可食用组合物的制作方法【专利摘要】富含可利用的碳水化合物如蔗糖或淀粉的食物或膳食提高餐后血糖浓度。反复的高餐后血糖“峰值”与提高的发生II型糖尿病的危险相关联。不受调节的血糖偏移是不合意的，餐后血糖浓度的任何降低或“钝化”可能有益。本发明涉及通过协同抑制活性钠葡萄糖共转运体1(SGLT1)和被动葡萄糖转运体2(GLUT2)而延迟肠道葡萄糖摄取以使餐后血糖峰值趋平或钝化的可食用组合物。因此在本发明的第一方面中，提供可食用组合物，所述组合物包含至少5干重量%的至少一种类黄酮糖苷配基和至少5干重量%的至少一种类黄酮葡糖苷，其中所述类黄酮葡糖苷对乳糖酶根皮苷水解酶水解的抗性比槲皮素-4-葡糖苷高至少20%，优选至少40%，最优选至少60%，且其中所述类黄酮糖苷配基是GLUT2抑制剂，且所述类黄酮葡糖苷是SGLT1抑制剂。【专利说明】可食用组合物[0001]富含可利用的碳水化合物如蔗糖或淀粉的食物或膳食提高餐后血糖浓度。根据Node等人所述(Cardiovasculardiabetology,8,23(2009)),反复的高餐后血糖“峰值”与提高的发生II型糖尿病的危险相关联。不受调节的血糖偏移(glycemicexcursion)是不合意的，餐后血糖浓度的任何降低或“钝化”可能有益。本发明涉及通过协同抑制活性钠葡萄糖共转运体I(SGLTl)和被动葡萄糖转运体2(GLUT2)而延迟肠道葡萄糖摄取以使餐后血糖峰值趋平或钝化的可食用组合物。[0002]发明概述在本发明的第一方面中，提供可食用组合物，所述组合物包含至少5干重量％的至少一种类黄酮糖苷配基(flavonoidaglycone)和至少5干重量％的至少一种类黄酮单葡糖苷，其中所述类黄酮单葡糖苷对乳糖酶根皮苷水解酶水解的抗性比槲皮素-4-葡糖苷高至少20%，优选至少40%，最优选至少60%，且其中所述类黄酮糖苷配基是GLUT2抑制剂，所述类黄酮单葡糖苷是SGLTI抑制剂。[0003]乳糖酶根皮苷水解酶(LPH)——种β-半乳糖苷酶，是在小肠中发现的参与二糖乳糖水解成其成分半乳糖和葡萄糖单体的酶。特别地，该酶水解D-乳糖中的β-糖苷键。这种酶的缺乏造成乳糖不耐受。LPH也具有葡糖苷酶活性。因此，类黄酮葡糖苷必须表现出一定程度的对小肠中的LPH水解的抗性，在小肠中经由葡萄糖转运体发生葡萄糖吸收。[0004]术语“对LPH水解的抗性比槲皮素-4-葡糖苷高至少20%”是指被LPH水解的比率比槲皮素_4’-葡糖苷低至少20%。因此，如果对LPH水解的抗性比槲皮素-4-葡糖苷高100%，该比率为O。[0005]术语“类黄酮糖苷配基”是指未糖基化的类黄酮。术语“类黄酮单葡糖苷”是指连接到单葡萄糖单元上的类黄酮。术语“GLUT2抑制剂”是指抑制被称作被动葡萄糖转运体2的跨膜载体蛋白的化合物。术语“SGLT1抑制剂”是指抑制被称作钠葡萄糖共转运体I的跨膜载体蛋白的化合物。[0006]类黄酮糖苷配基可选自黄酮糖苷配基、黄烷醇糖苷配基、黄烷酮糖苷配基、异黄酮糖苷配基及其混合物。因此术语“黄酮糖苷配基”、“黄烷醇糖苷配基”、“黄烷酮糖苷配基”和“异黄酮糖苷配基”分别是指未糖基化的黄酮、黄烷醇、黄烷酮和异黄酮。类黄酮糖苷配基特别可选自芳:菜苷配基(apigenin)、木犀草素(Iuteolin)、槲皮素(quercetin)、山奈黄素(kaempferol)、杨梅黄酮(myricetin)、柚皮素(naringenin)、生松素(pinocembrin)、澄皮素(hesperetin)、染料木黄酮(genistein)及其混合物。[0007]类黄酮单葡糖苷可选自木犀草素-7-葡糖苷、芹菜苷配基-8-C-葡糖苷、山奈黄素-7-0-匍糖苷、山奈黄素-3-0-匍糖苷、柚皮素(naringenoin)-7-0-匍糖苷、大?糖苷配基-8-葡糖苷、矢车菊苷元-3-葡糖苷、槲皮素-3-葡糖苷、天竺葵色素-3-葡糖苷、锦葵色素-3-葡糖苷、飞燕草色素-3-葡糖苷及其混合物。[0008]类黄酮糖苷配基与类黄酮单葡糖苷的摩尔比的范围可以为4:1至1:4，优选3:1至1:3，最优选2:1至1:2。[0009]该组合物可包含按重量计不多于50%,优选不多于10%,最优选不多于2%的类黄酮糖苷配基，和按重量计分别不多于50%，优选不多于10%，最优选不多于2%的类黄酮单葡糖苷。因此，在不多于2重量％的类黄酮糖苷配基水平下，该组合物必须包含水以使该组合物包含至少5干重量％的至少一种类黄酮糖苷配基。[0010]该组合物优选为日剂量形式，该日剂量包含至少50微摩尔，优选至少100微摩尔，最优选至少250微摩尔的类黄酮糖苷配基和至少50微摩尔，优选至少100微摩尔，最优选至少250微摩尔的类黄酮单葡糖苷。