的人乳中的乳铁蛋白具有一致的迁移率。经Western杂交检测，F0代14，19，20，44，74号鼠，F1代15，55号鼠，共七只母鼠呈阳性。
rhLF125I放射性免疫反应的结果表明，7只F0代和F1代的转基因小鼠rhLF的表达量在490mg/l至7.8g/l之间。F0代一只公鼠的女儿(55号)具有最高重组蛋白表达量。
2.2 pEGFP-NEO和pNEO选择载体构建为了便于筛选阳性细胞，我们首先构建了含绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因双选择标记载体(pEGFP-NEO)以及新霉素基因单选择标记载体(pNEO)。
1)pEGFP-NEO的构建用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片断EGFP-IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与EGFP-IRES-NEO连接即构成pEGFP-NEO，pEGFP-NEO如图4。
2)pNEO的构建用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片断IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与IRES-NEO连接即构成pNEO，pNEO如图5。
2.3细胞培养，基因转染及阳性细胞筛选2.3.1胎儿成纤维细胞的原代培养在超净工作台中将胎儿浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗几遍，以消毒过的手术器械取下耳部及脊背部的数块表皮组织于DMEM+10％FCS培养液里。
↓在直径60mm平皿中将胎儿组织切碎成为1mm3大小的组织碎块，再将组织碎块转移至15ml离心管中，1000rpm下离心洗涤数次。
↓用消毒玻璃弯头吸管将小组织碎块吸至25cm2培养瓶中，通过玻璃吸管弯头使组织块均匀分布在瓶壁上。
↓小心翻转培养瓶(防止组织块落下)让组织块黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO2培养箱中放置2～4h，待组织块贴壁后，再正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。
2.3.2胎儿成纤维细胞的传代、冷冻、及复苏待种植的原代细胞生长至80％汇合时，将细胞一部分冷冻，一部分传代继续培养。
2.3.2.1传代用消毒玻璃弯头吸管小心吸除培养瓶中的培养液，沿着细胞生长壁的对面瓶壁注入无钙镁PBS(37度温育)冲洗细胞两次，以祛除残余血清及细胞代谢物。
↓用同样方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量为可覆盖细胞单层即可(直径100mm培养皿一般加入1ml消化液，35mm培养皿中加入200u L消化液)，放入培养箱中消化1-2min。在显微镜下观察，待细胞开始变圆时，用手指敲打培养皿壁，使细胞彻底脱壁，然后加入培养液终止消化。
↓用消毒玻璃弯头吸管反复吹打，细胞，使其分散成为单个细胞，1000rpm下离心5min收集细胞。用培养液按1∶2或1∶3比例稀释并重新接种细胞至培养皿中培养。
2.3.2.2冷冻贴壁细胞消化后，收集细胞于离心管中，在1000rpm下离心5min以去尽上清。
↓
加4度预冷的冷冻液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重悬细胞沉淀，使细胞浓度约为107个细胞/ml，转移细胞至冻存管中。
↓放入4度冰箱预冷30min，再把冻存管插于厚泡沫上，然后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。
2.3.2.3复苏从液氮中取出冻存管，快速投入37度水浴中，并在水浴中不断快速摇动冻存管以迅速解冻。
↓待冷冻液彻底解冻后，以新鲜培养液稀释10倍并将溶解液转移至离心管中，在1000rpm下离心5min去除DMSO以缓减冷冻液毒性。
↓用新鲜的培养液悬浮细胞沉淀，将细胞稀释至所需浓度，继续培养。
2.3.3转染用DNA的准备hLf BAC的大量提取参见《分子克隆实验指南》从细菌中大量提取细菌所述。BAC提取后经NotI酶切，酶切后的hLF基因片段脉冲电泳后电洗脱回收，用将注射用TE将纯化的hLF基因片段溶解稀释至5ng/μl。同时提取双标选择载体pEGFP-NEO和单标选择载体pNEO，经NotI酶切后电洗脱回收，用将注射用TE将纯化的标记基因片段溶解稀释至1ng/μl。
2.3.4牛胎儿成纤维细胞对G418毒性敏感性检测细胞培养到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105个细胞接种到13个直径35mm培养皿中以使细胞尽量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入终浓度从100μg/ml到1200μg/ml的G418，还有一孔中不加入G418作为对照。连续培养三周，每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。
2.3.5目的基因与标记基因的显微共注射将洗净、灭菌后的盖玻片置于六孔板内，以传至3-6代的胎儿成纤维细胞接种培养，待细胞生长至60-80％时取出供细胞基因注射。
↓以注射用TE分别稀释hLF BAC和双标记选择载体质粒pEGFP-NEO DNA或单标记选择载体质粒pNEO DNA至5ng/μl和1ng/μl，然后再等体积混合，使hLF BAC和双标记选择载体的注射浓度分别为2.5ng/μl和0.5ng/μl。
