专利名称：海藻糖酶用于在植物中获得干旱抗性的用途的制作方法
海藻糖酶用于在植物中获得干旱抗性的用途本发明涉及海藻糖酶用于在植物中获得干旱和/或盐抗性中的用途。更具体来说，本发明涉及遗传学修饰的构建体，其被转化进植物并造成海藻糖酶过表达，由此所述转基因植物显示出在干旱期间显著更好的干旱抗性以及干旱期后供给水时更好的恢复。二糖海藻糖(a -D-吡喃葡萄糖基-1，l-α -D-吡喃葡萄糖苷)是一类非还原糖， 发现于多种生物(包括植物)。海藻糖的作用通常与胁迫抗性，尤其与干旱抗性相关。Jang 等人描述了通过表达大肠杆菌的6-磷酸-海藻糖合酶基因与6-磷酸海藻糖磷酸酶基因的融合体，构建具有提高的非生物胁迫耐受性的转基因水稻植物。Suarez等人Q008) 通过过表达6-磷酸海藻糖合酶在普通大豆中获得了改进的干旱耐受性。在这些研究中，海藻糖的积累是通过提高其生物合成来促进的。然而，除了其生物合成途径之外，海藻糖的水平还可以由海藻糖降解影响。海藻糖酶是拟南芥(Arabidopsis)中唯一已知的，能够将海藻糖降解为两个葡萄糖单元的酶。其基因AtTREl的表达在特定的植物发育阶段(如开花，衰老和经历胁迫条件时)显著地上调。由于海藻糖代谢与植物生命过程的密切联系，通过海藻糖酶活性对海藻糖的水平，或间接地对Τ6Ρ的水平进行严格控制可能对这些代谢物/信号的精细调节及随后对植物生长和发育的控制是至关重要的。海藻糖酶还可能动员胁迫诱导的海藻糖水平升高以允许随后的细胞修复，就像在低等生物中一样。此外，高海藻糖酶活性还可能阻止病原微生物或共生微生物释放的外源海藻糖所造成的碳代谢紊乱。然而，尽管涉及到多种过程，关于海藻糖酶在高等植物中确切的作用还知之甚少。ΕΡ0784095公开了在土豆中抑制海藻糖酶造成的海藻糖积累，其抑制是通过添加海藻糖酶抑制剂有效霉素A(ValidamyCin A)，或通过表达海藻糖酶的反义RNA来实现。然而，这些抑制实验都是在6-磷酸-海藻糖合酶过表达的植物中完成的，使得难于区分该合酶过表达所造成的影响与海藻糖酶抑制所造成的影响。W02008095919公开了过表达一个海藻糖酶基因在赋予植物线虫抗性中的用途。然而，该公开没有提及关于干旱或盐耐受性。 相反地，该公开指出更高的海藻糖浓度导致提高的干旱和胁迫耐受性。令人吃惊的是我们发现过表达海藻糖酶导致更好的干旱耐受性，以及在一段时期干旱后重浇水时导致更好的生长。敲除海藻糖酶基因会引起干旱耐受性下降。本发明的第一个方面是重组海藻糖酶基因在植物中调节干旱和/或盐耐受性中的用途。本文所用的干旱和/或盐耐受性的调节可以是干旱和/或盐耐受性的提高或降低。 本文所用的海藻糖酶意指糖苷水解酶，其将海藻糖转变为葡萄糖。海藻糖酶是本领域技术人员已知的，并且其包括但不限于细菌、真菌和植物的海藻糖酶。优选地，所述海藻糖酶为拟南芥海藻糖酶，甚至最优选为拟南芥海藻糖酶TREKgenbank登录号NM_118536)。本文所用的重组海藻糖酶基因意指编码海藻糖酶的核酸，其已经被分离，任选地进行修饰，并被导入植物中，导致改变的干旱和/或胁迫耐受性。重组海藻糖酶基因包括但并不限于敲除的基因、具有修饰的(优选优化的)编码序列的基因、具有修饰的启动子的基因、反义基因、编码RNAi的基因。作为非限制性的例子，本文所用的优化的编码区序列包括为了更好地翻译进行的密码子优化以及可以提高蛋白质特定活性的突变。由于修饰，导入植物的片段可以仅仅是海藻糖酶基因的片段。然而，基因的修饰是任选的。作为不带有修饰的海藻糖酶基因用途的一个非限制性例子，可以在植物中导入一个物种(甚至是非植物物种)的该基因。 所述导入可以是单个拷贝，或者导入若干拷贝。或者，也可以用内源的海藻糖酶基因转化植物以获得该基因的高拷贝数，并因此获得海藻糖酶蛋白更高的表达。优选地，所述用途为过表达海藻糖酶基因，导致改善的干旱和/或盐耐受性。优选地，所述过表达导致改善的干旱耐受性。本文所用干旱耐受性包括在栽培中的干旱耐受性，还包括收获后的干旱耐受性，其导致收获后的植物更好的贮藏期。作为一个非限制性例子，收割后的干旱耐受性可以导致甘蓝花有更好的贮藏期，或者导致蔬菜具有更好的贮藏期，所述蔬菜优选绿色蔬菜，例如但不限于莴苣和菠菜。