专利名称：：一种海藻糖合成酶及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种海藻糖合成酶及其应用。
背景技术：
：海藻糖(Trehalose)分子是由两个吡喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，分子内不存在游离的半縮羟基，是一种稳定的非还原性二糖。海藻糖有3种光学异构体，其中ae型(Neotrehalose，新海藻糖)和Pe型(Isotrehalose，异海藻糖)在自然界中很少存在，aa型则是最常见的海藻糖(又称蘑菇糖)，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫体内。海藻糖无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等活体成分有很强的稳定作用，通常在环境胁迫条件下海藻糖作为一种相容性介质对生物大分子乃至生物体起保护作用。研究表明海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、活性蛋白、生物膜、医药产品甚至待移植的器官，因此在生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域有着广泛的应用前景。早期的商品化海藻糖主要是从酵母细胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的广泛应用。近年来在许多微生物中发现了海藻糖的合成酶系，酶法合成海藻糖正逐步成为海藻糖工业化生产的新途径。在微生物中海藻糖主要有三种合成途径1)0tsA—0tsB途径该途径以6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为底物，经6-磷酸海藻糖合成酶(0tsA)和6-磷酸海藻糖酯酶(0tsB)两步催化生成海藻糖。2)TreY—TreZ途径首先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(TreY)作用于麦芽糊精末端，催化分子内的转糖基化，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后在麦芽寡糖基海藻糖水解酶(TreZ)作用下断裂麦芽寡糖和海藻糖间的a-l，4-糖苷键，释放出海藻糖。3)TreS途径海藻糖合成酶(TreS)作用于底物麦芽糖，通过分子内转糖基作用，把a，a-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为a，a-l，l糖苷键连接的海藻糖。在上述三种途径中，TreS途径既不消耗高能物质，也不依赖磷酸，而且底物麦芽糖目前生产技术成熟，价格低廉，与成品海藻糖相比有较大的价格空间。因此，利用海藻糖合成酶以麦芽糖为原料生产海藻糖是一条极有工业化前景的途径。关于海藻糖合成酶已有专利和文献报道。中国专利200410013006.9公开了一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达的该酶，以27.27%的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70%。台湾NationalChungHsing大学Jei-FuShaw等报道的一种海藻糖合成酶，目的蛋白占细胞总蛋白的28%，转化率71%，转化时间长达72h。这些文献报道的海藻糖合成酶存在表达量低、催化时间长、底物浓度高等缺点。
发明内容本发明的一个目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因。本发明所提供的海藻糖合成酶，来源于谷氨酸棒杆菌(6biT/2e&cferi咖^W柳j'c鹏)，名称为CG-TreS，是如下的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。序列表中序列2由598个氨基酸残基组成。为了使(a)中的CG-TreS便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的CG-TreS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CG-TreS的编码基因可通过将序列表中SEQIDNa:1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述海藻糖合成酶的编码基因(O7-7>^50也属于本发明的保护范围。所述海藻糖合成酶的编码基因，是如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列l;2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述海藻糖合成酶的DNA分子。所述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体或转基因细胞系或转基因重组菌均属于本发明的保护范围。所述转基因重组菌具体可为含有所述海藻糖合成酶编码基因的重组大肠杆菌，如含有所述海藻糖合成酶编码基因的大肠埃希氏菌(^sc力en'c力^gcoh')BL21(DE3)PlysS。所述重组大肠杆菌优选为大肠埃希氏菌(^sc力ehc力^coh')PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011。其中，大肠埃希氏菌(￡co")PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011已于2007年04月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市海淀区中关村北一条13号)。