专利名称：用于产生戊烯二酸的方法
用于产生戊烯二酸的方法本发明涉及通过培养共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物来进行不饱和二羧酸的生物催化产生的方法。本发明还涉及对应的重组宿主，适合用于制备这类宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及利用通过该生物催化产生方法获得的该二羧酸来制备聚合物，例如聚酰胺或聚酯共聚物的方法。
背景技术：
戊烯二酸是累积在患有I型戊二酸血症的个体中的a，￠-不饱和C5 二羧酸(2-戍烯二酸)(Hoffmann GF, Zschocke J (1999) Glutaric aciduria type I :fromclinical，biochemical and molecular diversity to successful therapy. JInheritMetab Dis 22:381-391)。戊烯二酸与二胺一起可以聚合为涉及Nylon 的聚酰胺。用于戊烯二酸的生物技术产生的理想材料可以是可以通过糖发酵产生的谷氨酸。化学脱氨基a-氨基酸为a，￠-不饱和酸非常困难。相反，严格厌氧菌发酵氨基酸球菌 (Acidaminococcus fermentans)和共生梭菌(Clostridium symbiosum)可以容易地通过a-氧代戊二酸、(R)-2-羟基戊二酸、(R)-2-羟基戊二酰辅酶A和戊烯二酰辅酶A脱氨基谷氨酸为(E)-戍烯二酸(Buckel W(2001b) Unusual enzymes involved in five pathwaysofglutamate fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 57 :263-273)。发酵氨基酸球菌和共生梭菌不适合用于戊烯二酸的产生，因为它们脱羧基戊烯二酰辅酶A为巴豆酰辅酶A。尚未建立起这些生物的遗传操作。因此，不能将编码戊烯二酰辅酶A脱羧酶的基因减弱至低水平，而彻底缺失将剥夺这些生物产生ATP的能力。此外，最终的目的是不从谷氨酸，而从发酵氨基酸球菌和共生梭菌不能在其上生长的葡萄糖产生戊烯二酸。因此，本发明的目的是提供用于戊烯二酸和相关二羧酸或其对应的盐的发酵性生物催化产生的适宜方法。附图
描述图I显示戊烯二酸产生的途径。用1、2和3编号最后的步骤的酶。I :2_羟基戊二酸脱氢酶；2 :戊烯二酸辅酶A转移酶；3 :2_羟基戊二酰辅酶A脱水酶。图2图示其中插入2-羟基戊二酸脱氢酶(hgdH)和戊烯二酸辅酶A转移酶(gctAB)(亚基A和B)的编码序列(图2B)的重组质粒pACY⑶uet-1 (图2A)的构建。图3图示其中插入2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(亚基hdgA和hgdB)及其激活蛋白(activator, hdgC)的编码序列(图3B)的重组质粒pASK_IBA3plus (图3A)的构建。发明概述通过本发明教导的用于产生不饱和二羧酸化合物，如戊烯二酸或结构上类似的戊烯二酸化合物(式I)的生物催化方法来解决上述问题，该方法包括在共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物中转化对应的2-羟基取代的二羧酸，以便形成该不饱和二羧酸。例如，为了将大肠杆菌(Escherichia coli)转化为戊烯二酸生产者，本发明人表达了编码2-羟基戊二酸脱氢酶(HgdA，图I中的I)、戊烯二酸辅酶A转移酶(GcdAB，2)、2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(HgdAB，3)及其激活蛋白(HgdC，3)的六个基因。该新途径可以在衍生自葡萄糖的a -氧代戊二酸处经Embden-Meyerhof途径和柠檬酸循环转向。发明详述I.优选实施方案在本发明的第一实施方案中，提供用于产生通式I的不饱和二羧酸化合物的生物催化方法，尤其是这种化合物的E形式的生物催化方法HOOC-CH = CH-X-COOH (I)其中，X代表优选具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链、任选不饱和、任选取代的烃基；
该方法包括-在允许形成希望的产物的条件下，且尤其是或任选在存在辅酶A(CoA)源，如脂酰辅酶A，如C2-C6脂酰辅酶A，且尤其是乙酰辅酶A的情况下(该辅酶A源可以具有任意来源，如对该微生物而言是内源的，即由该微生物产生，或者外源的，即加至该微生物或产生培养基)，和/或任选在存在形成式I的化合物所需或改善式I化合物的形成的任意其他外源或内源因子的情况下，在共表达戊烯二酸辅酶A转移酶(E. C. 2. 8. 3.12)和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物中转化2-羟基取代的二羧酸III化合物，以便形成该式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III)其中X如上文所定义；-和任选各自以其盐的形式或作为游离酸，以基本上纯的立体异构体的形式(例如Z形式或尤其是E形式)或作为立体异构体的混合物分离该式I的化合物。在式I的化合物中，该基团X优选可以选自n是从I至4的整数的(CH2)n、CH =CH、CH2-C ( = 0)或 CH = C (OH)。尤其是，X 选自 CH2、C2H4' CH = CH 和 CH = C (OH)。根据本发明，优选通过该重组微生物在2-羟基戊二酸脱氢酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的转化中形成该2-羟基取代的二羧酸III :HOOC-C ( = 0) -CH2-X-COOH (II)其中X定义于上文。尤其是，该重组微生物可以也共表达该2-羟基戊二酸脱氢酶。在本发明的该方法中，将该式II的氧代-二羧酸化合物加至该重组微生物或通过该重组微生物发酵性产生该式II的氧代-二羧酸化合物。尤其是，本发明的方法包括培养至少一个重组微生物，该微生物衍生自亲本微生物，该亲本微生物具有产生该式II的2-氧代-二羧酸化合物作为代谢途径的中间产物的能力，还具有异源表达上述酶和蛋白质中的至少一个的能力。例如，该微生物是代谢谷氨酸和/或葡萄糖的需氧或厌氧重组菌，且该式II的化合物是通过谷氨酸(例如通过谷氨酸脱氢酶的作用)和/或葡萄糖(例如通过Embden-Meyerhof途径和Krebs或朽1檬酸循环)的生物降解形成的2-氧代戊二酸。为了进一步辅助或改善目的产物的形成，和/或减少或避免否者将减少或降低由该微生物形成的目的产物的实际量或浓度的不希望的副产物或次级产物(通过目的产物的代谢形成)的形成，根据需要，可以失调涉及该谷氨酸或葡萄糖代谢的一种或多种，例如2、3、4或5种个体酶。尤其是,该代谢谷氨酸和/或葡萄糖的重组菌选自埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，例如大肠杆菌，如菌株大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL菌株(Stratgene)。还可以去除负责氯霉素抗性的CodonPlus质粒。在本发明的方法的具体实施方案中，该2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统包含
2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(E.C.4.2. I.)和任选包含该酶的激活蛋白(如果为诱导和/或维持预期的脱水酶活性所需)。该激活蛋白可以为建立脱水酶活性所需。根据本发明，该酶和蛋白质(戊烯二酸辅酶A转移酶、2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶、激活蛋白、2-羟基戊二酸脱氢酶)具有原核或真核来源。尤其是，它们可以源自不同的微生物属或菌株。例如，并非绝对要求用于建立脱水酶活性的脱水酶和激活蛋白源自相同的微生物属或菌株，只要该激活蛋白与用于生物转化反应的脱水酶相配合(激活脱水酶)。在具体实施方案中，该酶和激活蛋白源自相同或不同的能够将谷氨酸转化为戍烯二酸的厌氧菌。例如，该厌氧菌选自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)或消化链球菌属(Peptostreptococcus)的 细菌，尤其是发酵氨基酸球菌、共生梭菌、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、包括所有亚种的具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)或不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asacch arolyticus)。尤其是，该2-羟基戊二酸脱氢酶(HgdH)包含以下中的至少一个氨基酸序列SEQ ID NO :16 (FN0487,注释为D-乳酸脱氢酶-具核梭杆菌具核亚种(Fusobacteriumnucleatum subsp. nucleatum) ATCC 25586 ；GeneID :991766)或 SEQ ID NO :2 (1XDW_A (发酵氨基酸球菌))；或与该序列中的至少一个具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99 %序列同一性，且仍保持预期的酶活性(或功能)，即可以作为HgdH酶应用的序列；例如，该酶可以是同二聚体，例如发酵氨基酸球菌酶；例如与来自具核梭杆菌的酶显示61%序列同一性的发酵氨基酸球菌酶。