肾移植免疫排斥三联基因尿检法及试剂盒和诊断试剂的制作方法

专利名称：肾移植免疫排斥三联基因尿检法及试剂盒和诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及医学领域。可应用于对肾脏移植后免疫排斥 反应进行无创监测。具体地，本发明涉及设计及优化适用于在微量尿液脱落细胞中同时定量扩增三种基因的PCR引物，以及克隆制备用于定量PCR 的三种基因标准物片断。
背景技术：
器官移植是现代医学的标志性学科之一。自1959年首例肾移植成功以 来目前世界上已有70多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生，而且 这个数字还在以每年近5万的速度增加。截至2003年，我国累计完成肾 脏移植5万多例，现在每年完成超过5000例，数量仅次于美国位居世界 第二位。中国约有100多万尿毒症患者，每年还有近12万的新增病人。 对这些患者，肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存 活，始终是肾移植成功与否的主要问题(参考文献1,2)。随着配型技术的 发展以及新型免疫抑制剂的临床应用，早期急性排斥发生率明显下降，移 植肾短期存活率显著提高。但延迟性急性和慢性排斥反应仍然是移植肾功 能减退和最终移植肾丧失最主要的原因(3)。如果以半寿期(移植第1年后 50%的移植物丧失功能的时间)预测肾移植的长期效果的话，近20年来， 肾移植的长期存活率没有得到明显的改善，1年内约有10%到15%的移植 肾丧失功能，5年内移植肾存活率为67%左右，10年内存活率不到38%。 肾移植长期存活的主要障碍是慢性排斥反应或慢性移植肾功能衰退(4)。 在中国，移植用器官多来源于尸体，少部分由亲属提供活体肾。肾脏移植 后，患者需要终身服用免疫抑制剂(如环孢霉素A和FK506)用于抗排斥 反应治疗。但此类药物的治疗窗很窄，如果用量不足，就不能有效防止珍 贵的移植肾被排斥，若剂量过大，则会产生严重的剂量相关性肾脏毒性作 用使移植肾失功，并使严重的感染并发症的发生率明显增加从而威胁患者的生命。所以肾脏移植后及时、准确、特异的监测对移植肾免疫排斥反应 的早期发现及调整患者的免疫抑制剂用量具有极其重要的作用。然而目前临床上检测移植肾排斥的方法还只限於根据临床表现(如体温升高，血压异常，腹痛，甚至有尿血，等等)和血清肌酐(serum creatinine, 血肌酐SCr)升高来判定。但这些方法不能早期诊断排斥反应，往往是一 旦上述症状出现，移植肾排斥已经发生并已进入严重阶段，临床上很难救 治；其次是这些诊断指标缺乏特异性，因为人体其它部位出现感染时，也 会诱发上述临床症候和血肌酐(SCr)升高，会因此而误判，盲目增加免 疫抑制药剂量，不但徒然增加患者的经济负担，还会引发毒副作用甚至危 及患者生命。移植肾穿刺活检是目前临床上唯一的权威诊断方法。但这种 方法的最大缺点是其对移植器官的创伤性，有可能造成肾脏出血、肾周血 肿、动静脉痿等并发症，危害移植肾的存活(5,6)。同时手术的实施必须 经过麻醉、无菌消毒、术前术后护理等一系列过程，费用昂贵。正因其创 伤性、过程复杂和昂贵，就不可能在所有的医院普及用来作为常规、随时 地使用的确诊手段。目前在中国以至国际移植界，穿刺活检手术一般在肾 移植术后1个月、3个月、6个月及1年时间进行，以这样的频率，很难 做到及早发现和处理。肾穿刺活组织检查的另一个严重的缺陷是，活检所 取的组织大小是肾脏的十几万分之一，仅仅是整个移植肾的极小部分，其 情况未必能反映出其它部位是否有病变而造成误诊(7)。所以目前临床上急需建立一种快捷、敏感、特异和无创的免疫检测方 法对肾脏移植后免疫排斥反应进行监测。这对于早期发现和治疗排斥反应 以及指导临床医生合理调整免疫抑制剂用量、使之适时减少或停药(将大大 减轻病人的经济负担)，提高病人生存质量，降低移植患者的死亡率，延长 移植肾的存活时间均具有重要意义，将有力推动器官移植事业的发展。器官移植排斥反应预测、诊断、监测领域在世界上属于一个尚未开发 的领域，许多国家的研究机构正在投入大量的人力物力加紧进行研发，应 用已确诊发生免疫排斥的移植肾脏组织来筛査和鉴定造成移植物排斥的 蛋白标志物(8,9)。 2001年美国的科学家们率先报道在免疫排斥的肾组织 中，细胞毒性蛋白穿孔素(cytotoxic proteins perforin)禾B Granzyme B (粒 酶B)的水平异常增高(10)。接着美国威斯康星大学教授Knechtle的研究小组通过对99例肾移植术后患者的观察，发现IP-10(IFN-gamma-inducible protein 10，干扰素诱导蛋白质10)的表达在移植 肾免疫排斥发生时明显增高(11),他们还证明IP-10不但出现在被排斥的 器官组织中，也可以在患者的尿液细胞中检测出来(11，12)。实验证明， IP-10是趋化因子CXCR3配基族的一员，功能是吸引激活的T细胞到达免 疫反应(炎症)区域，是移植器官的免疫排斥反应起始的关键步骤之一。 细胞毒T细胞是移植器官免疫排斥反应中最为重要的淋巴细胞之一。其杀 死移植器官细胞的主要分子机制是释放Granzyme B和perforin, Perforin 结合在移植体细胞模表面形成孔洞使Gmnzyme B大量进入细胞内，造成 细胞的崩解死亡。