专利名称：一个人类睾丸特异表达的新基因septin 12 transcript variant 2的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类基因，具体是克隆了一个人类睾丸特异表达的新基因s印tin 12 transcript variant 2，明确了它在人体多种组织，不同发育阶段睾丸组织中的表 达谱，初步探明了该基因的功能。
背景技术：
人类基因组的全部基因在一个细胞内并非全部表达，正常情况下仅有15。/o的 基因表现转录mRNA的活性。在所有细胞类型中都表达的基因，称之为管家基因 (house-keeping gene),这类基因是维持细胞基本功能必需的基因；而在不同的细 胞类型中进行特异性表达的基因称之为组织特异性表达基因(tissue-specific gene) 或奢侈基因(luxury gene)，这类基因是在各种组织中选择性表达的基因，其表达 影响特定组织的分化、发育、成熟和调亡，决定不同组织特异的形态结构和生理 功能。
组织特异性基因是决定不同组织结构和功能的关键基因，因此寻找组织特异 性基因具有重要的意义。不同组织或细胞差异表达基因研究的方法有1. mRNA差异显示技术，包括差异显示反转录PCR (DDRT-PCR)、限制性酶切片 段差异显示(RFDD-PCR); 2.消减杂交，以抑制性消减杂交(SSH)和代表性 差异分析(RDA)为代表；3.基因表达连续性分析(SAGE); 4. DNA微阵列(DNA microarray)，即基因芯片等技术。通过以上几种方法寻找器官或组织特异性基因 实验繁琐、技术要求高、周期长、花费大。近年来随着生物信息学的飞速发展， 一种新的差异表达基因研究的方法数据库消减杂交(Digital Differential Display, DDD)出现了， DDD软件可比较不同组织来源的两个或多个EST文库，找出显 著差异表达的克隆重叠群(EST簇)，从而发现器官或组织特异性表达基因。数 据库消减杂交以网络上免费的EST数据库为实验对象，以DDD软件为研究工具， 具有快速、高效、简便、费用低廉等优点。运用数据库消减杂交筛选组织特异性 表达新基因已成为生物信息学研究的热点，近年来研究者利用该方法寻找新的生 精相关基因取得了丰硕的成果，如睾丸特异表达基因SRG5、 SRG8和SPATA11 均是通过数据库消减杂交方法发现的新基因。
发明内容
本发明的目的在于克隆一个人类睾丸特异表达的新基因septin 12 transcript variant 2，并分析它在人体多种组织，不同发育阶段睾丸组织中的表达情况，探 索其在睾丸生精过程中的功能，进而开发治疗男性不育症的基因药物。
进入美国NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Unigene数据库，找到DDD 程序。将S个人类睾丸组织来源的cDNA序列文库作为检测子(pool A)， 119个 人类其它组织或细胞株来源的cDNA序列文库作为驱赶子(poolB)，以差异》10 倍作为筛选标准，运行DDD程序，获得在人类睾丸组织中显著高表达并代表新
基因的克隆重叠群(contig) Hs.l26780，其中包含39条ESTs，将这些ESTs进 行匹配、拼接、延伸后获得一较长的cDNA片段。
从拼接获得的cDNA片段出发，利用Blast程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/)检索人类EST和nr基因数据库，将相似序列进行匹配、拼接、延伸， 获得受人类基因组图谱支持的新基因cDNA全长序列。全长序列为1524bp，包 含1077bp (265 1341)的开放阅读框，起始密码子ATG位于265 267bp，终 止密码子TGA位于1339 1341bp，在起始密码子ATG的5'端有一同相位的终 止密码子TAA， 3'端有一加尾信号AATAAA。新基因有10个外显子，9个内 含子，基因组跨越10.9kb，外显子和内含子交界符合典型的GT/AG规则。新基 因定位于16p13.3，经人类基因命名委员会(HGNC)命名为s印tin 12 transcript variant 2 (SEPT12) ， GenBank登陆号EF620906.1。
生物信息学分析显示septin 12 transcript variant 2蛋白质有358个氨基酸，分 子量为40747d,等电点为6.67。该蛋白无跨膜区、信号肽序列和疏水性结构，推 测其为一非分泌性蛋白质，PSORTII软件预测蛋白质定位于线粒体的可能性为 56.5%。同源性搜索显示该蛋白与septin2、 septin7、 septin9等多种septin蛋白有 一定同源性，属于septin家族。该蛋白有1个N-糖基化位点，2个蛋白激酶C 磷酸化位点，3个酪蛋白激酶II磷酸化位点，1个N端豆蔻酰化位点，1个酰胺 化位点，1个ATP/GTP结合位点。