尤其是，可以是异八聚体(a J4)的该戊烯二酸辅酶A转移酶(GctAB)(a)包含至少一个a (A)亚基和至少一个P (B)亚基，其中该a亚基包含SEQ IDNO 4的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该P亚基包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为GctAB酶应用；或(b)包含至少一个a亚基和至少一个0亚基，其中该a亚基包含SEQ IDNO 22的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该P亚基包含SEQ ID NO :24的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为GctAB酶应用；或(c)包含至少一个a亚基和至少一个0亚基，其中该a亚基包含SEQ IDNO :18的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该P亚基包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为GctAB酶应用。尤其是，可以是每个A亚基和每个B亚基中具有一个[4Fe_4S]簇的异二聚体(AB)或三聚体(ABD)的该2-羟基戊二酸辅酶A脱水酶(a)包含至少一个a (A)亚基和至少一个P (B)亚基，其中该a亚基包含SEQ IDNO 26的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该P亚基包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为脱水酶应用；或(b)包含至少一个a (A)亚基、至少一个@⑶亚基和至少一个8⑶亚基，其中该a亚基包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该^亚基包含SEQ IDNO 32的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该\亚基包含SEQ IDNO :34的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为脱水酶应用；或(c)包含至少一个a亚基和至少一个0亚基，其中该a亚基包含SEQ IDNO 8的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；其中该P亚基包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列或与该序列具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性，即可以作为脱水酶应用。尤其是，该激活蛋白包含SEQ ID NO :12、36或38中的至少一个氨基酸序列或与该序列中的至少一个具有至少50%序列同一性，例如至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的活性，即可以作为脱水酶激活蛋白应用；且可以是在两个亚基之间具有[4Fe-4S]簇的同二聚体。
在另一具体实施方案中，该2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶来自共生梭菌(SEQ IDN0:8和/或10);而该2-羟基戊二酸脱氢酶(SEQ ID NO :2)、该戊烯二酸辅酶A转移酶(SEQID NO :4和/或6)和该激活蛋白(SEQ IDNO 12)来自发酵氨基酸球菌；或者彼此独立地从其衍生，并具有与亲本序列至少50%同一，例如具有至少60、70、80、85、90、92、95、96、97、98或99%序列同一性的序列；且仍保持预期的酶活性或激活蛋白活性。该蛋白质可以以活性四级结构的形式存在，或者可以以其活性片段或亚基的形式存在。此外，该蛋白质和酶可以各自由核酸序列编码，该核酸序列适合于具有产生该式II的2-氧代-二羧酸的能力的该微生物的密码子选择。此外，该蛋白质和酶可以由包含于单个或多个表达载体中的核酸序列编码，该核酸序列可以在该载体中编码为单个或多个拷贝。此外，该共表达的蛋白质中的至少一个对该重组微生物而言是异源的。本发明还涉及-表达盒，其包含编码上文定义的酶或蛋白质的至少两个不同核酸序列(即编码通过式III的化合物产生式I的化合物所必需的酶/蛋白质组(或亚组)所需的序列组(或亚组))的组合，该序列与至少一个调节核酸序列有效连接；-重组载体，其包含该表达盒中的至少一个；-用至少一个这种载体转化的重组原核或真核宿主。
尤其是，这类重组宿主具有产生式(II)的2-氧代-二羧酸化合物的能力，该式
(II)的2-氧代-二羧酸化合物通过由该至少一个载体编码的该表达产物的表达转化为式(I)的化合物。例如，该宿主可以是埃希氏菌属的细菌的重组菌株。在另一实施方案中，本发明涉及制备聚酰胺或聚酯的方法，该方法包括a)通过本文中所述的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物；b)分离该化合物，任选随后氢化，以去除C = C双键；和c)使步骤b)获得的该化合物与至少一个适宜的多价可聚合胺单体或多价可聚合羟基化合物聚合。尤其是，该多胺是二胺、三胺或其混合物，且该多价羟基化合物是二醇或三醇或其 混合物。例如，可以在存在适宜的催化剂，例如酸或碱催化剂的情况下进行该聚合反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备聚合物的方法，该方法包括a)通过上文定义的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物；b)分离该化合物；和c)使步骤b)获得的该化合物与至少一个适宜的不饱和可聚合单体聚合。例如，可以在存在适宜的自由基引发剂的情况下进行该聚合。适宜的共聚单体是可以应用于自由基引发的聚合的那些，例如包含至少一个可聚合的C = C键的单体，如乙烯基、丙稀基和甲基丙稀基。在本文中所述的方法的另一实施方案中，为了进一步优化本发明的方法，可以失调(上调或下调)该重组微生物中直接或间接影响式(I)、(II)或(III)的至少一种化合物的形成和/或分解的生物合成途径的至少一个基因，例如1、2、3或4个基因。2.具体术语的解释除非另有说明，认为表述“戊烯二酸”或表述“戊烯二酸化合物”或表述“不饱和二羧酸”或“不饱和二羧酸化合物”是同义词。本发明获得的(式I的)戊烯二酸或二羧酸化合物可以是游离酸的形式、该酸的部分或完全盐(complete salt)的形式、或酸和其盐的混合物的形式。二羧酸“盐”包含例如金属盐，例如戊烯二酸锌；该酸的一或二碱金属盐，如一钠盐、二钠盐、一钾盐和二钾盐；以及碱土金属盐，例如钙盐或镁盐。术语“生物催化方法”指在存在本文中定义的酶的催化活性的情况下，即在存在分离的纯酶或粗酶、或含有或表达这种酶活性的整个微生物细胞的情况下进行的任意方法。术语“立体特异性的”意指通过酶以至少90% ee、优选至少95% ee、尤其是至少98% ee或至少99% ee的高对映体过量或纯度形成几种立体异构体或对映体中的一种。按照下式计算ee%值ee%= [XA_XB]/[XA+XB] * 100其中，Xa和Xb分别指对映体A或B的摩尔分数。“立体异构体”的实例是E异构体和Z异构体或R对映体和S对映体。必须以它最广泛的意义理解“失调”，且其包括通过本领域技术人员公知的不同手段提高或降低或完全关闭酶(靶酶)活性。适宜的方法包括，例如，增加或减少基因和/或酶分子在生物中的拷贝数，或修饰影响其酶活性的酶的另一特征，然后其对所讨论的代谢途径或与该途径偶联的任意途径或酶促反应产生希望的作用。适宜的遗传操作还可以包括但不限于改变或修饰与特定基因的表达相关的调节序列或位点(例如通过去除强启动子、诱导型启动子或多重启动子)；修饰特定基因的染色体定位；改变邻近特定基因的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子；减少特定基因的拷贝数；修饰涉及特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如调节蛋白、阻抑蛋白、增强子、转录激活因子等)；或本领域中常规的失调特定基因的表达的其他常规手段(包括但不限于反义核酸分子的使用)；或敲除或阻断靶蛋白的表达的其他方法。“扩增”的优选方式是“向上”突变，其例如通过使用强表达信号的基因扩增和/或增强酶活性的点突变来提高基因活性。“弱化”的优选方式是“向下”突变，其例如通过使用弱表达信号的基因缺失或破坏和/或破坏或降低酶活性的点突变来降低基因活性。术语“异源的”或“外源的”指本文中所述的序列，其由本文中定义的经遗传操作的微生物引入或产生(转录或翻译)，且该微生物在该操作前不包含或不产生该序列。具体而言，该微生物在该操作前不包含或表达该异源酶活性，或可以包含或表达具有可比较的 活性或特异性的内源酶，该内源酶由不同的编码序列或由不同氨基酸序列的酶编码，且该内源酶可以与该外源酶转化相同的底物。本发明的“亲本”微生物是具有产生式(II)的化合物作为中间产物的能力的任意微生物。“中间产物”理解为以并非必然在分析上可直接检测的浓度在化学或生化过程期间瞬时地或持续地形成的产物。可以通过第二化学或生化反应从该生化过程去除该“中间产物”。“重组宿主”可以是包含克隆载体或表达载体的任意原核或真核细胞。此术语还意在包含已在遗传上改造为在宿主细胞的染色体或基因组中包含所克隆的基因的那些原核或真核细胞。适宜的宿主的实例见Sambrook等，MOLECULAR CLONING A LABORATORYMANUAL,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。术语“重组微生物”包含已在遗传上对其进行改变、修饰或改造(例如遗传改造)，使得它与其所衍生自的天然存在的微生物或“亲本”微生物相比显示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表现型(例如在遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的微生物(例如细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。如本文中所使用，“基本上纯的”蛋白质或酶意指希望的纯化的蛋白质基本上游离于污染细胞成分，如通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带所证明。术语“基本上纯的”还意在描述这样的分子，其因本领域技术人员使用的一个或多个纯度特征或同质性特征而是同质的。例如，就诸如以下的参数而言，基本上纯的酶或蛋白质将在标准实验偏差内显示恒定和可再现的特征分子量、层析迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封闭或未封闭的N端、HPLC洗脱图、生物学活性及其他这类参数。但是，该术语并非意在排除该酶或蛋白质与其他化合物的人工或合成混合物。此外，该术语并非意在排除任选分离自重组宿主的融合蛋白质。3.本发明的其他实施方案3. I本发明的蛋白质本发明不限于明确提到的酶/蛋白质，还扩展至其功能等同物。
