专利名称：一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化乳酸制备丙酮酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物法转化乳酸制备丙酮酸的方法，具体地说涉及一种利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化乳酸制备丙酮酸的方法。
直到20世纪90年代，工业上生产丙酮酸都沿用霍华德和弗莱瑟(Howard andfraser)1932年在《Org Synth Coll Vol1475-480 Preparation ofpyruvic acid》一文中发表的酒石酸脱水脱羧法，其主要缺点是(1)丙酮酸产率低(对酒石酸质量产率为0.29～0.30g/g)，(2)成本高(8万元/吨)。
发酵法生产丙酮酸的研究始于1950年，在已有的文献报道中，许多细菌、放线菌、酵母菌都能直接利用葡萄糖、丙二醇和丙酸发酵生产丙酮酸，但产量最高仅为23g/l。直到1988年，日本东丽工业株式会社的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过50g/l的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能，但是发酵法的生产周期长、糖酸转化率较低、从发酵混合物中分离丙酮酸一般难以进行，且费用较高。
美国专利(49006681990年2月13日)描述了利用醋杆菌(Acetobacter sp.)将D-乳酸氧化制备丙酮酸，转化率虽然很高，但D-乳酸价格昂贵，实现工业化有困难。
中国发明专利(CN 1125961A1996年7月3日)丙酮酸的制备方法，公开了利用甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶催化L-乳酸制备丙酮酸的专利。丙酮酸的浓度典型地可达500mM，转化率达96％以上。
反应式如下 由于上述反应的副产物过氧化氢能将丙酮酸分解为乙酸和二氧化碳，故该转化过程必需将甘醇酸盐氧化酶与过氧化氢酶共同固定，以分解副产物过氧化氢。并且该酶只能作用于L-乳酸，对消旋体中的D-乳酸无作用。
斯凯茨和西蒙(Schinschel and Simon)1993年在《J.Biotechnol.31191-203.Preparation of pyruvate from(R)-lactate with Proteus species.》一文中，利用变形杆菌(Proteus vulgaris)的(2R)-羟基羧化氧化还原酶(HVOR)进行转化乳酸制备丙酮酸的研究工作，利用20g(干重)/L的休止细胞在1h内可转化650mM的R-乳酸生成丙酮酸，转化率为94％。该体系单位时间产率较高，但需加入电子转移体2，6-二磺酸基蒽醌(AQDS)，并且还原态的电子转移体(AQDSred)需要电化学装置再生为氧化态(AQDSox)，所需设备复杂，投资大，成本高。
清水(Shimizu)2001年在《J.Mol.Catal.BEnzym.11355-359 Enzymatic productionof pyruvate from fumarate-an application of microbial cyclic-imide transformingpathway》一文中报道了利用一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)存在的环二酰亚胺途径，转化延胡索酸生产丙酮酸的工作，用1％的湿细胞，24h转化100mM延胡索酸生成94mM的丙酮酸。但该方法的底物较贵，成本较高。
经检索利用不动杆菌(Acinetobacter sp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)或其它微生物的乳酸氧化酶(LOD)或完整细胞进行转化乳酸制备丙酮酸的方法(反应体系中不产生过氧化氢)，未见报道。
本发明的利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其步骤顺序如下(1)菌种选择选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)之一。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5～2.0％的琼脂糖并加有0.2～3％DL/L-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25～45℃培养15～30小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的液体基本培养基(BLM)中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300～1000mL含有0.2-3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于1.8～8L含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到最高时，终止发酵培养。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次；再将菌体溶于pH6.0～9.0、20～100mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到50～300克湿细胞/升，或者超声波破碎后，离心得粗酶液，即制成生物催化剂，在4℃储存，备用。
(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与DL/L-乳酸钠混合，使混合物中DL/L-乳酸钠的浓度达到200～700mM；生物催化剂的浓度湿细胞0.5～8％，粗酶液酶活单位0.5～5U/ml。在5～40℃，pH6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～30小时，使底物乳酸、生物催化剂与氧气充分混合。
(8)分离样品以5,000～10,000转/分离心5～10分钟，分离步骤(7)中生物催化剂，得到上清液即为样品。
(9)样品检测待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用高效液相(HPLC)测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。
上述步骤(1)中所述的菌种选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171，和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC10838，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452之一。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中涉及的菌株使用基本液体培养基(BLM)配方(重量/体积)如下KH2PO40.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O 0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％。调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟。
金属离子混合液的配方如下(g/L)Na2EDTA，50；ZnSO4·7H2O，20；MnCl2·4H2O，5；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1，；FeSO4·7H2O，5；CuSO4·5H2O，1.5；CoCl2·H2O，1.6；CaCl2·2H2O，5.5。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是30～37℃。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是15～30小时。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中DL/L-乳酸钠浓度为0.5～2％。
步骤(6)中所述的生物催化剂是指含有分离纯化的乳酸氧化酶、含有酶的完整细胞、乳酸氧化酶的粗酶之一。
步骤(7)中所述的生物催化剂粗酶液的酶活单位1～3U/ml，湿细胞浓度是2～6％。
步骤(7)中所述的pH范围7.0～8.0。
步骤(7)中转化实验的温度为15～30℃。
在上述方法中，酶活的单位(U)定义为37℃，每分钟催化底物乳酸转化生成1μmol丙酮酸的酶量。
在上述方法中，HPLC采用Agilent1100，反向C18柱(4.6×150mm)，1mM硫酸∶甲醇(96∶4)为流动相，检测样品用两倍体积的高氯酸(5％)酸化后，过滤。
本发明是一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞作催化剂，使乳酸与氧气反应制备丙酮酸的方法。