[0011]本发明的组合物可以是包含不多于99.95%w/w水的包装饮料形式。其也可以是装在小袋中的干粉形式，该干粉适合添加到膳食中。[0012]在本发明的第二方面中，提供降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应的方法，所述方法包括步骤:(a)由非糖尿病人口服根据本发明的第一方面的组合物；和(b)由非糖尿病人口服糖类；其中步骤(a)与步骤(b)同时、提前0至90，优选0至60分钟或延后0至30分钟，且其中所述糖类包含葡萄糖或是葡萄糖。[0013]在本发明的第三方面中，提供治疗需要其的人的2型糖尿病的方法，所述方法包括步骤:(a)由需要其的人口服根据本发明的第一方面的组合物；和(b)由需要其的人口服糖类；其中步骤(a)与步骤(b)同时、提前0至90，优选0至60分钟或延后0至30分钟，且其中所述糖类包含葡萄糖或是葡萄糖。[0014]该糖类可选自多糖、寡糖、二糖、单糖及其混合物。[0015]在本发明的第四方面中，提供根据本发明的第一方面的组合物，其用于降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应。[0016]在本发明的第五方面中，提供根据本发明的第一方面的组合物，其用于治疗2型糖尿病。[0017]在本发明的第六方面中，提供根据本发明的第一方面的组合物用于制造降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应的药剂的用途。[0018]在本发明的第七方面中，提供根据本发明的第一方面的组合物用于制造治疗2型糖尿病的药剂的用途。[0019]附图简述参照附图阐述本发明，其显示:图1餐中葡萄糖浓度时间轴模型；图2前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300剛根皮苷(Pz))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(125剛根皮素(Pt))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(剛)(NC=媒介物阴性对照)；图3前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300剛木犀草素-7-葡糖苷(L7G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50剛染料木黄酮(G))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图4前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ芹菜苷配基-8-C-葡糖苷(A8G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ染料木黄酮(G))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图5前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ槲皮素-3-葡糖苷(Q3G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(100μΜ橙皮素(H))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图6前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300MM槲皮素_3_葡糖苷(Q3G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ木犀草素(L))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图7前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ山奈黄素-3-葡糖苷(K3G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ橙皮素(H))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图8前