具体地公开的酶在本发明的范围内的“功能等同物”或“类似物”或“功能突变”是其此外还具有希望的生物学功能或活性，例如酶活性的多种多肽。例如，“功能等同物”意指这样的酶，其在用于酶活性的测试中显示比本文中定义的酶高或低至少1-10%、或至少20%、或至少50%、或至少75%、或至少90%的活性。本发明的“功能等同物”还尤其意指突变体，其在上文所述的氨基酸序列的至少一个序列位置中具有与具体地指出的氨基酸不同的氨基酸，但仍具有上述生物学活性之一。因此，“功能等同物”包含可通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体，其中所述改变可以发生在任意序列位置中，只要它们产生具有本发明的特性谱的突变体。如果反应性模式在突变体和未改变的多肽间性质上一致，即如果例如以不同的速率转化相同的底物，则也尤其提供功能等价性。适宜的氨基酸取代的实例显示在下表中
原始残基取代的实例
AlaSer
ArgLys
AsnGin; His
AspGlu
CysSer
GlnAsn
GluAsp
GlyPr。
HisAsn ; Gln
NeLeu; Val
LeuNe; Val
LysArg ; Gln ; Glu
MetLeu ; Ne
PheMet; Leu ; Tyr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp ; Phe
ValHe; Leu以上意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”，以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。在该情况下，“前体”是多肽的具有或不具有希望的生物学活性的天然前体或合成前体。表述“盐”意指本发明的蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以已知的方式产生，且包含无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，及与有机碱，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。本发明还涵盖酸加成盐，例如与无机酸，如盐酸或硫酸的盐，及与有机酸，如乙酸和草酸的盐。还可以用已知技术在功能氨基酸侧基上或在它们的N端或C端产生本发明的多肽的“功能衍生物”。这类衍生物包含例如可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得的羧酸基团的脂肪族酯、羧酸基团的酰胺；通过与酰基反应产生的自由氨基的N-酰胺衍生物；或通过与酰基反应产生的自由羟基的0-酰基衍生物。“功能等同物”还天然包含可以从其他生物获得的多肽，以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较确定同源序列区的区域，且可以根据本发明的具体参数测定等同的酶。“功能等同物”还包含本发明的多肽的片段，优选单个结构域或序列基序，其例如显示希望的生物学功能。此外，“功能等同物”是融合蛋白质，其具有处于功能性N端或C端结合(即无融合蛋白质部分的实质性相互功能缺损)中的上述多肽序列或从上述多肽序列衍生的功能等同物之一及至少一个功能上不同的其他异源序列。这些异源序列的非限制性实例是例如信号肽、组氨酸锚或酶。还包含于本发明中的“功能等同物”是具体地公开的蛋白质的同源物。这些具有上文所述的百分比同一性值。该值指与具体地公开的氨基酸序列的同一性，且可以按照Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8)，1988, 2444-2448 的算法计算。还可以从BLAST比对、算法blastp (蛋白质-蛋白质BLAST)或通过应用下文给出的Clustal设置来计算％同一丨I"生值。本发明的同源序列的百分比同一性尤其意指相对于本文中具体地公开的氨基酸序列之一的总长度的氨基酸残基百分比同一性。 在可能的蛋白质糖基化的情况下，本发明的“功能等同物”包含去糖基化或糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式获得的修饰形式的上文指定的类型的蛋白质。可以通过诱变，例如通过蛋白质的点突变、加长或缩短来产生本发明的蛋白质或多肽的这类功能等同物或同源物。可以通过筛选突变体，例如缩短突变体的组合数据库来鉴定本发明的蛋白质的这类功能等同物或同源物。例如，可以通过核酸水平的组合诱变来产生蛋白质变体的多变数据库，例如通过酶促连接合成的寡核苷酸的混合物。存在可以用于从简并寡核苷酸序列产生可能的同源物的数据库的许多方法。可以在自动化DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后可以将合成的基因连接入适宜的表达载体。简并基因组的使用使得可能在编码希望的可能的蛋白质序列组的混合物中提供所有序列。简并寡核苷酸的合成方法为本领域技术人员已知(例如 Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39 :3 ;Itakura 等.(1984) Annu.Rev. Biochem. 53 :323 ;Itakura 等.(1984)Science 198 :1056 ;Ike 等.(1983)NucleicAcids Res. 11 :477)。在现有技术中，已知几种用于筛选通过点突变或缩短产生的组合数据库的基因产物，及用于以选择的特性筛选基因产物的cDNA文库的技术。可以修改这些技术用于快速筛选通过本发明的同源物的组合诱变产生的基因库。基于高通量分析的最常用于筛选大基因库的技术包括将基因库克隆在可以复制的表达载体中，用产生的载体数据库转化适宜的细胞，并在这样的条件下表达组合基因，在该条件中，希望活性的检测便于载体的分离，该载体编码检测其产物的基因。为了鉴定同源物，可以将提高功能突变体在数据库中的频率的技术Recursive Ensemble Mutagenesis (REM)与筛选测试组合使用(Arkin和 Yourvan(1992)PNAS 89 :7811-7815 ;Delgrave 等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。3. 2编码核酸序列本发明还涉及编码本文中定义的酶/蛋白质的核酸序列。本发明还涉及与本文中明确公开的序列具有某种程度的“同一性”的核酸。两个核酸间的“同一性”意指每种情况下核酸全长内的核苷酸同一性。例如，可以利用来自Informax(USA)公司的Vector NTI Suite 7. I程序计算同一性，该程序按以下设置利用 Clustal Method (HigginsDG, Sharp PM. Fast and sensitive
multiple sequence alignments on amicrocomputer.Comput Appl. Biosci. 1989 年 4 月；5(2) :151-1)多重比对参数
缺口开放罚分10
缺口延伸罚分10
缺口分开罚分范围8 缺口分开罚分关 比对延迟的％同一性40
残基特异性缺口关
亲水残基缺口关
转换权重0配对比对参数
FAST算法开
K 元组大小(tuplesize)I
缺口罚分3
窗口大小5
最佳对角线的数目5备选地，可以按照Chenna、Ramu、Sugawara、Hideaki、Koike、Tadashi、Lopez、Rodrigo、Gibson、Toby J、Higgins、Desmond G、Thompson、Julie D. Multiple sequencealignment with the Clustal series ofprograms. (2003)Nucleic Acids Res 31(13)3497-500，网页 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw/index, html# 和以下设置测定同
一性DNA缺口开放罚分15.0
DNA缺口延伸罚分6.66
DNA矩阵同一性
蛋白质缺口开放罚分10.0
蛋白质缺口延伸罚分0.2
蛋白质矩阵Gonnet 蛋白质/DNA ENDGAP -I
蛋白质/DNA GAPDIST 4
可以通过从核苷酸构件化学合成，例如通过双螺旋的单个重叠、互补的核酸构件的片段缩合，以已知的方式产生本文中提到的所有核酸序列(单链和双链的DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。可以例如通过亚磷酰胺(phosphoamidite)法(Voet, Voet,第二版,Wiley Press, New York, pages 896-897),以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。利用DNA聚合酶的Klenow片段累积合成的寡核苷酸和填充缺口和连接反应，以及一般的克隆技术描述于Sambrook等(1989)中，见下文。本发明还涉及编码以上多肽之一的核酸序列(单链和双链的DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)及其可以例如用人工核苷酸类似物获得的功能等同物。本发明涉及分离的核酸分子(其编码本发明的多肽或蛋白质或其具有生物学活性的片段)和核酸片段(其可以例如用作用于鉴定或扩增本发明的编码核酸的杂交探针或引物)二者。此外，本发明的核酸分子可以包含来自编码遗传区的3'和/或5'端的非翻译序列。本发明还涉及与具体地描述的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。本发明的核苷酸序列使得可能产生可以用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。这类探针或引物一般包含在“严格”条件(见下文)下杂交在本发明的核酸序列的有义链或对应的反义链的至少约12、优选至少约25，例如约40、50或75个连续的核苷酸上的核苷酸序列区。