在新基因阅读框架的起始密码子和终止密码子外侧设计引物，以人睾丸 cDNA文库为模板，进行PCR扩增，2。/。琼脂糖电泳检测PCR产物。将PCR产 物克隆入T载体，转化大肠杆菌JM109，送上海生工公司测序。PCR产物测序 结果显示其大小为1137kb,碱基序列与新基因完全相同，说明新基因序列拼接 完全正确，从而实验验证了新基因septin 12 transcript variant 2。
根据新基因序列设计引物进行多组织RT-PCR反应，分析新基因的组织表达 谱。结果显示新基因在人类成年睾丸组织中高表达，在卵巢、心脏、脑、肺、胃、 肝、脾、肾、大肠、膀胱、前列腺组织中不表达，内对照GAPDH基因在所有检 测组织中均表达。RT-PCR结果与数据库消减杂交结果一致，提示新基因为睾丸 组织特异性表达基因。
多组织Northern杂交结果显示septin 12 transcript variant 2在睾丸组织中有较 强表达，而在卵巢、肾、肝、胃、肺、心脏、脑中无表达，对照基因e-actin在 所有被检测组织中均有表达。多组织Northern杂交结果与多组织RT-PCR结果一 致，新基因转录本大小约为1524bp。
基因的表达具有时序性，即在不同的发育阶段基因表达不同，以满足不同发 育阶段的生理功能。检测新基因在不同发育阶段睾丸组织中的表达有助于了解新 基因在哪个阶段表达及发挥作用。不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR分析 提示该基因在6个月胎儿睾丸组织中不表达，在7个月胎儿睾丸组织中有微弱表
达，在成年睾丸组织中高表达，在老年男性睾丸组织中表达减弱，而在隐睾组织 中不表达，GAPDH基因在各组织中均表达。成年期睾丸发育成熟，生精功能活 跃；老年期生理机能减退，生精细胞减少；而胎儿处于发育初期，无精子生成； 隐睾组织发育异常、生精功能障碍。不同发育阶段及病理睾丸组织RT-PCR结果 提示新基因的表达具有发育阶段性，其功能可能与睾丸发育或精子发生有关。
为明确新基因在不同发育阶段生精细胞中的表达与细胞内定位，探明新基因 在男性生殖细胞发育过程中的作用，我们进行了组织原位杂交。Septin 12 transcript variant 2基因探针在成年男性睾丸组织的精原细胞和精母细胞中可以 检测到明显的棕褐色杂交信号，而在支持细胞和间质细胞中未能检测到杂交信 号。说明septin 12 transcript variant 2主要在精原细胞和精母细胞中表达，提示其 功能可能与精原细胞和精母细胞的分裂或细胞调亡有关。
本发明的优点
1、 克隆了一个人类睾丸特异表达的新基因s邻tin 12 transcript variant 2，初
步阐明了该基因的功能，为下一步深入研究该基因功能提供了基础。
2、 该基因仅在人睾丸组织中表达，且在成年睾丸组织中高表达，胎儿和老 年睾丸组织中表达减弱，隐睾组织中不表达，推测其功能可能与睾丸发育或精子 发生有关；
3、 该基因在睾丸组织的精原细胞和精母细胞中表达，提示其功能可能与精 原细胞和精母细胞的分裂或细胞调亡有关，有望为男性不育症的治疗提供新方 向。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图1. Septin 12 transcript variant 2基因cDNA序列和编码的氨基酸序列； 图2. Septin 12 transcript variant 2基因的染色体定位；
图3.新基因开放阅读框的PCR扩增；
M: Marken 1: PCR汽勿 图4.多组织RT-PCR反应分析新基因的组织表达谱
M: Marker; 1:睾丸；2:卵巢；3:心脏；4:脑；5:肺；6:胃；
7:肝；8:脾；9:肾；10:大肠；11:膀胱；12:前列腺
图5.多组织Northern杂交；
M: Marker; 1:卵巢；2:肾；3:肝；4:胃；
5:肺;6:心脏;7:睾丸；8:脑.
图6.不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR; M: Marker; 1: 6M胎儿睾丸；2: 7M胎儿睾丸；3: 30Y成年睾丸；
4: 76Y男性睾丸；5: 31Y隐睾.
图7. 30岁成人睾丸组织原位杂交结果。
A: S印tin 12探针；B:阴性对照.