初步的临床实验表明，肾移植活体或尿样细胞中IP-10 和GranzymeB的增加不仅可以准确诊断器官的免疫排斥反应，而且可以 鉴别诊断器官的免疫排斥或感染等其他炎症反应，极具有诊断学价值(13-15)。长期以来很多医学研究单位都在利用这些研究成果研发检测移 植器官排斥的方法，但是由于许多技术上的难题(例如不同基因引物之间 存在相互干扰，PCR产物的定量问题，复杂体系中PCR反应的特异性， 可能引发基因组DNA的错误扩增等等)，至今尚未有实用的诊断试剂盒推 出。发明内容针对上述本领域急需解决的问题，近年来，同昕生物技术(北京)公 司的科学家们在上述各项前沿技术和理论的基础上，设计及优化了可同时 定量扩增三种基因的PCR引物，采用多通道实时荧光定量基因检测技术 进行三重PCR反应，成功地建立了一种在微量的尿液细胞中同时测定两 个移植肾排斥靶标基因(IP-10和粒酶B)和一个参照基因(HPRT)的表 达水平的技术方法，命名为"肾移植免疫排斥三联基因尿检法"。同时， 我们克隆制备了用于定量PCR的三种基因标准物片断，使我们这种三联 基因尿检法的定量有了一个绝对的参照标准。这样不同病人的，同一病人 不同时期的样品可进行比较。更详细地，本发明提供下列各项1. 一种用于检测肾脏移植后免疫排斥反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物IP-10的表达的第一对PCR引物和 用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物粒酶B的表达的第二对PCR引物， 所述第一对PCR引物中的正向和反向引物分别是序列表SEQ ID NO: 4 和SEQ ID NO: 5所示的寡核苷酸序列，所述第二对PCR引物中的正向和 反向引物分别是序列表SEQIDNO: 6禾口SEQIDNO: 7所示的寡核苷酸 序列，优选所述细胞是尿细胞。在本发明的一个实施方案中，所述PCR 引物可以混合在一起或者分开在不同容器中，并且可以任选地处于本领域 技术人员熟知的适当介质中。另外，本发明的试剂盒还可以包括使用说明 书，用于指导使用者使用该试剂盒和说明该试剂盒的检测用途。例如，本 发明的一种试剂盒名称为UC-QPCR-TARCINETM。2. 根据以上1的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测细胞中参照 基因HPRT的第三对PCR引物，所述第三对PCR引物中的正向和反向引 物分别是序列表SEQIDNO: 8和序列表SEQIDNO: 9所示的寡核苷酸 序列。3. 根据以上1或2的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在PCR反应过 程中用于定量PCR产物的荧光染料，优选SYBRGI荧光染料。4. 根据以上1或2的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在PCR反应过 程中用于定量PCR产物的TaqMan探针，优选针对IP-10的TaqMan探针 是包含序列表SEQ ID NO: IO所示的寡核苷酸序列的探针，针对粒酶B 的TaqMan探针是包含序列表SEQ ID NO: 11所示的寡核苷酸序列的探针， 针对HPRT的TaqMan探针是包含序列表SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸 序列的探针。5. —种用于检测肾脏移植后免疫排斥反应的诊断试剂，所述诊断试剂 包括用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物IP-10的表达的第一对PCR引 物和用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物粒酶B的表达的第二对PCR 引物，所述第一对PCR引物中的正向和反向引物分别是序列表SEQ ID NO: 4禾卩SEQIDNO: 5所示的寡核苷酸序列，所述第二对PCR引物中 的正向和反向引物分别是序列表SEQIDNO: 6禾卩SEQ ID NO: 7所示的 寡核苷酸序列，优选所述细胞是尿细胞。6. 根据以上5的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括用于检测细胞中参照基因HPRT的第三对PCR引物，所述第三对PCR引物中的正向和反 向引物分别是序列表SEQIDNO: 8和SEQIDNO: 9所示的寡核苷酸序列。7. 根据以上5或6的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括在PCR反 应过程中用于定量PCR产物的荧光染料，优选SYBRGI荧光染料。8. 根据以上5或6的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括在PCR反 应过程中用于定量PCR产物的TaqMan探针，优选针对IP-10的TaqMan 探针是包含序列表SEQ ID NO: IO所示的寡核苷酸序列的探针，针对粒 酶B的TaqMan探针是包含序列表SEQ ID NO: 11所示的寡核苷酸序列的 探针，针对HPRT的TaqMan探针是包含序列表SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸序列的探针。