“分离的”核酸分子是从该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子分开的，此外，如果它是通过重组技术产生的，则可以基本上游离于其他细胞物质或培养基，或者如果它是化学合成的，则可以游离于化学前体或其他化学品。可以利用标准分子生物学技术和本发明提供的序列信息分离本发明的核酸分子。例如，可以用具体地公开的全序列之一或其片段作为杂交探针并使用标准杂交技术(例如Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989中所述),从适宜的cDNA文库分离cDNA。此外，可以使用根据此序列构建的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应分离包含所公开的序列之一或其片段的核酸分子。可以将以此方式扩增的核酸克隆入适宜的载体中，并可以通过DNA测序来表征。还可以例如使用自动化DNA合成仪，通过标准合成方法产生本发明的寡核苷酸。例如通过基因组文库或cDNA文库，可以例如通过常用的杂交技术或PCR技术从其他细菌分离本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分。这些DNA序列在标准条件中与本发明的序列杂交。“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件中与几乎互补的序列结合的能力，而在这些条件中不发生非互补配偶体间的非特异性结合。为此，序列可以90-100%互补。互补序列能够相互特异性结合的特性用于例如Northern印迹或Southern印迹中、或PCR或RT-PCR中的引物结合中。有利地用保守区的短寡核苷酸进行杂交。但是，还可能用本发明的核酸的更长的片段或全序列进行杂交。这些标准条件取决于所使用的核酸(寡核苷酸、更长的片段或全序列)或取决于用哪种类型的核酸(DNA或RNA)进行杂交而不同。例如，DNA DNA杂交体的解链温度比相同长度的DNA RNA杂交体的解链温度低约10°C。
例如，取决于具体核酸，标准条件意指温度在42°C和58°C之间、在具有0. I至5 X SSC (I X SSC = 0. 15 M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7. 2)间的浓度的含水缓冲溶液中或还在存在50%甲酰胺的情况下，例如42°C，在5XSSC、50%甲酰胺中。有利地，用于DNA DNA杂交体的杂交条件是0. IXSSC和约20°C至45°C间，优选约30°C至45°C间的温度。对于DNA RNA杂交体，杂交条件有利地是0. I X SSC和约30°C至55°C间，优选约45°C至55°C间的温度。这些指出的用于杂交的温度是针对具有约100个核苷酸的长度和50%的G+C含量的核酸计算的不存在甲酰胺的情况下的解链温度值的实例。用于DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学教科书，例如Samtoook等，1989中，且可以例如取决于核酸的长度、杂交体的类型或G+C含量，用本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员可以从以下教科书获得关于杂交的其他信息Ausubel等(编辑)，1985, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York ;Hames 和 Higgins (编辑)，1985, Nucleic AcidsHybridization A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,Oxford ;Brown (编辑)，1991, Essential Molecular Biology A Practical Approach, IRLPress at Oxford University Press, Oxford。尤其可以在严格条件下进行“杂交”。这类杂交条件例如描述于Sambrook，J.，Fritsch, E. F. , Maniatis, T. Molecular Cloning (A Laboratory Manual),第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989,第 9. 31-9. 57 页中或 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6 中。“严格”杂交条件尤其意指于42°C在由50%甲酰胺、5父35((7501111似(1，751111柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7. 6) ,5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性的剪切鲑精DNA组成的溶液中过夜孵育，然后于65°C用0. IXSSC洗涤滤膜三次。本发明还涉及具体地公开或可衍生的核酸序列的衍生物。因此，本发明的其他核酸序列可以衍生自本文中明确公开的序列，并因单个或几个核苷酸的添加、取代、插入或缺失而与它不同，且编码具有希望的特性谱的多肽。本发明还包含含有所谓的沉默突变或与具体地指出的序列相比，已按照特殊最初生物或宿主生物的密码子选择改变的核酸序列，及其天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。
它还涉及可以通过保守氨基酸取代(例如通过具有相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸取代所讨论的氨基酸)获得的序列。本发明还涉及通过序列多态性衍生自具体地公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以由于天然变异而在群体内的个体间存在。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列中产生1-5%的变异。本发明的核酸序列的衍生物意指例如等位基因变体，其在全序列范围内在所衍生的氨基酸水平具有至少60%同源性、优选至少80%同源性、尤其优选至少90%同源性(关于氨基酸水平的同源性，应参考上文针对多肽给出的详细内容)。有利地，在序列的部分区域内，同源性可以更高。此外，衍生物还将理解为本发明的核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌的同源物，缩短的序列，编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，在本文中明确公开的序列中给出的整个DNA区域内，同源物在DNA水平具有至少40%、优选至少60%、尤其优选至少70%、更尤其优选至少80%的同源性。 此外，衍生物还将理解为例如与启动子的融合。可以通过至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失来修饰添加至所述核酸序列的启动子，但不损伤该启动子的功能性或效力。此外，可以通过改变其序列或可以与甚至不同属的生物的更有效的启动子完全交换来提高启动子的效力。3. 3功能突变体的制备本领域的读者还意识到产生功能突变体的方法。取决于所应用的技术，本领域的读者可以在基因或非编码核酸区域(其例如可以对调节基因表达具有重要性)中产生随意突变或定向突变，然后可以产生适宜的基因文库。因此所需的分子生物学方法都是本领域公知的，并例如由Sambrook和Russell，Molecular Cloning.第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 描述。对本领域的读者而言，修饰基因并因而修饰编码的蛋白质的方法是公知的，例如-位点专一诱变，其中特异性取代基因的单个或多个核苷酸(Tix)WerMK(编辑)1996;In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)；-饱和诱变，其中可以在基因的任意位置中交换或添加任意氨基酸的密码子(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994)Nucleic Acids Res22 :1593 ；BarettinoD, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22 :541 ；BarikS (1995)Mol Biotechnol 3:1);-易错聚合酶链反应(PCR)，其中通过不正确地执行功能的DNA聚合酶的作用突变核苷酸序列(Eckert KA, Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18 :3739)；-SeSaM法(序列饱和法(Sequence Saturation Method)),其中通过聚合酶避免优选的取代(Schenk 等，Biospektrum,第 3 卷,2006, 277-279)；-基因在增变菌株中的传代，例如由缺损的DNA修复机制看来，该菌株显示核苷酸序列的增加的突变发生(GreenerA, Callahan M, Jerpseth B(1996)An efficient randommutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In Trower MK(Hrsg. ) Invitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey);或