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ槲皮素-3-葡糖苷(Q3G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ柚皮素(N))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；图9前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ柚皮素-7-葡糖苷(N7G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ芹菜苷配基(A))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)；和图10前15分钟在5mMD-葡萄糖中在存在或不存在SGLTl抑制剂(300μΜ飞燕草色素-3-葡糖苷(D3G))的情况下和随后剩余45分钟在25mMD-葡萄糖中在存在或不存在GLUT2抑制剂(50μΜ染料木黄酮(G))的情况下，跨过分化Caco-2单层的总累积葡萄糖转运(μΜ)(NC=媒介物阴性对照)。[0020]发明详述实施例1:SGLTl和GLUT2抑制剂的鉴定常规细胞培养人上皮结直肠腺癌(Caco-2)细胞获自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)并在由Dulbecco’smodifiedEagle’s培养基(含有Glutamax-l,4.5g/LD_葡萄糖和25mM4-(2-轻乙基)-1-哌嗪乙横酸(Hepes)(Invitrogen))、10%胎牛血清(Sigma)>1%非必需氨基酸(Invitrogen)和ImM丙酮酸钠(Sigma)构成的生长培养基中培养。使用TrypLE?ExpressStableTrypsin-LikeEnzyme(Invitrogen)使细胞以大约80%汇合度照惯例传代以剥离细胞，并以大约114个细胞/平方毫米接种在新鲜组织培养烧瓶中。只有传代数为45至49之间的细胞用于实验。[0021]分化Caco-2细胞单层的制备Corning?HTSTranswell?96孔可透插入载体(insertsupport)(Sigma)在室温下在无菌条件下用40微升在0.02M乙酸中的50微克/毫升I型大鼠尾胶原(BDBiosciences)包被胶原I小时。该插件在磷酸盐缓冲盐水(PBS(Invitrogen))中洗漆两次并将Caco-2细胞在生长培养基中以9.6XIO5个细胞/毫升(75微升/插件)接种到插件中并将30毫升生长培养基添加到下方给料板中。在37°C，5%CO2下使细胞附着到胶原基质上并经48小时形成单层。插件和给料板都在PBS中洗涤，细胞在37°C，5%CO2下用含有MITO+?SerumExtender溶液的BDEntero-STIM?Enterocyte分化培养基(都是BDBiosciences)培养(每插件75微升，30毫升在给料板中)另外48小时。[0022]葡萄糖转运抑制剂细胞筛选检测分化细胞单层在含有CaCl2和MgCl2的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS(+)(Invitrogen))中温和洗漆并将插件转移到新的Corning?HTSTranswel1?_96孔接收板(Sigma)中。细胞在37°C，5%CO2下用新鲜PBS(+)(75微升/插件和225微升/孔)培养60分钟。一式三份地，轻轻抽出PBS(+)并换成75微升/插件的5mMD-葡萄糖(Sigma)土测试活性剂或25mMD-葡萄糖土测试活性剂，并将225微升/孔的PBS(+)快速添加到各孔中。5mM葡萄糖孔和25mM葡萄糖孔在37°C，5%CO2下分别培养15分钟和30分钟。所有测试活性剂的细节可见于表I。将细胞插件转移到新接收板中，从细胞中轻轻抽出上清液并换成100微升的100UMLuciferYellow(Sigma)溶液以证实该单层的完整性。将225微升PBS(+)添加到各孔中并在37°C，5%C02下培养I小时。然后弃去细胞插件并通过在SpectramaxGeminiEM突光酶标仪上在485纳米(激发)和530纳米(发射)下测量样品突光来检查该膜的LuciferYellow可透性。[0023]葡萄糖检测使用基于Invitrogen’sAmplexRed葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒的葡萄糖检测测量跨过细胞单层转运的葡萄糖量。