↓将生长有胎儿成纤维细胞的盖玻片移至盛有操作液H199的直径100mm培养皿中，以吸有混合基因的注射针将基因注入细胞核，等细胞核膨胀后迅速拔出注射针。
↓基因注射后的细胞培养2天后，对细胞进行G418筛选、阳性细胞单克隆培养及扩增2.3.6阳性细胞的单克隆培养在荧光显微镜下观察上述方法所得细胞克隆的发光情况，用记号笔圈住分散良好(远离其它克隆)且细胞数量多的荧光克隆；吸除培养液，用无钙镁PBS漂洗细胞二次，在高倍解剖镜下，将30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在标记好的细胞克隆上，待克隆的大多数细胞收缩脱壁后，不等细胞悬浮，快速吸取细胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的细胞；转移细胞到加有500μl培养液的四孔板中，吹打分散细胞团块；挑出的克隆继续培养，降低G418浓度至300μg/ml维持筛选待克隆细胞数量扩大后或汇合后，将一部分细胞转移到35mm培养皿中继续扩大培养，另一部分用于转基因检测，其它扩大后的细胞尽早冷冻。
2.3.7转染细胞的PCR检测由于本实验采用的是150kb的150kb的HLF BAC DNA与pEGFP-NEO或pNEO的显微共注射方法，因此用G418筛选并不能保证阳性克隆点是转有150kb的HLF BAC DNA的转基因细胞，所以在进行体细胞克隆前必须对转基因细胞进行PCR鉴定。为了确保转入完整的150kb的HLF BAC DNA，我们在150kb的HLF BAC DNA的5’端和3’端，以及HLF编码区分别设计了一对引物进行PCR扩增。
2.3.7.1细胞基因组DNA的提取用胰蛋白酶/EDTA液消化收集细胞，并用PBS洗涤两次。
↓加入200μl细胞裂解液，终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，55度水浴消化过夜。
↓用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。
↓加入等体积无水乙醇和0.1倍体积乙酸钠沉淀DNA。
↓70％乙醇洗涤一次后，溶于TE中，-20度保存。
2.3.7.2 PCR反应引物序列如下表3转人乳铁蛋白克隆牛的PCR鉴定引物及反应条件
反应体系模板DNA，3μl；引物1μl；2.5mMdNTP，3μl；10×Tag酶Buffer，5μl；Tag酶，10U最后加ddH2O补足体系至50μl。
反应参数94℃ 5′；94℃ 40″→60℃ 40″→72℃ 1′； 25 cycles 72℃ 10′；4℃保存。
2.4转基因体细胞克隆2.4.1卵母细胞的成熟培养从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2～8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/ml bLH+1μg/ml estradiol)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培养箱中成熟培养18～20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2～3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体。
2.4.2卵母细胞的去核将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。
2.4.3移核与融合将血清饥饿2～4d的供体细胞用0.25％trypsin消化2～4min，选择直径为10～12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步激活处理。
2.4.4重构胚的激活与培养将重构胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养2d后观察分裂率，7d后观察囊胚发育率2.4.5胚胎移植与妊娠检测将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体母牛的子宫角内。受体母牛选择的都是经产母牛，其中红系冀南黄牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入鲁西黄牛，在移植后的第60d进行直肠检测，以确定妊娠率。
2.5转基因克隆的PCR和Southern鉴定2.5.1转基因克隆牛的PCR鉴定对于转人乳铁蛋白克隆牛的PCR鉴定，由于我们采用的转基因为150kb的hLF BAC，为了检测转基因的完整性，我们在hLF基因上游调控区5’端设计了一对引物，在其编码区设计了一对引物，在其下游调控区3’端也设计了一对引物，引物序列及反应条件如表4；表4转人乳铁蛋白克隆牛的PCR鉴定引物及反应条件
PCR结果如图6，从图6可以看出，我们设计的三对引物在两头克隆牛基因组中扩增出相应的特异产物，表明两头转基因克隆牛均整合完整的hLF BAC DNA。
2.5.2转基因克隆牛的Southern鉴定Southern检测则取PCR检测为阳性的转基因克隆牛DNA约10μg用EcoRI消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P32dCTP同位素标记的2.5kb的hLF基因编码区片段。
以乳铁蛋白基因编码区的一个2.5kb大小的片段对这两头转基因克隆牛进行Southern鉴定。从图7中可以看出，这两头克隆牛基因组中的确转有人的乳铁蛋白基因，而且铁娃的转基因拷贝数为1，祥娃的转基因拷贝数为2。