-DNA混编，其中形成并消化一组密切相关的基因，其中用片段作为模板进行PCR反应，其中形成全长嵌合基因(Ste_er WPC(1994)Nature370 389 ；Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91 :10747)。通过应用所谓的定向进化技术(参见例如Reetz MT和Jaeger K-E (1999),Topics Curr Chem 200 31 ；Zhao H，Moore JC, Volkov AA, Arnold FH(1999), Methodsfor optimizing industrial enzymes by directed evolution, In Demain AL, DaviesJE(Hrsg. )Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Societyfor Microbiology),本领域的读者将能够特异性大规模制备功能突变体。在第一步骤中，例如通过应用上述方法中的任一种来产生具体蛋白质的文库。然后例如通过应用细菌或噬菌体展示系统来表达该文库。可以选择表达显示希望的特征谱的功能突变体的那些基因，并进行进一步突变。可以迭代地重复突变和选择或筛选的步骤，直至所获得的突变体之一显示希望的特征谱。可以通过迭代法进行有限数目的突变，例如I至5个突变，并可以评价它们对所讨 论的酶特征的影响，并可以逐步选择进一步改善的突变体。然后可以以基本上相同的方式对该选择的突变体进行进一步突变。可以以此方式显著减少待评价的单突变体的数目。本发明的教导提供关于所讨论的酶/蛋白质的结构和序列的重要信息，根据这些信息，将可能产生具有希望的修饰特征谱的其他酶/蛋白质。尤其是，可以确定所谓的热点(即序列区)，其潜在地可以适合进一步突变，以修饰或产生希望的酶/蛋白质特征。3. 4本发明的构建体本发明还涉及在调节核酸序列的遗传控制下包含编码本发明的多肽或融合蛋白质的核酸序列的表达构建体；以及包含这些表达构建体中的至少一个的载体。根据本发明，“表达单元”意指具有表达活性的核酸，其包含本文中定义，并在与待表达的核酸或基因功能性结合后调节表达(即此核酸或此基因的转录和翻译)的启动子。因此，在此背景中，它还称为“调节核酸序列”。除启动子外，还可以存在其他调节元件，例如增强子。根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”意指与待表达的核酸或待表达的基因功能性结合的表达单元。因此，与表达单元不同，表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含将由于转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。在本发明的背景中，术语“表达”或“过量表达”描述由对应的DNA编码的微生物中的一种或多种酶的胞内活性的产生或增加。为此，可能将基因插入生物中、通过另一基因取代现有基因、增加一个或多个基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码对应的具有高活性的酶的基因，且可以任选组合这些措施。优选地，本发明的这类构建体包含各编码序列5'上游的启动子和3'下游的终止序列及任选包含其他常用的调节元件(在每种情况下与编码序列功能性连接)。根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”意指与待转录的核酸功能性结合并调节此核酸的转录的核酸。在此背景中，“功能性”或“有效”结合意指例如具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列及任选其他调节元件(例如使得能够转录核酸的核酸序列和例如终止子)以这样的方式顺次排列，使得各调节元件可以在核酸序列的转录中执行其功能。这并非必然需要化学意义上的直接结合。遗传控制序列，如增强子序列还可以从更远的位置或甚至从其他DNA分子发挥其对靶序列的功能。优选其中将待转录的核酸序列放置在启动子序列之后(即在3'端)，使得两个序列相互共价结合的排列。启动子序列和待通过转基因表达的核酸序列间的距离可以少于200bp (碱基对)、或少于IOObp或少于50bp。除启动子和终止子外，可以提到的其他调节元件的实例是前导序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列描述于例如Goeddel，Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA (1990)中。本发明的核酸构建体尤其包含选自本文中明确提到的那些或其衍生物和同源物的序列，以及可以从本文中明确提到的氨基酸序列衍生的核酸序列，其有利地与用于控制(例如增加)基因表达的一个或多个调节信号有效结合或功能性结合。除这些调节序列外，这些序列的天然调节仍然可以存在于实际的结构基因之前，并可以任选已在遗传上改变，使得天然调节被关闭，基因的表达增加。核酸构建体还可以具 有更简单的设计，即无任何其他额外的调节信号插入编码序列之前，且未去除天然启动子的调节。反而沉默天然调节序列，使得调节不再发生，并增加基因表达。优选的核酸构建体还有利地包含与启动子功能性结合的前述增强子序列中的一个或多个，其允许增加核酸序列的表达。还可以在DNA序列的3/端插入其他有利的序列，如其他调节元件或终止子。构建体中可以包含本发明的核酸的一个或多个拷贝。构建体还可以包含任选用于对该构建体的选择的其他标记，如抗生素抗性基因或营养缺陷互补基因。适宜的调节序列的实例包含于有利地应用于革兰氏阴性菌中的启动子，如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-> lac-、lpp-lac-、IacIq、_T7_、T5_、T3_、gal-、trc-、ara_、rhaP (rhaPBAD) SP6_、A -Pr-或\ -Pl启动子中。其他有利的调节序列包含于例如革兰氏阳性启动子ace、amy和SP02中，酵母或真菌启动子ADCl、MF a、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。还可以用人工启动子进行调节。为了表达,将核酸构建体有利地在允许基因在宿主中的最佳表达的载体，例如质粒或噬菌体中插入宿主生物。除质粒和噬菌体外,载体还将理解为意指本领域技术人员已知的所有其他载体，例如病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒；转座子；IS元件；噬粒；黏粒；和线状或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或可以通过染色体复制。这些载体代表本发明的另一实施方案。适宜的质粒是，例如，在大肠杆菌中pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223_3、pDHE19. 2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113_Bl、入 gtll 或 pBdCI ;在诺卡氏菌形放线菌(Nocardioform actinomycetes)中pJAM2;在链霉菌属(Streptomyces)中:pIJ101、pIJ364、pIJ702 或 pIJ361 ;在芽孢杆菌属(Bacillus)中:pUB110、pC194 或 pBD214 ;在棒杆菌属(Corynebacterium)中PSA77 或 pAJ667 ;在真菌中pALSl、pIL2 或 pBB116 ;在酵母中2 a M、pAG_l、YEp6、YEp13或 pEMBLYe23 ;或在植物中pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004 或 pDH51。前述质粒代表可能的质粒的少量选择。其他质粒为本领域技术人员公知，并将见于例如书CloningVectors (Pouwels P. H 等编著，Elsevier, Amsterdam-NewYork-Oxford, 1985, ISBN 0 444904018)中。实验部分中还提到了其他适宜的质粒。在载体的另一实施方案中，包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体可以有利地以线状DNA的形式插入微生物中，并通过异源或同源重组整合入宿主生物的基因组中。此线状DNA可以包含线性化载体如质粒或只是本发明的核酸构建体或核酸。为了异源基因在生物中的最佳表达，根据该生物中利用的具体密码子使用改变核酸序列是有利的。可以根据所讨论的生物的其他已知基因的计算机评价容易地测定密码子使用。本发明的表达盒的产生基于适宜的启动子与适宜的编码核苷酸序列和终止子信号或多腺苷酸化信号的融合。为此，使用常用的重组和克隆技术，如例如T. Maniatis、E.F. Fritsch 和 J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)中以及 T. J. Silhavy、M. L. Berman和 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)中和 AusubeI,F. M.等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience (1987)中所述。有利地将重组核酸构建体或基因构建体插入用于在适宜的宿主生物中表达的宿主特异性载体中，以允许基因在宿主中的最佳表达。载体为本领域技术人员公知，并将见于例如“Cloning Vectors^(PouweIs P. H.等，Publ. Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。3. 5本发明的可以使用的宿主取决于背景，术语“微生物”意指起始微生物(野生型)或本发明的遗传上修饰的微生物或二者。根据本发明，术语“野生型”意指对应的起始微生物，且并非必然需要对应于天然存在的生物。利用本发明的载体，可以产生重组微生物，其已例如用本发明的至少一个载体转化，且可以用于本发明的发酵性产生。有利地，将上文所述的本发明的重组构建体插入适宜的宿主系统中并表达。优选地，使用本领域技术人员熟悉的常用的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、反转录病毒转染等，以确保所述核酸在各表达系统中的表达。适宜的系统描述于例如 Current Protocols inMolecular Biology, F. Ausubel 等，Publ. Wiley Interscience,New York 1997 或 Sambrook 等 Molecular Cloning A Laboratory Manual.