简言之，将50微升各测试样品转移到黑面/透明底96孔板(GreinerBio-One)中，向其中加入100微升反应缓冲液(0.5微升10mMAmplifluRecUl微升10U/ml辣根过氧化物酶、I微升100U/ml葡萄糖氧化酶和97.5微升PBS(都为Sigma))o在室温下培养10分钟后，在SpectramaxGeminiEM突光酶标仪上在530纳米(激发)和590纳米(发射)下测量样品荧光并由标准曲线外推葡萄糖浓度。[0024]表I显示各测试活性剂对跨过分化Caco-2细胞单层的葡萄糖转运的抑制百分比。在5mM的较低D-葡萄糖浓度下，跨细胞单层的早期葡萄糖转运主要通过顶端表达的高亲和力、低容量SGLTl葡萄糖转运体。在较高D-葡萄糖浓度下，SGLTl转运体变饱和，因此跨单层的葡萄糖转运大部分由仅在最初的SGLTl-依赖性葡萄糖转运后祀向顶端膜的低亲和力、高容量GLUT2转运体驱动。上述方法中详述的筛选细胞模型被设计用来利用各转运体的最佳条件的这些差异鉴定SGLTl和GLUT2特异性抑制剂。顶端膜上的SGLTl和GLUT2都将葡萄糖转运到肠上皮细胞中，而在基底外侧膜中也表达GLUT2，在此其对于将葡萄糖转运到细胞外是必要的。因此，GLUT2特异性抑制剂不仅在高D-葡萄糖浓度(25mM)下阻断顶端靶向的转运体，它们还进入细胞并在低D-葡萄糖浓度(5mM)下阻止葡萄糖从肠上皮细胞中离开。因此，为了区分顶端和基底外侧转运体之间的抑制，各活性剂在5mMD-葡萄糖下测试15分钟和在25mMD-葡萄糖下测试30分钟。如果活性剂表现出在5mMD-葡萄糖下至少20%的葡萄糖转运抑制和在25mMD-葡萄糖下相应的不多于20%的抑制，活性剂被归类为SGLTl抑制剂。在这两种条件下都能抑制至少20%葡萄糖转运的活性剂被归类为GLUT2特异性抑制剂。使用SGLTl和GLUT2的广泛认可的特异性抑制剂(即分别为根皮苷和根皮素)验证这种方法。[0025]上述葡萄糖转运细胞模型由Kellett等人(Diabetes,54,10,3056-62(2005))描述并由被设计用来模拟在富含碳水化合物的膳食摄入过程中小肠中的葡萄糖浓度局部变化的图1图解。餐前，肠腔中的游离葡萄糖浓度低(〈5mM)，顶端表达的SGLTl转运体积极地将任何可利用的葡萄糖转运到肠上皮细胞中。GLUT2转运体也在肠上皮细胞的基底外侧膜上活跃，如果需要，将葡萄糖从血液转运到细胞中以维持细胞代谢。餐中，葡萄糖局部浓度开始提高(5-10mM)并被SGLTl从肠腔转运出来并随后经由GLUT2转运到全身循环中。由于跨过肠上皮细胞的这种初始葡萄糖转运，动员GLUT2的细胞内储备并靶向顶端膜。餐后不久，由于该膳食的碳水化合物含量被位于顶端肠上皮细胞膜上的α-葡糖苷酶分解成单糖，出现葡萄糖的极高局部浓度(25-100mM)。在这些高葡萄糖水平下，高亲和力、低容量转运体SGLTl变饱和且跨过肠上皮细胞的大部分葡萄糖转运归因于如今存在于顶端膜中的低亲和力、高容量GLUT2转运体。[0026]表I显示，为了抑制SGLTl，如通过木犀草素_7_葡糖苷、芹菜苷配基_7_葡糖苷、芹菜苷配基-8-c-葡糖苷、山奈黄素-3-葡糖苷、山奈黄素-7-葡糖苷、槲皮素-3-葡糖苷、槲皮素-4-葡糖苷、柚皮素-7-葡糖苷、圣草酚-7-葡糖苷、大豆糖苷配基-8-c-葡糖苷、大豆糖苷配基-7-葡糖苷、矢车菊苷元-3-葡糖苷、锦葵色素-3-0-葡糖苷、飞燕草色素-3-葡糖苷和天竺葵色素-3-葡糖苷证实，需要类黄酮单葡糖苷。实际上，如槲皮素_3，4’-二葡糖苷所示，该化学结构上的额外葡萄糖部分的存在破坏这种抑制作用。通过其它测试类黄酮糖苷，包括矢车菊苷元-3-芸香糖苷和锦葵色素-3-0-半乳糖苷不存在SGLTl抑制活性，证实对葡糖苷的特异性。此外，氢醌单葡糖苷——熊果苷表现出的SGLTl抑制活性的欠缺加强了该葡糖苷分子中的类黄酮结构的重要性。Welsch等人(J.0fNutrition,119，11，1698-704(1989))宣称是葡萄糖转运体抑制剂的其它非类黄酮葡糖苷，如氯原酸、咖啡酸和迷迭香酸(咖啡酸的酯)在SGLTl或GLUT2抑制的这种细胞模型中没有表现出抑制活性。表I还表明，除花色素类外的来自所选各类黄酮类别的所有测试糖苷配基都被证实是GLUT2抑制剂。[0027]实施例2:SGLTl和GLUT2抑制剂之间的协同作用分化Caco_2细胞单层的制备Caco-2细胞如实施例1中所述培养和照惯例传代。