具体实施例方式
实施例l新基因开放阅读框架的PCR扩增
在新基因阅读框架的起始密码子和终止密码子外侧设计引物，上游引物P1:
ACCCTTGGCCCCCATGGAC;下游引物P2: GCCGCTGGGGACTAGGAAG， 以人睾丸cDNA文库为模板，进行PCR扩增。15pl的反应体系为双蒸水8.9|al， 10XPCR buffer 1.5|il， Mg2+ (20mmol/L) 1.3|al， dNTP mixture( 2.5mM)1.5 pi,引 物对Pl/P2(10pmol/1) 0.3nl， TaqDNA聚合酶(5u/l)0.3pl，睾丸cDNA模板1.2pl。 反应条件为94。C预变性3min, 94。C变性40s， 64。C退火35s， 72。C延伸40s，完 成35个循环，最后72'C延伸5min。将PCR产物克隆入T载体，转化大肠杆菌 JM109，送上海生工公司测序。
实施例2多组织RT-PCR反应分析新基因的组织表达谱 根据新基因序列设计引物上游引物P3: GGCTACATCAACGAGCAATACG; 下游引物P4: GGAGGTGGGAGCGGATAAG，预期扩增产物为496bp。内对照 GAPDH引物上游引物GGGAAACTGTGGCGTGATG ; 下游引物 GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC,扩增产物为297bp。反应体系见实施例1。反 应条件94。C预变性3min，94。C变性40s,58。C退火35s，72。C延伸40s，完成35个 循环，最后72'C延伸5 min。取4^1 PCR产物，以2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色、 照相。
实施例3不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR
不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR的引物，反应体系，反应条件与实 施例2—样，仅扩增的cDNA模板不同，为不同发育阶段的睾丸组织。 实施例4多组织Northern杂交
探针制备
使用引物ATGTGGTGCCCGTGATTGCC与GCCGCTGGGGACTAGGAAG， 以人类睾丸组织cDNA文库为模板进行PCR扩增，PCR产物为562bp。新基因cDNA 探针和P -actin cDNA探针的标记及检测按地高辛DNA标记试剂盒(DDLK-010)说
明书进行。
1. 预杂交:将预制多组织核酸印迹膜取出，用剪刀将多余的部分剪去，放入杂 交袋中。加入65'C预热的高效HyB杂交液(HyB-100) 5 mL，排尽气泡，封口。 65T水浴振荡杂交l小时。
2. 杂交探针的处理:将标记好的探针于10(TC煮10 15min，立即放入冰浴冷 却10min。将预杂交袋从水浴中取出，尽量排干袋中的预杂交液。取5mLHyB 高效杂交液(65"预热)，按8ng/ml杂交液的浓度加入处理过的探针，混匀， 加入到杂交袋中。小心排尽气泡，封口，放65"C水浴振荡杂交过夜。
3. 洗膜剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2XSSC0.P/。SDS溶液的
平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5min。再将膜放入0.1XSSC0"/。SDS 溶液(先放50。C水浴预热)中，50。C水浴振荡洗涤两次，每次15min。镊子将 膜取出转入装有20mL洗漆缓冲液的平皿中振荡洗漆5min。
4. 加入30mL阻断溶液封闭30min。
5. 再将膜转入30mL抗体溶液中孵育30min。在20ml洗涤缓冲液中振荡洗涤两 次，每次15min。
6. 信号检测将膜放入20mL检测缓冲液中振荡平衡5min。
7. 将CDP-STAR化学发光底物加入到检测缓冲液中，混匀后均匀加在膜上，室 温反应5min，用X-光学曝光10min。扫描记录结果。
实施例5成人睾丸组织原位杂交
新基因探针制备针对新基因Septin 12 transcript variant 2的mRNA序列，设计 合成多聚寡核苷酸探针，经地高辛标记。然后按下列步骤完成实验。
1. 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度为6 8um。
2. 玻片的处理采用多聚赖氨酸。
3. 石蜡切片常规脱蜡至水，30%&021份+蒸熘水10份混合，室温5 10分钟 以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。
4. 暴露mRNA核酸片段切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(lml3% 柠檬酸加2滴浓縮型胃蛋白酶，混匀)，室温消化5分钟。原位杂交用PBS 洗3次X5分钟。蒸馏水洗1次。
5. 后固定固定液为4。/。多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2 7.6)，含有1/1000 DEPC。 室温固定10分钟，蒸熘水洗涤3次。
6. 预杂交湿盒的准备干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每 张切片20^1滴加预杂交液，恒温箱38'C2小时，吸取多余液体，不洗。
7. 杂交按每张切片20pl杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保 护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38'C杂交过夜。
8. 杂交后洗涤揭掉盖玻片，37'C左右水温的2XSSC洗涤5分钟X2次；37 t:0.5XSSC洗涤15分钟X1次；37。C0.2XSSC洗涤15分钟X1次。
9. 滴加封闭液，37。C30分钟，甩去多余液体，不洗。
10. 滴加生物素化鼠抗地高辛，室温120分钟，原位杂交用PBS洗5分钟X4次。
11. 滴加SAB，室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟X3次。
12. 滴加生物素化过氧化物酶，室温30分钟，原位杂交用PBS洗5分钟X4次。
13. DAB显色使用DAB显色试剂盒(lml蒸馏水加显色剂A，B,C各一滴，混 匀，加至标本上，显色20分钟，充分水洗。
14. 苏木素复染，充分水洗。
15. 酒精脱水，二甲苯透明，封片。
权利要求