第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989 中。亲本微生物通常是具有从葡萄糖和/或谷氨酸产生戊烯二酸，尤其是(E)-戊烯二酸的能力的那些。优选地，它们尤其是梭菌目(Clostridiales)和梭杆菌目(Fusobacteriales)的细菌。尤其是，必需提到物种发酵氨基酸球菌(DSM20731)、共生梭菌(DSM 934)、球孢梭菌(DSM 1294)、不解糖消化链球菌(ATCC 14963)和具核梭杆菌具核亚种(DSM 15643)。ATCC指美国典型培养物保藏中心(American type strain culturecollection),而DSM指德国微生物和细菌培养物保藏中心(Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。本发明的宿主生物优选包含本发明中描述的核酸序列、核酸构建体或载体中的至少一个，其编码上文定义的酶活性。3. 6本发明的戊烯二酸产物的发酵性产生本发明涉及用于发酵性产生戊烯二酸和式(I)的相关化合物的方法。可以在分批方法中或在补料分批或反复的补料分批方法中连续或不连续地培养本发明所使用的重组微生物。已知的培养方法的综述将见于Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik I.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag, Stuttgart,1991))中或 Storhas 的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994)中。待使用的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的需要。手册"Manual of Methods for General Bacteriology " of the American Society forBacteriology (Washington D. C. , USA, 1981)中给出了用于多种微生物的培养基的描述。可以按照本发明使用的这些培养基一般包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。优选的碳源是糖类，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。还可以通过复合化合物，如糖蜜，或来自糖精制的其他副产物来向培养基添加糖类。添加多种碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸；醇，如甘油、甲醇或乙醇；和有机酸，如乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的物质。氮源的实例包含氨气或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵；硝酸盐；尿素；氨基酸；或复合氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏等。氮源可以分开使用或作为混合物使用。可以存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钥、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。可以用无机含硫化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，以及有机硫化合物，如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol)作为硫源。可以用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐作为磷源。为了将金属离子保持在溶液中，可以向培养基添加螯合剂。尤其适宜的螯合剂包含二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸；或有机酸，如柠檬酸。本发明使用的发酵培养基还可以包含其他生长因子，如维生素或生长促进剂，其包含例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆素。生长因子和盐通常来自培养基的复合成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可以向培养基添加适宜的前体。培养基中化合物的精确组成强烈地取决于具体的实验，且必须针对每一具体情况单独决定。关于培养基优化的信息可以见于教科书"Applied Microbiol. Physiology, APracticalApproach" (Publ. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997)第 53-73 页，ISBN 0 19963577 3)中。还可以从供应商获得生长培养基，如Standard I (Merck)或BHI (Brainheart infusion, DIFC0)等。
培养基的所有成分都通过加热(2. Obar和121°C下20分钟)或通过无菌过滤消毒。这些成分可以一起消毒，或根据需要分开消毒。培养基的所有成分可以在生长开始时存在，或者任选，可以连续添加或通过分批给料来添加。培养温度通常在15°C和45V之间，优选25°C至40°C，且在实验期间可以保持恒定或可以改变。培养基的pH值应在从5至8. 5的范围内，优选约7. O。可以通过加入碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸来在生长期间控制用于生长的PH值。可以用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯来控制泡沫。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基添加具有选择作用的适宜物质，例如抗生素。可以将氧或含氧气体混合物，例如环境空气送入培养物中，以维持有氧条件。培养物的温度通常从20°C至45°C。连续培养，直至形成最大量的希望的产物。这通常在10小时至160小时内达到。可以任选通过高频超声、通过高压(例如在弗氏压碎器中)、通过渗透裂解(osmolysis)、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用、利用匀浆器或通过所列方法中的几种的组合来破碎细胞。
3. 7产物分离本发明的方法可以进一步包括回收戊烯二酸或相关化合物的步骤。术语“回收”包括从培养基提取、收集、分离或纯化产物。可以按照本领域已知的任意常规分离或纯化方法进行化合物的回收，其包括但不限于用常规树脂(例如阴离子或阳离子交换树脂、非离子型吸附树脂等)处理、用常规吸附剂(例如活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)处理、改变pH、溶剂萃取(例如用常规溶剂，如醇、乙酸乙酯、己烷等)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、PH调节、冻干等。例如，可以通过先去除微生物来从培养基回收戊烯二酸。然后剩余的培养液穿过或经过阳离子交换树脂，以去除不需要的阳离子，然后穿过或经过阴离子交换树脂，以去除不需要的无机阴离子和有机酸。3. 8聚合物在另一方面，本发明提供用于产生聚酯或聚酰胺(例如nylon 或相关聚合物)的方法，其包括上文所述的步骤用于产生戊烯二酸化合物。以已知的方式使戊烯二酸化合物与二胺、三胺或多胺反应来得到聚酰胺，或者与二醇、三醇或多元醇反应来获得聚酯。例如，使戊烯二酸型化合物与含有4至10个碳的多胺或多元醇反应。在另一方面，本发明提供制备聚合物，尤其是共聚物的方法，该方法包括通过其中所述的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物，分离该化合物；并优选在存在聚合引发剂，例如焦硫酸过氧化钠(sodium peroxide disulfate,NAPS)作为自由基引发剂的情况下使该化合物与至少一个适宜的不饱和可聚合单体聚合。作为用于进行以上聚合反应的适宜共聚物的非限制性实例，可以提到多元醇，如乙二醇、丙二醇、甘油、具有2至8个甘油单位的聚甘油、赤藓醇、季戊四醇和山梨醇；多胺，如二胺、三胺和四胺，如乙二胺、丙二胺、丁二胺、新戊二胺、亚己基二胺、辛二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺、二亚己基三胺、氨丙基乙二胺和双氨丙基乙二胺。聚亚烷基多胺也是适宜的多胺。高级多胺可以存在于与二胺的混合物中。有用的二胺包含例如I，2-二氨基乙烷、I，3-二氨基丙烷、I，4-二氨基丁烧、I，5- 二氨基戍烧、1，6- 二氨基己烧、1,8- 二氨基辛烧；
链烯，尤其是C2-C12链烯，其是具有2至12个碳原子的单不饱和直链或支链烃，例如乙稀;1-或2_丙稀；1_、2_和3_ 丁稀；2~甲基-丙稀；1-、2_、3_和4_戍稀；1-、2_、3-、4-和 5-己烯；1-、2-、3-、4-、5-和 6-庚稀；或 1-、2-、3-、4-、5-、6-和 7-羊烯；I-癸烯；