本发明涉及的不动杆菌(Acinetobacter sp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)，同时具有D型乳酸氧化酶(D-LOD)、L型乳酸氧化酶(L-LOD)活性，并且催化乳酸生成丙酮酸的过程不产生过氧化氢。
反应式如下 本发明具有以下特点(1)菌株要求的培养基简单、生长周期短，成本低。
(2)能转化DL-乳酸或者L-乳酸，生成丙酮酸，底物成本低、转化率高。
(3)无需另加过氧化氢酶即可避免过氧化氢对产物丙酮酸的分解，转化产物单一，纯度高。
(4)该菌株的细胞通透性好，不需破碎，可直接用完整细胞进行转化，操作方便。
(5)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续分离提取费用低廉。
(6)可作用底物浓度高(700mM)。
具体实施方式
实施例1利用不动杆菌的乳酸氧化酶粗酶液转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法(1)菌种选择选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.8％的琼脂糖并加有0.5％DL/L-乳酸钠的固体斜面培养基上，25℃培养菌体20小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1环于50mL含有0.5％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用300mL三角摇瓶)，25℃条件下，在摇床上振荡培养20小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300mL含有0.5％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用1L三角摇瓶)，25℃条件下，在摇床上振荡培养15小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于1.8L含有0.5％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐)，25℃条件下，培养20小时，达到酶活高峰。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次；再将菌体溶于pH6.0、20mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到200克湿细胞/升，即制得生物催化剂，在4℃储存，备用。
(7)用超声波破碎上述制得的菌体细胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分钟，然后10,000转/分离心10分钟，收集上清液制得含有LOD的粗酶液作为生物催化剂。
(8)处理样品将步骤(7)中的粗酶液与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度达到400mM，粗酶液酶活1U/ml，在15℃、pH6.0条件下，180转/分钟振荡16小时。
(9)分离样品以10,000转/分离心5分钟，分离步骤(8)中处理的样品，得到上清液即为样品。
(10)样品检测待步骤(9)中的样品分离完之后，取1μL样品进样，HPLC检测乳酸、丙酮酸的含量，得出转化率为94.3％。实施例2利用假单胞菌的细胞粗酶液转化L-乳酸制备丙酮酸的方法(1)菌种选择选用假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC10838。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.2％DL/L-乳酸钠的固体斜面培养基上，30℃培养菌体15小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1环于25mL含有0.2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用300mL三角摇瓶)，30℃条件下，在摇床上振荡培养15小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于500mL含有0.2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用2L三角摇瓶)，30℃条件下，在摇床上振荡培养20小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于5L含有0.2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用10L德国贝朗全自动发酵罐)，30℃条件下，培养30小时。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心6分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次；再将菌体溶于pH7.0、50mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到100克湿细胞/升。
(7)用超声波破碎上述制得的菌体细胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分钟，然后5,000转/分离心5分钟，收集上清液制得含有LOD的粗酶液作为生物催化剂。
(8)转化实验将步骤(7)中的粗酶液与L-乳酸钠混合，使混合物中L-乳酸钠的浓度达到500mM，粗酶液酶活3U/ml。在30℃、pH7.0条件下，180转/分钟振荡10小时。
(9)催化剂分离以10,000转/分离心10分钟，分离步骤(8)中处理的样品，得到上清液即为样品。
(10)样品检测待步骤(9)中的样品分离完之后，取1μL样品进样HPLC测定乳酸和丙酮酸的含量，得出转化率为96.4％。实施例3利用假单胞菌的完整细胞转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法(1)菌种选择选用假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有2.0％的琼脂糖并加有2％DL/L-乳酸钠的固体斜面培养基上，37℃培养菌体30小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接2环于100mL含有2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用500mL三角摇瓶)，37℃条件下，在摇床上振荡培养30小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于600mL含有2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用1L三角摇瓶)，37℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于6L含有2％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用10L德国贝朗全自动发酵罐)，37℃条件下，培养15小时。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤3次；再将菌体溶于pH8.0、100mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到200克湿细胞/升，即制得生物催化剂。
(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度达到500mM，湿细胞浓度4％。在5℃、pH8.0条件下，180转/分钟振荡15小时。
(8)催化剂分离以10,000转/分离心8分钟，分离步骤(7)中处理的样品，得到上清液即为样品。
(9)样品检测待步骤(8)中的样品分离完之后，取1μL样品进样HPLC，测定乳酸和丙酮酸含量，得出转化率为98.2％。实施例4利用假单胞菌的完整细胞转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法(1)菌种选择选用假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC10838。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有3％DL/L-乳酸钠的固体斜面培养基上，45℃培养菌体24小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1环于25mL含有0.6％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用300mL三角摇瓶)，45℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于500mL含有3％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用2L三角摇瓶)，45℃条件下，在摇床上振荡培养25小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于8L含有3％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用10L德国贝朗全自动发酵罐)，45℃条件下，培养28小时。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤3次；再将菌体溶于pH9.0、20mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到200克湿细胞/升，即制得生物催化剂。