优选地，所述海藻糖酶的所述过表达特异性位于气孔保卫细胞中。本文所用在气孔保卫细胞中特异性表达意指表达很大程度上偏好于气孔保卫细胞中；优选在气孔保卫细胞中有表达而在植物叶或茎的叶肉细胞或表皮细胞中没有表达，但在部分根或花中可能表达。这样的特异性过表达可以通过内源的拟南芥TREl启动子实现。本发明另一方面是海藻糖酶过表达用于在植物中获得干旱和/或盐耐受性的用途。获得海藻糖酶过表达的方法本领域技术人员已知，其包括但不限于提高海藻糖酶基因的拷贝数、将海藻糖酶编码序列置于强启动子控制下或从启动子去除抑制元件。海藻糖酶过表达可以通过在植物中诱变并选择内源海藻糖酶来获得。优选地，通过分离海藻糖酶基因，改造使其适于过表达并将其转化入植物而获得海藻糖酶的过表达。优选地，所述过表达导致改善的干旱耐受性。优选地，所述海藻糖酶放置于气孔特异性的启动子之后，并且过表达特异性地位于气孔保卫细胞中。还有，本发明另一个方面是海藻糖酶过表达在获得干旱期后重浇水时改善的生长中的用途。本文所用的重浇水意指在干旱期后使植物暴露于水。 本文所用改善的生长包括在开始重新浇水后的更短的适应期，和适应期后更好的生长。本发明仍另一方面是本发明的海藻糖酶在调节气孔功能中的用途，优选本发明的重组海藻糖酶基因在调节气孔功能中的用途。所述气孔功能可以通过调节气孔细胞的孔径，和/或每单位叶表面气孔细胞的数目，和/或气孔指数来调节。优选地，气孔功能的调节通过改变气孔细胞孔径来实现。优选地，所述海藻糖酶的用途为过表达，所述气孔功能的调节为限制气孔张开。对本领域技术人员，已经清楚知道气孔张开的限制，或和/或每叶表面的气孔细胞数量的下降，或和/或气孔指数的下降可以限制水分丧失并导致干旱抗性， 至少只要其中一个因素的下降没有被另一个因素的提高所补偿。附图简述
图1 拟南芥AtTREl突变体株系。A)GT tre KO和SA TRE OX株系在拟南芥基因组DNA中插入位点的示意图。SA TRE OX准确的(实线)和预测的(虚线)插入位点被显示。对GT tre K0，预测的插入位点已被确认。引物组的位置也标出；黑色框是外显子。B) GT tre KO株系中相比于野生型(wt)拟南芥Ler (Landsberg erecta)生态型中的海藻糖酶相对表达。C)SA TRE OX株系中相比于野生型拟南芥Col (Colombia)生态型中的海藻糖酶相对表达。对B)和C)，所示为一个代表性株系中对肌动蛋白进行归一化的实时定量PCR 结果。纯合幼苗在IXMS (含蔗糖，12小时-12小时昼/夜循环)上生长10天。数据为平均值士标准误，η = 2，每个实验士 100株幼苗。图2 拟南芥AtTREl突变株系中的海藻糖酶活性。测定了 Α)在土壤种植的Col野
4生型和SA TRE OX植物的成熟叶片中的；B)在土壤种植的Ler野生型和GT tre KO幼嫩及成熟角果材料混合物中的海藻糖酶活性(nkat/g蛋白质)(数据为来自每个株系不同植物的混合植物材料的平均值)。图3 =AtTREl突变体在海藻糖上的生长表型。A)有Val A时的GT treKO株系和 Ler野生型。B)有Val A时的SA TRE OX株系及Col野生型。C)无Val A时的GT tre KO 株系及Ler野生型。D)无Val A时的SA TRE OX株系及Col野生型。约30株幼苗/处理于竖直放置的平皿中，在不含蔗糖的1 XMS上，0、0. 5、1、5、10或25mM海藻糖，于12小时-12 小时昼/夜循环条件下生长10天。数据为平均值士标准误。图4 =AtTREl突变体在高海藻糖上的生长表型。幼苗种植于与图3所述相同的条件下，不含Val A，但含更高浓度的海藻糖50、100、150和200mM。所示为具代表性的幼苗。图5 =AtTREl突变体幼苗对碳水化合物的使用。A)在水平取向平皿上，1 XMS，0%、 3%、6%蔗糖或葡萄糖，1611-811，生长10天的54 TRE OX及Col野生型植物。B)GT tre KO 及Ler野生型植物(与A中条件相同)。C)于垂直取向平皿上，含1 %蔗糖的0. 