I-十二烯；以及它们的结构异构体；单不饱和C3-C8羧酸，如丙烯酸或(C1-C7烷基)丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、延胡索酸、马来酸、衣康酸；单烯键不饱和C3-C8 —元羧酸与C1-C2tl链烷醇、C5-C8环烷醇、苯基-C1-C4链烷醇或苯氧基-C1-C4链烷醇的酯，实例是丙烯酸与C1-C2tl链烷醇的酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸2-丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十二酯和丙烯酸十八酯；丙烯酸与C5-Cltl环烷醇的酯，如丙烯酸环己酯；丙烯酸与苯基-C1-C4链烷醇的酯，如丙烯酸苄酯、丙烯酸2-苯基乙酯和丙烯酸I-苯基乙酯；丙烯酸与苯氧基-C1-C4链烷醇的酯，如丙烯酸2-苯氧基乙酯；甲基丙烯酸与C1-C2tl链烷醇 (优选C1-Cltl链烷醇)的酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基 丙烯酸2- 丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸十二酯和甲基丙烯酸十八酯；甲基丙烯酸与C5-Cltl环烷醇的酯，如甲基丙烯酸环己酯；甲基丙烯酸与苯基-C1-C4链烷醇的酯，如甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸2-苯基乙酯和甲基丙烯酸I-苯基乙酯；和甲基丙烯酸与苯氧基-C1-C4链烷醇的酯，如甲基丙烯酸2-苯氧基乙酯；单烯键不饱和C4-C8 二羧酸与C1-C2tl链烷醇的二酯，如马来酸或延胡索酸与C1-Cm链烷醇的二酯，实例是马来酸二甲酯、马来酸二乙酯、马来酸二正丁酯、延胡索酸二甲酯、延胡索酸二乙酯和延胡索酸二正丁酯；单烯键不饱和C3-C8 —元羧酸的C1-C2tl烷基酰胺和二 -C1-C2tl烷基酰胺，尤其是例如丙烯酸和甲基丙烯酸的C1-C2tl烷基酰胺和二 -C1-C2tl烷基酰胺；单烯键不饱和羧酸的酰胺，如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；具有3至8个碳原子的单烯键不饱和一元羧酸和二羧酸的酐，如丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、马来酸酐或衣康酸酐；具有3至8个碳原子的单烯键不饱和一元羧酸或二羧酸的羟基-C2-C4烷基酯，如丙烯酸2-羟乙酯、丙烯酸2-羟丙酯、丙烯酸3-羟丙酯、丙烯酸2-羟丁酯、丙烯酸4-羟丁酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟丙酯、甲基丙烯酸3-羟丙酯、甲基丙烯酸2-羟丁酯、甲基丙烯酸4-羟丁酯；单烯键不饱和磺酸及其盐，实例是乙烯基磺酸、烯丙基磺酸、甲代烯丙基磺酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2-丙烯酰胺基乙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基乙磺酸、2-丙烯酰氧基乙磺酸、2-甲基丙烯酰氧基乙磺酸、
3-丙烯酰氧基丙磺酸和2-甲基丙烯酰氧基丙磺酸；具有3至5个碳原子的单烯键不饱和腈，如丙烯腈和甲基丙烯腈；N-乙烯基杂环，如N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基咪唑；和具有至少一个聚-C2-C4烯化氧基团的单烯键不饱和化合物，实例是聚-C2-C4烷撑二醇或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撑二醇的乙烯醚和烯丙醚、具有3至8个碳原子的单烯键不饱和一元羧酸和二羧酸与聚-C2-C4烷撑二醇或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撑二醇的酯、具有3至8个碳原子的单烯键不饱和一元羧酸和二羧酸与聚-C2-C4烷撑二醇胺或C1-Cltl烷基-聚-C2-C4烷撑二醇胺的酰胺；具有至少一个碱性氮原子或季铵化氮原子的烯键式不饱和化合物，如氯化二烯丙基二甲铵、N-甲基-N-乙烯基咪唑鎗盐如氯化物、硫酸酯或硫酸二甲酯、N-(2-( 二甲氨基)乙基)丙烯酰胺、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯、
2-(N，N-二甲氨基)乙基丙烯酰胺、3-(N，N-二甲氨基)丙基丙烯酰胺、3-(N，N-二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲氨基)乙基甲基丙烯酰胺、氯化丙烯酸2-(N，N，N-三甲铵)乙酯、氯化甲基丙烯酸2-(N，N，N-三甲铵)乙酯、氯化2-(N，N，N-三甲铵)乙基甲基丙烯酰胺、氯化3-(N，N，N-三甲铵)丙基丙烯酰胺、氯化3-(N，N，N-三甲铵)丙基甲基丙烯酰胺、氯化2-(N，N，N-三甲铵)乙基丙烯酰胺，及对应的硫酸酯和硫酸二甲酯；乙烯基芳香族单体，如苯乙烯、a-甲基苯乙烯、乙烯基甲苯、叔丁基苯乙烯、乙烯基吡啶；
具有I至20个碳原子的脂肪族羧酸的乙烯酯和烯丙酯，实例是乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、十二酸乙烯酯和十八酸乙烯酯；共轭二烯，如丁二烯和异戊二烯；和卤代乙烯系化合物，如氯乙烯(乙烯基氯)、1，I-二氯乙烯(亚乙烯基二氯)、氟乙烯、I，I- 二氟乙烯和四氟乙烯。除非另有说明，烧基可以指C1-C7烧基，且可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、I-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、1，I-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、I-乙基丙基、正己基、I-甲基戊基、2-甲基戊基、
3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，2-二甲基丁基、1，3- 二甲基丁基、2，3- 二甲基丁基、1，I- 二甲基丁基、2, 2_ _■甲基丁基、3, 3_ _■甲基丁基、I，I，2- 二甲基丙基、1,2,2- 二甲基丙基、I-乙基丁基、2_乙基丁基、I-乙基_2_甲基丙基、正庚基、2_庚基、3_庚基、2_乙基戍基、I-丙基丁基等。以下实施例仅用于说明本发明。对本领域技术人员而言显而易见的许多可能的变异也落在本发明的范围之内。实验部分除非另有说明，通过应用遗传工程、通过培养微生物的化学化合物的发酵性产生中和产物的分析和分离中使用的标准设备、方法、化学品和生化药品来进行以下实验。还参见上文中引用的Sambrook等和Chmiel等。材料和方法a)材料所有化学品和生化药品来自Roche (Mannheim,德国)、Sigma (Deisenhofen,德国)和AppliChem。用于DNA操作的酶、DNA大小标记、蛋白质分子质量标准参照物和用于SDS/PAGE的分子量标准来自Fermentas GmbH (St. Leon-Rot,德国)。大肠杆菌菌株BL21来自Stratagene。测序引物购自MWG-Biotech AG (Ebersberg,德国)。辅酶A来自MPBiomedicals。从对应的酸酐制备戍二酸和乙酸的辅酶A酯(Simon,E. J & Shemin,D. (1953)J. Am. Chem. Soc. 75, 2530)。b)生物和生长
于室温在缺氧条件下在补充了 50mM MOPS、3mM盐酸半胱氨酸、IOmM谷氨酸钠、多种浓度的核黄素和FeCl2的Standard I培养基(I. 5 %蛋白胨、0. 3 %酵母提取物、IOOmMNaCl、5mM葡萄糖；Merck,Darmstadt)上培养用于克隆的大肠杆菌DH5 a和用于表达的大肠杆菌BL21。c)酶活性测定于室温下在包含0. IM Tris/HCl pH 8. 0、0. 2mM NADH和2_羟基戊二酸脱氢酶的0.5ml总体积的比色杯中测量2-羟基戊二酸脱氢酶活性。加入ImMa-氧代戊二酸后，在 340nm 监测 NADH 的吸光度降低(e = 6. 3mM-lcm_l) (Bresser J(1997) (R)-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase aus Acidaminococcus fermentans. PhD Thesis,Philipps- Universita t Marburg,德国；Martins BM, Macedo-Ribeiro S, Bresser J,Buckel ff, Messerschmidt A(2005)Structural basis for stereo-specific catalysisin NAD.-dependent (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase from Acidaminococcusfermentans. Febs J 272 :269-281)。
于室温在有氧条件下进行戊烯二酸辅酶A转移酶活性测定。在412nm跟踪吸光度的提高，A e = Mmr1CnT1。测定中使用的试剂是0. IM磷酸钾pH 7. O、0. 2M乙酸钠、ImM草酰乙酸、ImM 5，5' -二硫代双(2-硝基苯甲酸盐)(DTNB)、20 ii g柠檬酸合成酶、0. ImM戊二酰辅酶 A,总体积 0. 5ml (Buckel ff, Dorn U, Semmler R (1981) Glutaconate CoA-transferasefrom Acidaminococcus fermentans. Eur J Biochem 118 :315-321 ;Jacob U, Mack M,Clausen T, Huber R, Buckel ff, Messerschmidt A (1997)Glutaconate CoA-transferasefrom Acidaminococcus fermentans the crystal structure reveals homology withother CoA-transferases. Structure5 :415-426)。于室温在缺氧条件下在包含50mM Mops/KOH pH 7. 0、IOmM二硫苏糖醇、5mM MgCl2,0. ImM连二亚硫酸盐、0.4mM ATP和具有激活蛋白的2-羟基戊二酸脱氢酶的0. 5ml总体积的比色杯中测量2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶活性。孵育10分钟后，用2mM乙酰辅酶A和2mM (R) -2-羟基戊二酸起始反应。在290nm跟踪由戊烯二酰辅酶A的形成引起的吸光度提高(e = 2. 2mM_1cm_1) (Kim J, Darley DJ, Buckel ff, Pierik AJ(2008)An allylicketyl radical intermediate in clostridial amino-acid fermentation. Nature 452 239-242)。用2mM乙酰辅酶A、50mM磷酸钾pH7. 0,0. 25mM NADPH、戊烯二酸及用催化剂量的戊烯二酸辅酶A转移酶、戊烯二酰辅酶A脱羧酶[3，5，6]和巴豆酰辅酶A羧化酶/还原酶[9]，通过酶促反应测定戊烯二酸。用分光光度计在340nm测量NADP+的形成。通过在20mM硫酸中、使用C18反相柱、具有210nm UV检测的室温下的HPLC来测