本发明的另一个目的是提供一种表达海藻糖合成酶的方法。本发明所提供的表达海藻糖合成酶的方法，是培养上述含有海藻糖合成酶CG-TreS编码基因的转基因重组菌，得到海藻糖合成酶。海藻糖合成酶CG-TreS的分子量为69kDa，酶活性的pH范围为5.011.0，最适pH为9.0;酶活性的温度范围为445。C，最适反应温度为20。C。本发明的又一个目的是提供一种制备海藻糖的方法。本发明所提供的制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶CG-TreS进行催化，得到海藻糖。所述方法中，反应温度可为445'C，反应液的pH可为5.011.0;所述反应温度优选为42(TC，尤其优选为2(TC，所述反应液的pH优选为710，尤其优选为9.0。所述方法中，反应时间可为525小时，优选为1520小时，尤其优选为20小时。本发明的海藻糖合成酶酶活力高，酶活力可达53.0U/mg;本发明表达海藻糖合成酶的方法，表达量高，占细胞可溶性总蛋白的58%;本发明制备海藻糖的方法，海藻糖合成酶催化时间短、所需底物浓度低，以15%(15g/100ml)麦芽糖为底物，催化20小时，转化率达70%。图1为大肠埃希氏菌(￡c。h')PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011的PCR鉴定图谱图2为纯化后的重组表达的海藻糖合成酶的SDS-PAGE图3大肠埃希氏菌U.c。h')PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011表达产物的SDS-PAGE分析图4为温度对CG-TreS活性影响曲线图5为金属离子对CG-TreS活性影响曲线图6为海藻糖转化率随时间变化曲线图7A为标准样品的离子色谱分析图谱图7B为CG-TreS催化产物的离子色谱分析图谱具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料1)菌株和质粒谷氨酸棒杆菌(6biy77ete"ftri咖^"柳ic咖)CGMCC1.1886购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和表达载体pET-30a(+)为Merck公司产品；pGEM-TVector为Promega公司产品；大肠杆菌ToplO为Invitrogen公司产品。2)主要试剂PyrobestDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、X-gal及IPTG均为TaKaRa公司产品；DNA凝胶回收试剂盒购自上海申能博彩公司；Ni-NTASpinKit购自德国QIAGEN公司；DNA分子量标准DL2000和1KbDNALadder购自天根生化科技有限公司；麦芽糖及海藻糖标准品购自北京化学试剂公司；薄层色谱(TLC)预制板购自Merck公司；其余试剂为国产或进口分析纯。实施例1、海藻糖合成酶及其编码基因的获得一、海藻糖合成酶编码基因的获得1、谷氨酸棒杆菌(C^"^肌'c"/^基因组DNA的提取将活化的谷氨酸棒杆菌(C^/W柳icM^CGMCC1.1886菌种转接至营养肉汁液体培养基中(蛋白胨10g/L,牛肉提取物3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0)，30。C摇床210rpm培养24h。取100mL培养液离心收集菌体，加9.5mlTE悬浮沉淀，并力口0.5ml10%SDS，50u120mg/ml蛋白酶K，混匀，37。C保温l小时；加1.5ml5mol/LNaCl，混匀；再加1,5ml100/^CTAB溶液(用O.7mol/LNaCl溶液配制)，混匀，65。C保温20分钟；用等体积酚氯仿异戊醇(25:24:l)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；用等体积氯仿异戊醇(24:l)抽提，上清液加l倍体积异丙醇，沉淀DNA;5000rpm离心10min，去上清，70%乙醇漂洗，吸干，溶解于1mLTE或ddH20，—2(TC保存。2、PCR扩增海藻糖合成酶编码基因以步骤l提取的谷氨酸棒杆菌(C^wt3/w'c鹏J)CGMCC1.1886的基因组DNA为模板，用引物CgF和CgR为进行PCR扩增。其中，上游引物CgF:5'-CCCATATGACTGATACCTCTCCGTTGAA-3，(下划线部分示7Wel识别位点)，下游引物CgR:5'-CGCGGCCGCTTCCATATCGTCCTTTTC-3，(下划线部分示#"1识别位点)。PCR条件为94。C预变性4min;然后94。C30sec，55。C30sec，72。C2rain，30个循环后72'C延伸3min。将得到的PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明得到的PCR产物大小约为1800bp。PCR扩增产物加A后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，与pGEM-TVector连接，将连接产物转化大肠杆菌ToplO，挑取阳性克隆。进行序列测定，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1的DNA序列7>e5")，编码序列表中序列2的海藻糖合成酶CG-TreS。将含有序列表中序列1的DNA序列的重组载体命名为pGEM-CG-TreS。二、海藻糖合成酶CG-TreS的表达1、制备表达海藻糖合成酶CG-TreS的重组菌分别用^el和双酶切pGEM-CG-TreS和pET-30a(+)，将(T-7re5"片段连入pET-30a(+)，将该连接产物转化大肠杆菌ToplO，挑取阳性克隆，进行PCR测序鉴定和酶切鉴定，得到含有具有序列表中序列1的DNA序列的O-7ye5"片段的重组载体pET-CG-TreS。