(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与L-乳酸钠混合，使混合物中L-乳酸钠的浓度达到700mM，湿细胞浓度6％。在40℃、pH9.0条件下，180转/分钟振荡20小时。
(8)催化剂分离以10,000转/分离心8分钟，分离步骤(7)中处理的样品，得到上清液即为样品。
(9)样品检测待步骤(8)中的样品分离完之后，取1μL样品进样HPLC，测定乳酸和丙酮酸含量，得出转化率为95.5％。实施例5利用不动杆菌的完整细胞转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法(1)菌种选择选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171。
(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有1.0％DL/L-乳酸钠的固体斜面培养基上，30℃培养28小时。
(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1环于25mL含有1.0％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用300mL三角摇瓶)，30℃条件下，在摇床上振荡培养25小时，制得一级种子。
(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于500mL含有1.0％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用2L三角摇瓶)，30℃条件下，在摇床上振荡培养30小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于8L含有1.0％DL/L-乳酸钠的BLM中(使用10L德国贝朗全自动发酵罐)，30℃条件下，培养40小时。
(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心7分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2次；再将菌体溶于pH8.0、80mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到150克湿细胞/升。
(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度达到200mM，湿细胞浓度2％。在pH8.0、25℃条件下，180转/分钟振荡6小时。
(8)分离样品以10，000转/分离心5分钟，分离步骤(7)中处理的样品，得到上清液即为样品。
(9)样品检测待步骤(8)中的样品分离完之后，取1μL样品进样，HPLC检测乳酸、丙酮酸的含量，得出转化率为95.7％。
权利要求
1.一种利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其步骤顺序如下(1)菌种选择选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)之一；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5～2.0％的琼脂糖并加有0.2～3％DL/L-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25～45℃培养15～30小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的液体基本培养基(BLM)中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300～1000mL含有0.2-3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于1.8～8L含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到最高时，终止发酵培养；(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次；再将菌体溶于pH6.0～9.0、20～100mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到50～300克湿细胞/升，或者超声波破碎后，离心得粗酶液，即制成生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与DL/L-乳酸钠混合，使混合物中DL/L-乳酸钠的浓度达到200～700mM；生物催化剂的浓度湿细胞0.5～8％，粗酶液酶活单位0.5～5U/ml；在5～40℃，pH6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～30小时，使底物乳酸、生物催化剂与氧气充分混合；(8)分离样品以5,000～10,000转/分离心5～10分钟，分离步骤(7)中生物催化剂，得到上清液即为样品；(9)样品检测待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用高效液相(HPLC)测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。
2.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的菌种选择不动杆菌(Acinetobactersp.)ATCC11171，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC10838，假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452之一。
3.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸生成丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中涉及的菌株使用基本液体培养基(BLM)(重量/体积)如下KH2PO40.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O 0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方如下(g/L)Na2EDTA，50；ZnSO4·7H2O，20；MnCl2·4H2O，5；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1，；FeSO4·7H2O，5；CuSO4·5H2O，1.5；CoCl2·H2O，1.6；CaCl2·2H2O，5.5。
4.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是30～37℃。
5.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是15～30小时。
6.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的DL/L-乳酸钠浓度为0.5～2％。
7.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的生物催化剂是指分离纯化的乳酸氧化酶、含有酶的完整细胞、乳酸氧化酶的粗酶之一。
8.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的生物催化剂粗酶液酶活单位1～3U/ml，湿细胞浓度是2～6％。
9.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(7)中所述的pH范围7.0～8.0。
10.如权利要求1所述的利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于，步骤(7)中处理样品的温度为15～30℃。
全文摘要
本发明公开了一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化DL/L－乳酸制备丙酮酸的方法，该方法包括(1)菌种选择；(2)斜面培养；(3)种子培养；(4)发酵罐培养；(5)收集菌体；(6)转化实验；(7)分离样品等步骤。本发明具有方法简便，成本低，转化效率高，提取产物方法简单等特点，在丙酮酸工业化生产方面具有很大的应用前景。
文档编号C12P7/40GK1451756SQ03112208
公开日2003年10月29日 申请日期2003年5月15日 优先权日2003年5月15日
发明者许平, 马翠卿, 魏中浩 申请人:山东大学