9. 一种体外检测尿细胞中IP-10和粒酶B的表达的方法，该方法包括 使用根据以上1至4中任何一项的试剂盒和根据以上5至8中任何一项的 诊断试剂，通过PCR方法来定量IP-10和粒酶B的表达。10. 根据以上9的方法，其中所述尿细胞是从肾脏移植患者的尿液中 分离的。本发明克服了现有技术中许多技术上的难题(例如不同基因引物之间 存在相互干扰，PCR产物的定量问题，复杂体系中PCR反应的特异性， 可能引发基因组DNA的错误扩增等等)。相对于使用单个靶标基因，本发明使用的三联基因检测法具有如下的 优势1. 三联基因检测法只需要微量的尿样就能同时检测出造成免疫排斥 的三个基因的表达。这点对于临床实用十分重要，因为尿样中仅含有微量 蛋白， 一个尿样的数量不够使用单个靶标基因法对三个有关基因逐个检2. 三联基因检测法能在一个尿样中同时检测出造成免疫排斥的三个 基因的表达，因此其检测灵敏度和特异性就显著优于使用单个靶标基因。3. 三联基因检测法大大提高了对移植肾免疫排斥检测效率。 三联基因检测法的检测指标，可精确地、动态地反映移植肾的功能状况，因此能动态地监测免疫抑制剂的治疗效果，指导医生随时根据移植肾的功能调节免疫抑制剂的用量。 发明详述
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。聚合酶链式 反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之 后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通 过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还 是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴 趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基 因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这 种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR就是 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现 对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一 种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧 光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这 样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩 增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段荧光背景信号 阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧 光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期， 扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没 有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝 数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量 之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和 比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念 荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它 可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的 缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内 的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值(threshold value )0实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类 是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利 用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针 的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。本发明可以使用任何一种 实时荧光定量PCR。
SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链 DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常 理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nrn ，发射波长最大约为 520nm 。 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧 光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
TaqMan探针是多人拥有的专利技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸 探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和 下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则 在3'末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3'端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶 活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。。随着扩增循环数的 增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈 正比关系。
本发明针对器官移植医学急需解决的问题，即，缺乏对移植器官排斥 反应的免疫检测方法，利用现代移植医学最新进展，选择了两种免疫排斥 反应相关的基因和一种参照基因。利用分子生物学方法之中最为敏感的 PCR技术，建立了一种在微量的尿液细胞中同时定量测定这三种基因表达 水平的方法。
本发明的技术方案包括1)引物及探针的设计及优化；2)目标基因 克隆，标准曲线的建立；和3)三重PCR体系建立。


图1.H (HPRT)基因单重扩增结果，标准曲线和扩增曲线；图2.1 (IP10)基因单重扩增结果，标准曲线和扩增曲线；图3.G (GranzymeB)基因单重扩增结果，标准曲线和扩增曲线；图4.三重体系融解曲线分析；图5.多重反应PCR产物电泳结果；图6.脾脏cDNA单重和多重扩增结果融解曲线分析；图7.脾脏RNA单重和三重扩增产物融解曲线分析；图8. (a)H基因扩增曲线；(b)I基因扩增曲线；(c)G基因扩增曲线；图9. (a)脾脏cDNA和尿细胞cDNAH基因扩增结果；(b)脾脏cDNA 和尿细胞c.DNAI基因扩增结果；(c)脾脏cDNA和尿细胞cDNAG基因 扩增结果；和图10.脾脏cDNA三重扩增结果与单重扩增产物电泳结果。
具体实施方式
下文将参考附图通过实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举 例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权 利要求具体限定。实施例l.三重荧光实时定量PCR (Triplex Real-time PCR)引物探针设 计HPRT (Hypoxantine phosphoribosyltransferase，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)是一种常见的细胞内持家基因，其表达量在不同种类细胞中以及同类 细胞在不同情况下都相对恒定(16， 17)，因此常被用作参照基因，用于目标 基因表达差异的研究。根据NCBI公布的IP 10 (GenBank Accession No. NM—001565，序列表 SEQ ID NO: 1 ) 、 Granzyme B (GenBank Accession No. NM—004131 ， SEQ ID NO: 2)以及HPRT基因(GenBank Accession No. NM—000194， SEQ ID NO: 3)的cDNA序列，使用Primer express 2.0 (Applied Biosystems)以 及Primer Premier 5 (PREM正R Biosoft Intemational)、等引物设计软件，并参 考有关文献，我们选择以下表1所示三组引物和TaqMan探针用于三重定量PCR扩增。设计多重定量PCR引物与探针应基于以下原则所设计的引物或是探针至少有一个位于两个外显子接头处，这样就可以避免基因组DNA扩增对于扩增结果的影响。将设计出的引物序列相互比较，以保证其在同一扩增体系时，最大限 度地不影响相互之间的扩增，并且避免错误扩增。