提取pET-CG-TreS，转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，步骤如下1)冰上融化-7(TC保存的感受态细胞。2)加入质粒，轻轻旋转混匀，冰浴放置30min。3)将离心管放入预加温至42X:的水浴中，静止放置90s。4)快速将离心管转移到冰浴中，冷却12min。5)加400uLLB培养基于转化细胞中。6)37。C轻柔振荡4560min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。7)将200uL己转化的感受态细胞转移到含有卡那霉素(50ng/mL)的LB平板上，用无菌涂布棒轻轻的将菌液涂布均匀。8)将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37"C培养1216h。通过PCR测序鉴定和酶切鉴定，得到含有重组载体pET-CG-TreS的重组菌一大肠埃希氏菌(￡coli)PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011。其中，大肠埃希氏菌(￡coli)PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011的PCR鉴定结果如图1所示，表明得到大小约为1800bp的产物。图1中，泳道1为DNA分子量标准DL2000,泳道2为PCR产物。同时以转入pET-30a(+)的BL21(DE3)pLysS重组菌BL21(DE3)pLysS-30a作为对昭。2、重组菌的诱导表达与海藻酸合成酶的纯化挑取大肠埃希氏菌coh')PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011单菌落接种到LB液体培养基(含卡那霉素50ug/mL，氯霉素34ng/mL)，37。C振荡过夜。按照1%(体积比)的接种量转接至30mL上述LB液体培养基，37。C振荡培养至0D600为0.6时，加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导5h后离心收集菌体。用100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎(功率250W,工作时间4秒，间歇时间6秒，总时间2.5分钟)，4°C10000rpm离心lmin后取上清液。上清液釆用Ni-NTASpinKit纯化回收，取纯化的样品进行SDS-PAGE分析。结果表明在69kDa处出现了较明显的单一条带，与理论分子量基本符合(图2)。图2中，泳道l为纯化后的重组海藻糖合成酶，泳道2为纯化前PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011细胞总蛋白，泳道3为低分子量标准。SDS-PAGE进行凝胶成像扫描结果表明重组海藻糖合成酶占细胞可溶性总蛋白的58%(见图3)。图3中，泳道l为低分子量标准，2为BL21(DE3)pLysS-30a细胞总蛋白，3、4、5为纯化前PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011细胞总蛋白。酶活力测定取40nL纯化的海藻糖合成酶酶液，用100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液稀释至200nL，加等体积的30%(30g/100m)麦芽糖溶液，2(TC反应20min，100。C煮沸5min终止反应，12000rpm离心5min，取上清，稀释1000倍用离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。离子色谱为DIONEX2500，柱子CarboPacPA-IOO，流动相体积比为70:30的100nmol/LNaOH和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，进样量IOuL。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量。酶活力单位的定义在2(TC，pH7条件下，l分钟内转化lumol麦芽糖成为海藻糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。经测定，40uL纯化的蛋白液中含有41.0168ug酶蛋白，反应20min后生成43.475nmol海藻糖，从而得出酶的比活为53.0U/mg。同时以相同条件培养BL21(DE3)pLysS-30a作为对照，结果表明BL21(DE3)pLysS-30a的菌体破碎上清液无海藻糖合成酶活性。3、大肠埃希氏菌PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011表达的海藻糖合成酶的性质分析1)海藻糖合成酶CG-TreS最适pH的测定分别配制pH5，6，7，8，9的100mmol/LKH2P04-1(2朋04缓冲液，pH10，11，12的100mmol/LK2HP04-K0H缓冲液。取l.5mL发酵液离心收集菌体，按照步骤2的方法，分别加入100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液300wL重悬菌体，超声破碎，4。C离心后取上清，分别与用相应缓冲液配制的30%(30g/100ml)麦芽糖溶液等体积混和，37'C振荡反应20h,沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下样品浓度:样品峰面积+标样峰面积X标样浓度X进样稀释倍数；转化率=产物海藻糖含量+底物麦芽糖含量X100呢。结果表明酶活性的pH范围为5.011.0，特别是在pH710，海藻糖合成酶CG-TreS对底物有60%以上的转化率，说明海藻糖合成酶CG-TreS在中性及偏碱条件下具有较高的活性。