5 XMS，持续光照下生长6天的SA TREOX及Col野生型植物。D)GT tre KO及Ler野生型植物(与C 中条件相同)。所示为具代表性的幼苗。图6 不同昼夜节律下AtTREl突变体叶的生长。A)Ler野生型(第一行)和GT tre KO植物(两个不同株系)的叶，1^1-1 昼/夜循环。B)Ler野生型(第一行)和GT tre KO植物(两个不同株系)的叶，16h-8h昼/夜循环。C) Col野生型(第一行)和SA TRE OX植物(两个不同株系)的叶片，1^1-1 昼/夜循环。D)Col野生型(第一行)和 SA TRE OX植物(两个不同株系)的叶片，1 - 昼/夜循环。子叶(Cotelydons)和莲座叶按照出现的顺序摆放。植物为4周大小，土壤种植。所示为具代表性的幼苗。图7 =AtTREl突变体的繁殖。A) 土壤种植，4周大小(16h- !昼/夜循环)的GT tre KO与Ler野生型植物相比更早开花。B) 土壤种植，7周大小(16h- !昼/夜循环)的 GT tre KO与Ler野生型植物发育的外观(view)，及C) Col野生型和SA TRE OX植物的外观。D) Ler野生型及GT tre KO植物花和角果的细节。表型被观察到若干次，示出具代表性的植物。图8 =AtTREl突变体在提高的温度下的幼苗发育。33度下SA TRE OX和GT tre KO及其各自的野生型的萌发及生长(持续低光，蔗糖，1XMS，10天)。所示为具代表性的幼苗。图9:拟南芥AtTREl OX及KO植物的干旱应答。在土壤种植，正常浇水条件下4 周，停止浇水2周后(A，B)以及重新浇水几天后(C，D)植物的干旱胁迫应答。所示为具代表性的植物。图10 =AtTREl在叶肉原生质体中的定位。A)使用暗(视场)干涉对比的原生质体光学显微图像。B)带有GFP-荧光蛋白的AtTREl主要定位在质膜中。C)叶绿体自发荧光。图11 使用启动子-GUS/GFP单插入株系在GUS染色后的10天大小的幼苗中 AtTREl的表达模式(IXMS上生长)。A 在叶A、叶2和叶原基中的表达；B 在气孔保卫细胞中的表达。图12 对AtTREl OX和KO株系气孔关闭和打开的测定。相比于海藻糖酶敲除(KO)及野生型植物，海藻糖酶过表达株系(OX)中气孔打开的差异。图13 =AtTREl OX和KO株系气孔和扁平细胞的计数测定。相比于敲除株系(KO) 和野生型植物，海藻糖酶过表达植物(OX)在0.142mm2的样品上的气孔数目(A)以及扁平细胞数目(B)0图14 =AtTREl OX和KO株系中的气孔指数。气孔指数对应于根据表皮细胞总数的气孔比例(#气孔Λ2χ#气孔+#扁平细胞)。
实施例实施例材料与方法本研究中使用的拟南芥植物表I 植物株系*本研究中的纯合植物从订购的株系中得到
权利要求
1.重组海藻糖酶基因在植物中调节干旱和/或盐耐受性的用途。
2.权利要求1的重组海藻糖酶的用途，其中所述海藻糖酶基因被过表达。
3.权利要求2的重组海藻糖酶过表达的用途，其用于在植物中获得干旱和/或盐耐受性。
4.权利要求2的重组海藻糖酶过表达的用途，其用于在一段干旱时期后经重新浇水而获得改善的生长。
5.权利要求3或4的重组海藻糖酶过表达的用途，其中所述过表达特异于气孔保卫细胞。
6.重组海藻糖酶基因在调节气孔保卫细胞的功能中的用途。
7.权利要求6的重组海藻糖酶的用途，其中所述海藻糖酶被过表达。
8.权利要求7的重组海藻糖酶过表达的用途，其中所述调节气孔功能是限制气孔张开。
全文摘要
本发明涉及海藻糖酶用于在植物中获得干旱和/或盐抗性的用途。更具体来说，本发明涉及遗传学修饰的构建体，其被转化进植物并造成海藻糖酶过表达，由此所述转基因植物显示出在干旱期间显著更好的干旱抗性以及在干旱期后供给水时更好的恢复。
文档编号C12N15/82GK102348804SQ201080011522
公开日2012年2月8日 申请日期2010年2月8日 优先权日2009年2月9日
发明者L·范德斯蒂恩, N·阿翁斯, P·范迪亚克 申请人:弗拉芒区生物技术研究所, 鲁汶大学研究开发部