附SEQ ID NO 1人乳铁蛋白的一级结构即氨基酸序列，共711个氨基酸1 MKLVFLVLLF LGALGLCLAG RRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRRVR51GPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD GGFIYEAGLA PYKLRPVAAE101 VYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR RNAGWNVPIG151 TLRPFLNWTG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENK201 CAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELL251 CPDNTRKPVD KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGK301 DKSPKFQLFG SPSGQKDLLF KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQN351 LRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ WSGLSEGSVT CSSASTTEDC401 IALVLKGEAD AMSLDGGYVY TAGKCGLVPV LAENYKSQQS SDPDPNCVDR451 PVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQT501 GSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTG551 AFRCLAEDAG DVAFVKGVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKR601 KPVTEARSCH LAMAPNHAVV SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGSDCPDK651 FCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE KYLGPQYVAG ITNLKKCSTS701 PLLEACEFLR K
权利要求
1.生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下(1)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体，(2)将hLF BACDNA与双标记选择载体或单标记选择载体按比例混合，导入动物体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BAC DNA的转基因细胞，(3)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因克隆动物。
2.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述特异表达载体是长约150kb的hLF BAC DNA，重组人乳蛋白的转基因小鼠模型中表达的人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白大小一致，具有与天然人乳中乳铁蛋白相同的免疫活性。
3.根据权利要求2所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述转基因小鼠的人乳铁蛋白基因表达量为0.5-7.8g/l。
4.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述双标记选择载体是pEGFP-NEO，所述单标记选择载体是pNEO。
5.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述hLF BAC DNA与双标记选择载体或单标记选择载体混合的摩尔比为1∶3。
6.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述导入方法为体细胞显微共注射。
7.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述转基因细胞是通过G418进行筛选获得的阳性细胞。
8.根据权利要求1所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。
9.根据权利要求6所述的生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜为牛。
全文摘要
生产重组人乳铁蛋白的动物乳腺生物反应器——人乳铁蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下(1)利用含有完整人乳铁蛋白基因的hLF BAC DNA作为乳腺特异表达载体，(2)将hLF BAC DNA与双标记选择载体或单标记选择载体按比例混合，导入动物体细胞核内，进行细胞转染，获得转入hLF BACDNA的转基因细胞，(3)细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得转有hLF BAC DNA的转基因克隆动物。这些转基因转基因克隆动物乳腺特异表达的重组人乳铁蛋白将可以开发成保健品和药品，含重组人乳铁蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。
文档编号C12N15/85GK1687425SQ20051006611
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者汤波, 戴蕴平, 龚国春, 刘兆良, 赵春江, 张磊, 李宁 申请人:李宁