酶活性的最适pH为9.0。2)海藻糖合成酶CG-TreS最适温度的测定按照步骤2的方法，取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入100ramol/LpH7.0的磷酸缓冲液300uL重悬菌体，超声破碎，4"C离心后取上清，与等体积的30%(30g/100ml)麦芽糖溶液混和，分别在4°C，20°C，30°C，37°C，45。C振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下样品浓度=样品峰面积+标样峰面积X标样浓度X进样稀释倍数；转化率=产物海藻糖含量+底物麦芽糖含量X100。/q。结果表明酶活性的温度范围为445'C，当温度继续升高时，酶活力迅速下降，最适反应温度为20。C(图4)。温度对重组酶合成酶活的影响主要表现在两方面一方面当温度升高时，反应速度加快；另一方面随着温度的升高，由于酶是蛋白质，酶逐渐变性而失活，从而引起酶反应速度的下降。酶反应所表现的最适温度是这两种因素综合影响的结果。根据反应的时间，可合理的选择反应的温度。氨基酸序列分析显示，海藻糖合成酶基因中含有a-淀粉酶的多个保守序列，较高的反应可能导致a-淀粉酶活力升高，把部分底物水解为葡萄糖，从而降低了海藻糖的转化率。3)金属离子对酶活力的影响分别配制100mM的BaCl22H20、CaCl2、CoCl2'6H20、CuS04、MgS04、MnS(VH20溶液。按照步骤2的方法，取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入去离子水300nL重悬菌体，超声破碎，4。C离心后取上清，与等体积的30%(30g/100mL)麦芽糖溶液混合，再加入上述离子溶液至终浓度1mM和10mM，37°C，pH7振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。以仅含酶液和麦芽糖溶液的混合液作为对照组。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下样品浓度二样品峰面积+标样峰面积X标样浓度X进样稀释倍数；转化率=产物海藻糖含量+底物麦芽糖含量乂100%。不同离子浓度下测定的转化率除以对照组的转化率即为相对转化率。结果表明，lmM的Ba2+、Ca2+、Co2+、Mn2+对酶活影响不大，Mg2+对酶活有促进作用，C,对酶活有明显的抑制作用。10mM的Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mn"对酶有强烈抑制，10mM的Mg2+对酶有微弱抑制(图5)。4)重组酶催化时间测定取1.5mL发酵液离心收集菌体，加入100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液300uL重悬菌体，超声破碎，4T:离心后取上清，与等体积的30%(30g/100raL)麦芽糖溶液混和，37'C振荡反应，分别在0h，1h，2h，4h，8h，16h，25h取样，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。以25h时的转化率(转化率=(产物海藻糖含量+底物麦芽糖含量)X100%)为100%基准，其他值与其相比得出相对转化率。从图6可以看出，随着反应时间的延长转化率逐渐提高，在0-4h转化率呈线性快速增长，随后开始减缓，在16h以后反应趋于平衡。实施例2、利用大肠埃希氏菌(￡co/力PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011表达的海藻糖合成酶制备海藻糖取lml实施例1中的海藻糖合成酶CG-TreS酶液(19.0U)，与lml30%(30g/100ml)麦芽糖溶液混和，20。C振荡反应20h，沸水浴5min终止反应。用离子色谱测定样品中海藻糖的含量。离子色谱的测定方法如下离心收集反应液上清液，用100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液稀释1000倍进样。离子色谱为DI0NEX2500，柱子CarboPacPA-100，流动相体积比为70:30的100nmol/LNa0H和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，进样量10uL。已知标样浓度，根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式为样品浓度=(样品峰面积+标样峰面积)X标样浓度X进样稀释倍数。转化率=(产物海藻糖含量+底物麦芽糖含量)X100%。从图7中可以看出，标准样品中海藻糖的出峰时间是l.93分钟，峰面积为45.382;待测样品中海藻糖的出峰时间是1.93分钟，峰面积为3L740;已知标样浓度，根据标样及待测样品的峰面积可以计算出待测样品中海藻糖的含量。样品浓度=(31.740+45.382)X0.015%X1000二10.5%转化率=(10.5%+15%)X100%=70%同法测得其他样品。其中，标准样品的色谱图如图7A，各个峰如表2。表2.标准样品的各个峰<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>CG-TreS催化产物的色谱图如图7B，各个峰如表3。表3.