应保证在单重扩增体系与三重扩增体系中，引物对于单个目标的扩增表l基因名称GENEBANK序列号荧光定量PCR引物探针产物长度IP10NM—00156515-primer: CCACGTGTTGAGATCATTGC(SEQIDNO: 4)13-primer: TCCCCTCTGGTTTTAAGGAG138(SEQIDNO: 5)I隱Probe:HEX—— ACAATGAAAAAGAAGGGTGAGAAGAGATGTC---BHQ1(SEQIDNO: 10)Granzyme B雨_004131.G5-primer: GAGCCGACCCAGCAGTTTATC(SEQIDNO: 6)G3-primer: GCC TTT CTC TCC AGC TGC AGT107(SEQIDNO: 7)G-Probe: ROX— CCCATCCCCCATCCAGCCTATAATCC—BHQ2(SEQIDNO: 11)HPRT丽_000194H5-primer: AGGAAAGCAAAGTCTGCATTGTT(SEQIDNO: 8)H3陽primer: GGTGGAGATGATCTCTCAACTTTAA94bp(SEQIDNO: 9)H-Probe: FAM—-CCATGTTCAATTATATCTTCCACAATCAAGAC—BHQ1(SEQIDNO: 12)表1中的HEX, BHQ1 ， ROX， BHQ2和FAM是本领域常用的taqman探针的荧光分子和淬灭基团，其全称如下 6-FAM 6-carboxy-fluoresceinHEX 5-hexachloro-fluorescein ROX 6-carboxy-x國rhodamine BHQ1Black hole quencher 1 BHQ2Black hole quencher2除非另外指明，本文所用的所有引物都由上海生物工程有限公司合成。实施例2.目标基因克隆和标准曲线的建立为了对临床样品中基因表达进行统一精确定量，我们制备了目标基因 定量的绝对标准品。我们将内含有定量PCR扩增片断的目标基因片断克 隆到载体上，提取纯化质粒并通过内切酶切将其线形化后进行生化定量， 通过采用不同浓度的质粒作为目标基因PCR反应的底物，这样就得到了 用于绝对定量基因表达的标准曲线。具体操作步骤如下1.基因克隆引物的设计。根据NIH人类基因库公布的序列，我们使用primer Premier 5软件设 计了三个目标基因的克隆引物，其引物序列如下表2:表2<table>table see original document page 13</column></row><table>2.人脾脏组织总RNA提取与反转录用QIAGEN公司RNeasy Mini Kit提取人脾脏总RNA。 用QIAGEN公司Sensiscript RT Kits反转录合成cDNA。 3.目标基因PCR扩增
以反转录产物为模板，用以上三对引物分别对目标基因进行扩增，扩 增体系如下
2 X Hotstar Mast函ix(QIAGEN): lO(il
Forward Primer (4pM): 1 pi
Reverse Primer (4 iuM): 1 p 1
DD water: 7|iil
cDNA template: 1 pi
Total: 20^1
PCR'扩增条件如下95"预变性15min; 94匸变性30s， 53"C退火30 s， 72。C延伸60s，扩增30个循环；72'C延伸10min。 (PCR仪厂家，MJ Research PTC-200)
4. 将目标基因克隆到T-easy Vector上
将PCR产物进行凝胶分离，并从凝胶中回收特定的PCR产物，并将 其连接到Promega公司的pGEM-T Easy Vectors上，所有步骤按照说明书 进行。用连接产物转化感受态的DH5a菌(天根生化科技(北京)有限公 司)，并进行蓝白斑筛选。阳性菌落首先进行PCR检湖lj， PCR检测阳性样 品送往上海生工进行质粒DNA测序。测序结果证明确实得到了带有目标 的基因的质粒。
5. 质粒DNA提取纯化与酶切线性化
培养细菌，用TIANGEN公司大量质粒提取试剂盒提取质粒DNA，所 有步骤按照说明书进行。提取的质粒分别用限制性内切酶(TAKARA) Sac I (G质粒和I质粒)和Spe I (H质粒)进行线性化。
用回收试剂盒回收纯化线性化的质粒。用pH 8.0的TE溶液溶解质粒， 用分光光度计对其进行浓度精确定量。根据测定浓度将其稀释成1 X 108浓 度储存液。实施例3.三重荧光实时定量PCR (Triplex Real-time PCR)体系建立
1.在合成TAQMAN探针以前，我们先以SYBRGI荧光染料(商购自 北京鼎国生物)，进行每个基因的单重PCR扩增，以确定各对引物扩增目 标基因的有效性.此外，为检测在三重扩增体中系不同基因引物之间是否 相互干扰，我们将三对引物同时加入反应体系中，通过电泳和溶解曲线分 析，来判断是否产生异常产物。 U以质粒为模板，对引物有效性进行验证
l丄l扩增体系
在单重体系中单个引物的终浓度为0.2pM，在多重体系中，每个引物的 终浓度为0.2pM。
(荧光定量PCR仪器为MJ Research Chromo 4) l丄3质粒DNA浓度
#品为5倍稀释的标准品质粒DNA，浓度分别为100000分子 1、20000 分子/lil、 4000分子/pl和800分子/Vl。 l丄4结果
如图1、图2和图3所示(分析软件，Opticon Monitor Version 2.03，
2 X Quantitech Multiplex PCR