1.一个人类睾丸特异表达的新基因septin 12 transcript variant 2，其特征在于该基因的cDNA核苷酸序列和编码氨基酸序列如下1cttgggcccctggttctacttggggattattgtattattaggctggggtcattgtgggga 6061 ttagaagggtaacagctcctgctcctgctgcagagaagcctccaggtgggggtcacagca 120121 agtgcagatggagctcagattcttcggttaactgtcaccctctcccctcccccatcacac 180181 acaccaggccctgccaggacaaggcagctcctggaagctccaccaggacccacgtccacc 240241 aggcatctcgaacccttggcccccatggaccccctgaggcgctccccctctccctgcctg 300 M D P L R R S P S P C L301 tcctcgcagccctccagccccagcaccccaccctgcgagatgcttggtcctgtgggcatt 360 S S Q P S S P S T P P C E M L G P V G I361 gaggctgtgctggaccagctgaagatcaaggctatgaagatggggtttgagttcaacatc 420 E A V L D Q L K I K A M K M G F E F N I421 atggtggtggggcaaagcgggctgggcaagtccacgatggtgaacacgctgttcaagtcc 480 M V V G Q S G L G K S T M V N T L F K S481 aaagtgtggaagtcaaacccaccgggcttgggggtgcccacaccccagacgctgcagctg 540 K V W K S N P P G L G V P T P Q T L Q L541 cattcactgacccatgtcatagaggagaagggtgtgaagctgaagctgacggtgacggac 600 H S L T H V I E E K G V K L K L T V T D601 acgcccggcttcggggaccagatcaacaatgacaactgctgggaccccatcctgggctac 660 T P G F G D Q I N N D N C W D P I L G Y661 atcaacgagcaatacgagcagtacctgcaggaggagatcctcatcacccgccagcgccac 720 I N E Q Y E Q Y L Q E E I L I T R Q R H721 atcccagacacccgggtgcactgctgcgtgtactttgtaccacccactgggcactgcctg 780 I P D T R V H C C V Y F V P P T G H C L781 cggcccctggacattgagttcctgcagcggctgtgccggactgtgaatgtggtgcccgtg 840 R P L D I E F L Q R L C R T V N V V P V841 attgccagggccgacagcctgaccatggaggagcgagaggccttcaggcgcaggatccag 900 I A R A D S L T M E E R E A F R R R I Q901 cagaacctgaggacccactgcatcgacgtctacccccagatgtgctttgacgaggacatc 960 Q N L R T H C I D V Y P Q M C F D E D I961 aatgacaaaatcctcaacagcaagttacgggaccgaatcccttttgccgtggtaggggct 1020 N D K I L N S K L R D R I P F A V V G A1021 gaccaagagcacctggtgaacgggaggtgtgtcctgggccggaagaccaagtggggcatc 1080 D Q E H L V N G R C V L G R K T K W G I1081 attgaagtggagaacatggcgcactgtgaatttcctctcctgagagacctgcttatccgc 1140 I E V E N M A H C E F P L L R D L L I R1141 tcccacctccaagacctgaaggacataacccacaacatccactatgagaactaccgcgtc 1200 S H L Q D L K D I T H N I H Y E N Y R V1201 atcagactcaatgaaagccacctgctgccccgcgggcccggctgggtgaacctggccccg 1260 I R L N E S H L L P R G P G W V N L A P1261 gcctccccaggacagctgaccaccccccggaccttcaaggtctgcaggggggcccatgac 1320 A S P G Q L T T P R T F K V C R G A H D1321 gattctgatgatgagttctgaccaccggcggatcccggggctgctgggcttcctgagtcc 1380 D S D D E F *1381 ccagcggctctcaacacacacctatgtaccagagcatctattaaatgtgagccttgcttt 14401441 ttatgaaaagctgtgctttgaaaacaaaaggcattttgtaaatgacttctttgagctatc 15001501 cacaaataaaaaggctgggtgtca
全文摘要
克隆了一个人类睾丸特异表达的新基因septin 12 transcript variant 2。它的cDNA全长为1524bp，开放阅读框为1077bp，编码蛋白质由358个氨基酸组成，基因定位于16p13.3。该基因仅在人睾丸组织中表达，且在成人睾丸组织中强表达，胎儿和老年睾丸组织中表达明显减弱，隐睾组织中不表达，表明其功能可能与睾丸发育或精子发生有关，有望为男性不育症的治疗提供新的方向。
文档编号C07K14/47GK101372691SQ20081003077
公开日2009年2月25日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者文甲明, 汤育新, 汪金荣, 蒋先镇 申请人:蒋先镇;汪金荣;汤育新;文甲明