测试样品的各个峰<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表〈磨2〈210〉1<211〉1797〈212〉DNA〈213〉谷氣酸棒杆菌(Carj72e力acz^i^'MZ7^/〃z^gyzic〃/i7)〈400>1ttgaattctcagccgagtgccctgatcacgcggctcgcccagttcttgat60gcccacggcttgatcgttgagcacgaMcggaagagtttccagtccccgcacccgctccc120ggtg^C3gCcctgggag3agaaa^ccgcg3gtggt3C3aagax:gccgttttctacgaa180gtgctggttcgtgccttctacgatxcagaaggc^cggagtcggatcgttg犯aggcctg240accga^adctggattacatccagtggctcggcgtggattgcatttggatcccaccgttt300tatgattccccactgcgcgacggcggttacgatatccgcaacttccgtgaaatcctgccc360gaattcggcaccgtcgatgacttcgtggaactcgttgaccacgcccaccgccgtggcctg420cgtgttatcaccgacttggtcatgaatcacacctccgaccagcacgcatggttccaagaa480tcccggcgcgacccaaccggcccctacggagatttxtatgtgtggagcgatgatcccacc540ctgtac犯cgaagcccgcatcatctt"tgtagatacagaagaatccaactggacctatgat600ccggtgcgtggccagtacttctggcaccgcttcttctcccaccaaccagacctcaactac660gacaaccccgcagtcc犯gaggccatgctagatgtcttgcgtttctggctggacctgggs720cttgatggtttccgactagatgccgttccttatctttttgaacgcgaaggcaccaacggc780gaaaacct:cacgatttxctcaaactgtgtcgctctgtcat840taccccggccgaatcctgctcgcagaagccaaccaatggccccaagatg"tgg"tcgaatac■ttcggtg犯3犯gaca犯ggcgatgaatgccacatggccttccacttccctttgatgccg960cgcatcttcatgggagttcgccaaggttcacgcaccccgatcagtgagatcctggccaac1020accccggagattcccaagactgcccaatggggtattttxctgcgtaMcatgatgagctc1080acccttgaaatggtctccgatgagg縦gcagctacatgtactcccaattcgcctccgaa1140cctcgcatgcgcgccaacgtaggaatccgcaggcgcctttccccactgcttg卿gcgac1200cgcaacceLgctggaactccttcacggtttgttgctgtctctacctggctcacccgtgttg1260tattacggtgcatgggcgacaatatctggctccacgaccgcgacggagtg1320cgc8cccccatgcagtggtccaacgaccgc獄ggtggtttctccaaagctgatcctg^1380cgcctgtaccttccagcgatccaaaMgatcaatacggctacgcccaagt3aacgtggaa1440agccaactcaaccgcgaaaactccctgctgcgctggctccgaaaccaaatccttatccgc1500肌gcagtaccgcgcatttggtgccggaacctaccgtgaagtgtcctccacca3tgagtc31560gtgttgacatttttacgagaacacaagggccaaaccattttgtgtgtc肌ca^cgLtga^gc1620aaatatcctcaggcagtctcgcttgatttgCgtg￡L￡Ltttgccctcgagag1680atgtcgggcgggcagctgttccctaccattgctgaacgggagtggattgtcactttagcc1740cctcacggsttcttctggtttgatctcaccgCCg￡Ltg￡L￡L￡Lgg滅ga1797<210〉2<211>598<212〉PRT〈213〉谷氨酸棒杆菌(6biT/eZ^ctar/鹏^7〃f柳/c鹏)<400>2LeuAsnSerGinProSerAlaAspHisHisProAspHisAlaAlaArg151015ProValLeuAspAlaHisGlyLeulieValGluHisGluSerGluGlu202530PheProValProAlaProAlaProGlyGluGinProTrpGluLysLys354045AsnArgGluTrpTyrLysAspAlaValPheTyrGluValLeuValArg505560AlaPheTyrAspProGluGlyAsnGlyValGlySerLeuLysGlyLeu65707580ThrGluLysLeuAspTyrlieGinTrpLeuGlyValAspCyslieTrp859095lieProProPheTyrAspSerProLeuArgAspGlyGlyTyrAsplie100105110ArgAsnPheArgGlulieLeuProGluPheGlyThrValAspAspPhe115120125ValGluLeuValAspHisAlaHisArgArgGlyLeuArgVallieThr130135140AspLeuValMetAsnHisThrSerAspGinHisAlaTrpPheGinGlu145150155160SerArgArgAspProThrGlyProTyrGlyAspPheTyrValTrpSer165170175AspAspProThrLeuTyrAsnGluAlaArglieliePheValAspThr180185190GluGluSerAsnTrpThrTyrAspProValArgGlyGinTyrPheTrp195200205HisArgPhePheSerHisGinProAspLeuAsnTyrAspAsnProAla210215220ValGinGluAlaMetLeuAspValLeuArgPheTrpLeuAspLeuGly225230235240LeuAspGlyPheArgLeuAspAlaValProTyrLeuPheGluArgGlu245250255GlyThrAsnGlyGluAsnLeuLysGluThrHisAspPheLeuLysLeu260265270CysArgSerVallieGluLysGluTyrProGlyArglieLeuLeuAla275280285GluAlaAsnGinTrpProGinAspValValGluTyrPheGlyGluLys290295300AspLysGlyAspGluCysHisMetAlaPheHisPheProLeuMetPro305310315320ArgliePheMetGlyValArgGinGlySerArgThrProlieSerGlu325330335lieLeuAlaAsnThrProGlulieProLysThrAlaGinTrpGlylie340345350PheLeuArgAsnHisAspGluLeuThrLeuGluMetValSerAspGlu355360365GluArgSerTyrMetTyrSerGinPheAlaSerGluProArgMetArg370375380AlaAsnValGlylieArgArgArgLeuSerProLeuLeuGluGlyAsp385390395400ArgAsnGinLeuGluLeuLeuHisGlyLeuLeuLeuSerLeuProGly405410415SerProValLeuTyrTyrGlyAspGlulieGlyMetGlyAspAsnlie420425430TrpLeuHisAspArgAspGlyValArgThrProMetGinTrpSerAsn435440445AspArgAsnGlyGlyPheSerLysAlaAspProGluArgLeuTyrLeu450455460ProAlalieGinAsnAspGinTyrGlyTyrAlaGinValAsnValGlu465470475480SerGinLeuAsnArgGluAsnSerLeuLeuArgTrpLeuArgAsnGin485490495lieLeulieArgLysGinTyrArgAlaPheGlyAlaGlyThrTyrArg500505510GluValSerSerThrAsnGluSerValLeuThrPheLeuArgGluHis515520525LysGlyGinThrlieLeuCysValAsnAsnMetSerLysTyrProGin530535540AlaValSerLeuAspLeuArgGluPheAlaGlyHisThrProArgGlu545550555560MetSerGlyGlyGinLeuPheProThrlieAlaGluArgGluTrplie565570575ValThrLeuAlaProHisGlyPhePheTrpPheAspLeuThrAlaAsp580585590GluLysAspAspMetGlu59权利要求1、一种海藻糖合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述的海藻糖合成酶编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述海藻糖合成酶的编码基因，是如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列l;2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述海藻糖合成酶的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体或转基因细胞系。5、含有权利要求2或3所述海藻糖合成酶编码基因的转基因重组菌。6、根据权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于所述转基因重组菌为含有权利要求2或3所述海藻糖合成酶编码基因的重组大肠杆菌。7、根据权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于所述重组大肠杆菌为含有权利要求2或3所述海藻糖合成酶编码基因的大肠埃希氏菌(^^c力ei^c^'acoli)BL21(DE3)PlysS;优选为大肠埃希氏菌(fsc/zer/c/&coli)PlysScgN-T31-30a27CGMCCNo.2011。8、一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养权利要求5至7中任一权利要求所述的转基因重组菌，得到海藻糖合成酶。9、一种制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用权利要求1所述的海藻糖合成酶进行催化，得到海藻糖。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，反应温度为445。C，反应液的pH为5.011.0;所述反应温度优选为42(TC，所述反应液的pH优选为7-10;所述反应温度尤其优选为2(TC，所述反应液的pH尤其优选为9.0。全文摘要本发明公开了一种海藻糖合成酶及其应用。该海藻糖合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该海藻糖合成酶可用于催化麦芽糖制备海藻糖。文档编号C12N1/21GK101100658SQ200710100350公开日2008年1月9日申请日期2007年6月8日优先权日2007年6月8日发明者丁宏标,宇乔,吴秀丽,镭李申请人:中国农业科学院饲料研究所