将Caco-2细胞在生长培养基中以2.5XIO5个细胞/毫升(500微升/插件)接种到BioCoatHTSFibrillarCollagenMultiwellInserts(BDBiosciences)中并将30毫升生长培养基添加到下方给料板中。在37°C,5%CO2下使细胞附着到胶原基质上并经24小时形成单层。插件和给料板都在PBS中洗涤，细胞在37°C，5%CO2下用含有ΜΙΤΟ+?SerumExtender溶液的BDEntero-STIM?Enterocyte分化培养基(都是BDBiosciences)培养(每插件500微升,30毫升在给料板中)另外48小时。[0028]表1:分别使用5mMD-葡萄糖15分钟和25mMD-葡萄糖30分钟，测试Caco-2细胞中的SGLTl和GLUT2抑制活性用的活性剂。各活性剂抑制的转运体的指定种类基于具有在5mMD-葡萄糖下≥20%的葡萄糖转运体抑制和在25mMD-葡萄糖下≤20%抑制的SGLTl抑制剂，和在5mM和25mMD-葡萄糖水平下都具有≥20%抑制的GLUT2抑制剂。ND=未检出；Nt=未测试。【权利要求】1.可食用组合物，其包含至少5%，优选至少10干重量％的至少一种类黄酮糖苷配基和至少5%，优选至少10干重量％的至少一种类黄酮单葡糖苷，其中所述类黄酮单葡糖苷对乳糖酶根皮苷水解酶水解的抗性比槲皮素-4-葡糖苷高至少20%，优选至少40%，最优选至少60%，且其中所述类黄酮糖苷配基是GLUT2抑制剂，且所述类黄酮单葡糖苷是SGLTI抑制剂。2.根据权利要求1的组合物，其中所述类黄酮糖苷配基选自黄酮糖苷配基、黄烷醇糖苷配基、黄烷酮糖苷配基、异黄酮糖苷配基及其混合物。3.根据权利要求2的组合物，其中所述类黄酮糖苷配基选自芹菜苷配基、木犀草素、槲皮素、山奈黄素、杨梅黄酮、柚皮素、生松素、橙皮素、染料木黄酮及其混合物。4.根据前述权利要求任一项的组合物，其中所述类黄酮单葡糖苷选自木犀草素-7-葡糖苷、芳:菜苷配基_8_C_匍糖苷、山奈黄素-7-0-匍糖苷、山奈黄素-3-0-匍糖苷、柚皮素-7-0-葡糖苷、大豆糖苷配基-8-葡糖苷、矢车菊苷元-3-葡糖苷、槲皮素-3-葡糖苷、天竺葵色素-3-葡糖苷、锦葵色素-3-葡糖苷、飞燕草色素-3-葡糖苷及其混合物。5.根据前述权利要求任一项的组合物，其中类黄酮糖苷配基与类黄酮单葡糖苷的摩尔比的范围为4:1至1:4，优选3:1至1:3，最优选2:1至1:2。6.根据前述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物包含按重量计不多于50%，优选不多于10%，最优选不多于2%的类黄酮糖苷配基。7.根据前述权利要求任一项的组合物，其中所述组合物包含按重量计不多于50%，优选不多于10%，最优选不多于2%的类黄酮单葡糖苷。8.根据前述权利要求任一项的组合物，其为日剂量形式，所述日剂量包含至少50微摩尔，优选至少100微摩尔，最优选至少250微摩尔的类黄酮糖苷配基和至少50微摩尔，优选至少100微摩尔，最优选至少250微摩尔的类黄酮单葡糖苷。9.降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应的方法，包括步骤:(a)由所述非糖尿病人口服前述权利要求任一项的组合物；和(b)由所述非糖尿病人口服糖类；其中步骤(a)与步骤(b)同时、提前O至90，优选O至60分钟或延后O至30分钟，且其中所述糖类包含葡萄糖或是葡萄糖。10.治疗需要其的人的2型糖尿病的方法，所述方法包括步骤:(a)由所述需要其的人口服权利要求1至8任一项的组合物；和(b)由所述需要其的人口服糖类；其中步骤(a)与步骤(b)同时、提前O至90，优选O至60分钟或延后O至30分钟，且其中所述糖类包含葡萄糖或是葡萄糖。11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中所述糖类可选自多糖、寡糖、二糖、单糖及其混合物。12.根据权利要求1至8任一项的组合物，其用于降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应。13.根据权利要求1至8任一项的组合物，其用于治疗2型糖尿病。14.根据权利要求1至8任一项的组合物用于制造降低非糖尿病人的餐后血糖峰值幅度或血糖反应的药剂的用途。15.根据权利要求1至8任一项的组合物用于制造治疗2型糖尿病的药剂的用途。【文档编号】A23L1/30GK103813723SQ201280027352【公开日】2014年5月21日申请日期:2012年5月29日优先权日:2011年6月6日【发明者】M.J.贝里,M.I.福勒,A.D.希思申请人:荷兰联合利华有限公司