定戊烯二酸。d)其他生物化学方法以牛血清白蛋白为标准，用Bio-Rad微测定(microassay)来测定蛋白质浓度。在Mini Protein 仪器(Bio-Rad, Heidelberg,德国)中进行 SDS-PAGE。用考马斯亮蓝(Serva,Heidelberg,德国)染色蛋白质。实施例I :基因的克隆克隆方法
按(SambrookJ & Russell Dff(2001)Molecular Cloning a Laboratory Manual,第三版 Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)中所述进行DNA的常规操作、PCR和重组质粒的构建。使用包含Ndel和XhoI限制位点的以下引物，用PfuUltra High-Fidelity DNA 聚合酶(Stratagene,美国)进行 gctAB 的 PCR 扩增NdeI 5 ' -ATGGTA C A T A T G T GAGTAAAGTAATGACGTTAAAAGACGCAATCG-3'(SEQ ID NO 39)和XhoI 5' -ATGGTACTCGAGTTATTTTGCTTCC GTGGGGACCTGG-3'(SEQ ID NO 40)分别从pET-Duet-1和pJF118HE将来自发酵氨基酸球菌的基因hgdH(2_羟基戊二酸脱氢酶)和gctAB (戍烯二酸辅酶A转移酶)亚克隆入pACY⑶uet-1载体(Novagen) (SEQ ID NO: 13)(图 2) (Fiirste JP, Pansegrau ff, Frank R, Blocker H, Scholz P,Bagdasarian M,Lanka E(1986)Molecular cloning of the plasmid RP4 primase regionin a multi-host-range tacP expression vector)。对于来自共生梭菌的hgdAB (2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶)及其来自发酵氨基酸球菌的激活蛋白hgdC的克隆，使用了 pASK-IBA3plus载体(IBA GmbH, GSttillgen，德国)(SEQ ID NO :14)(图 3)。用于pACYO)uet-l载体中的hgdH的连接和转化条件将pASKIBA7+(实验室收藏)中的hgdH亚克隆入pETDuet (与下文所述相同的方法)，然后转移至可以表达至多8个基因(IOkb)的pACY⑶uet-1。连接前，用限制酶BamHI和 EcoNI (Fermentas)于 37°C下分别处理 pETDuet_hgdH 和 pACYCDuet-1 载体 I 小时(表I)。表I 用 BamHI 和 EcoNI 消化
权利要求
1.用于产生通式I的不饱和二羧酸化合物的生物催化方法 HOOC-CH = CH-X-COOH(I) 其中 X代表直链或支链、任选不饱和、任选取代的烃基； 该方法包括 任选在存在辅酶A源的情况下，在共表达编码戊烯二酸辅酶A转移酶(E. C. 2. 8. 3. 12)和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的基因的重组微生物中转化通式III的2-羟基取代的二羧酸化合物，以便形成所述式I的化合物HOOC-C (OH) H-CH2-X-COOH (III) 其中 X如上文所定义； 和任选以基本上纯的立体异构体的形式或作为立体异构体的混合物分离所述式I的化合物。
2.权利要求I的方法，其中X选自η是从I至4的整数的(CH上、CH= CH、CH2-C(=O)或 CH = C (OH)。
3.权利要求I或2的方法，其中由所述重组微生物通过2-羟基戊二酸脱氢酶(E. C. I. I. I.-)催化的式II的2-氧代-二羧酸化合物的转化形成所述2-羟基取代的二羧酸 III HOOC-C ( = O) -CH2-X-COOH (II) 其中 X定义于上文。
4.权利要求3的方法，其中所述重组微生物共表达所述2-羟基戊二酸脱氢酶的基因。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述式II的氧代-二羧酸化合物加至所述重组微生物或通过所述重组微生物发酵性产生所述式II的氧代-二羧酸化合物。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物是代谢谷氨酸和/或葡萄糖的需氧菌或厌氧菌，且其中所述式II的化合物是2-氧代戊二酸。
7.权利要求6的方法，其中所述代谢谷氨酸和/或葡萄糖的重组菌选自埃希氏菌属。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统包含2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶(E. C. 4. 2. I.-)和任选包含所述酶的激活蛋白。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶和激活蛋白是原核或真核来源。
10.权利要求9的方法，其中所述酶和激活蛋白源自相同或不同的具有转化谷氨酸为戊烯二酸的能力的厌氧菌。
11.权利要求10的方法，其中所述厌氧菌选自氨基酸球菌属、梭菌属、梭杆菌属、消化链球菌属的细菌。
12.权利要求11的方法，其中所述厌氧菌是发酵氨基酸球菌、共生梭菌、球孢梭菌、包括所有亚种的具核梭杆菌或不解糖消化链球菌。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述 a)2-羟基戊二酸脱氢酶(HgdH)包含SEQ ID NO 2或16的氨基酸序列、或与该序列具有至少50%同一性的序列；b)戊烯二酸辅酶A转移酶(GctAB)包含SEQID NO :4和/或6、SEQID NO : 18和/或.20，或SEQ ID NO 22和/或24的氨基酸序列、或与该序列具有至少50%同一性的序列； c)2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶包含SEQ ID NO :8和/或10、SEQ IDNO :26和/或28，或SEQ ID NO 30,32和/或34的氨基酸序列、或与该序列具有至少50%同一性的序列； d)c)的激活蛋白(HdgC)包含SEQID NO :12、36或38的氨基酸序列、或与该序列具有至少50%同一性的序列。
14.权利要求13的方法，其中所述2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶来自共生梭菌，而所述2-羟基戊二酸脱氢酶、所述戊烯二酸辅酶A转移酶和所述激活蛋白来自发酵氨基酸球菌。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质均由核酸序列编码，该核酸序列适合于具有产生所述式II的2-氧代-二羧酸能力的所述微生物的密码子使用。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质由包含于一个或多个表达载体中的核酸序列编码。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述共表达的蛋白质中的至少一个对所述重组微生物而言是异源的。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中产生式I的化合物，其中X选自CH2X2H4XH=CH、CH = C (OH)。
19.表达盒，其包含各自编码权利要求I至17中任一项定义的酶或蛋白质的至少两个不同核酸序列的组合，该序列与至少一个调节核酸序列有效连接。
20.重组载体，其包含权利要求19的至少一个表达盒。
21.用权利要求20的至少一个载体转化的重组原核或真核宿主。
22.权利要求21的重组宿主，其具有产生式(II)的2-氧代-二羧酸化合物的能力，该式(II)的2-氧代-二羧酸化合物通过由所述至少一个载体编码的所述表达产物的表达转化为式(I)的化合物。
23.权利要求22的宿主，其是埃希氏菌属细菌的重组菌株。
24.制备聚酰胺的方法，该方法包括 a)通过权利要求I至18中任一项的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物； b)分离所述化合物，任选随后氢化，以去除C= C双键；和 c)使步骤b)获得的所述化合物与至少一个适宜的多价胺单体聚合。
25.权利要求24的方法，其中所述多胺是二胺、三胺或其混合物。
26.制备聚酯的方法，该方法包括 a)通过权利要求I至18中任一项的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物； b)分离所述化合物，任选随后氢化，以去除C= C双键；和 c)使步骤b)获得的所述化合物与至少一个适宜的多价醇聚合。
27.制备聚合物的方法，该方法包括 a)通过权利要求I至18中任一项的方法制备上文定义的通式(I)的单不饱和二羧酸化合物； b)分离所述化合物；和c)使步骤b)获 得的所述化合物与至少一个适宜的不饱和可聚合单体聚合。
全文摘要
本发明涉及通过培养共表达戊烯二酸辅酶A转移酶和2-羟基戊二酰辅酶A脱水酶系统的重组微生物来进行不饱和二羧酸的生物催化产生的方法。本发明还涉及对应的重组宿主，适合用于制备这类宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及利用通过该生物催化产生方法获得的该二羧酸制备聚酰胺或聚酯共聚物的方法。
文档编号C12P7/44GK102782144SQ201080011703
公开日2012年11月14日 申请日期2010年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者I·久尔杰维奇, O·策尔德尔, W·布克尔 申请人:巴斯夫欧洲公司