NoRox Master Mix (Qiagen): SYBRGI (10X)(北京鼎国生物) Primer Mix(各2(xM): 质粒DNA :
12.5^1
2.5nl 2.5^1 6，
1.1.2扩增条件:
Step 1 95 °C 15min
Step 2 94 °C lmin
Step 3 60°C lmin
Step 4 Plate read
Go to step 2 for 40 cycles
Melting curve from 60 °C to 94°C, read every 0.2°C, hold 0.1s EndMJResearch )，分别用H、 I和G引物扩增含有各自不同浓度的标准品质 粒DNA为模板，扩增出了产物，结果表明扩增体系可以区分出不同浓度 的质粒，且成线性关系。融解曲线分析表明，扩增出了单一产物。
图4和图5。用H、 I和G引物在同一试管中同时扩增三种基因质粒的 混合物。融解曲线分析(图4)显示出3个尖峰，其位置与各个基因单一 扩增产物的融解尖峰一致。电泳结果(图5)也显示出3个长度不同的对 应于期望产物的条带。
1.2以质粒为模板扩增时，扩增体系简单。为了说明该引物是否可以 在复杂体系中特异性的扩增出目标产物，我们以人脾脏总RNA反转录得 到的cDNA为模板进行PCR扩增。
用Qiagen RNeasy Mini Kit提取脾脏RNA，用Qiagen Reverse Transcriptase Kit进行反转录，所有步骤按照说明书进行。
扩增体系如下
2 X Q腿titech Multiplex PCR
NoRox Master Mix (Qiagen) : 12.5|il SYBRGI (10X)(鼎国生物) l^U
Primer Mix(各2一) 2.5|al
Spleen cDNA: 2.5|al
_dd Water:_6.5pl_
Total: 25^1
同时，我们以未反转录的RNA样品为模板，来检测以上引物是否会 引发基因组DNA的扩增。我们在设计时，将引物设计在外显子接口处， 这样可以避免基因组DNA扩增对于实验结果的影响。
扩增条件Step 195 °C15min
Step 294 °Clmin
Step 360 °Clmin
Step 4Plate read
Go to step 2 for 40 cycles
Melting curve from 60 。C to 94°C, read every 0,2'C, hold 0.1s
End
结果如图6所示，单重扩增体系中，每个基因分别有各自的融解曲线 峰(分别为图中的绿色，蓝色和黄色峰)，表明产物单一。三重扩增体系 扩增结果(红色曲线)，有三个峰，而这三个峰所在位置分别与单重扩增中的重合，这个结果说明三重扩增体系中确实扩增出了每个目标基因片 断。
RNA模板扩增产物融解曲线(图7)分析表明，没有任何的特异峰产 生，说明以RNA为模板时，没有错误的扩增引发。 2. Taqman探针法扩增(18)
SYB G I实验证明所设计引物，可以在三重体系中分别扩增出目标产 物，因此我们分别合成了三个基因的Taqman探针，用于扩增目标产物。
2.1 SYBGI实验结果证明了三重体系扩增目标的有效性，因此我们 直接用Taqman探针法来进行三重定量PCR扩增，以质粒DNA为模板。
2xQuantitech Multiplex PCR
NoRox Master Mix (5pM):12.5|il
H-primerMix (5|_iM):
H-PROBE (5一)
G-primerMix (5(^M):ini
G-PROBE (5nM):
I-primerMix (5]uM):
I-PROBE (5nM):
dd water (5^M)3.5nl
H plasmid DNA:
G plasmid DNA:
I plasmid DNA:
Total:25^1
扩增程序如下
Step 195 °C15min
Step 294 °Clmin
Step 3 60°C卯s
Step 4Plate read
Go to step 2 for40 cycles
End
以5倍稀释的标准品质粒为模板，浓度为10000个分子/)al， 2000个分 子/pl， 400个分子4il， 80个分子/pl， 16个分子/^il， 3.2个分子/pl， 0.64 个分子 1七个浓度。
2.2结果
如图8(a)、 (b)、 (c)所示以5倍稀释质粒为模板，在三重Taqman 扩增体系中，分别成功的扩增出目标分子。三个基因的扩增曲线的线性相关系数(R2)分别0.997， 0.993禾卩0.993。结果说明，该Taqman探针体系可以准确、有效的定量体系中的各个质粒分子。2.3脾脏cDNA和尿细胞cDNA的Taqman探针扩增 提取人脾脏RNA以及人尿细胞RNA(QiagenRNeasy Mini Kit) (10)，反转录(Qiagen Reverse Transcriptase Kit)后用于三重定量PCR扩增。同时设计未反转录的RNA对照。 尿细胞收集1) 给病人提供尿杯一个，收集中段尿液100ml。2) 将尿液分装到2个50ml无菌离心管3) 将装有尿样的2个50ml离心管在室温2000g (3300rpm)离心30分钟4) 弃上清。5) 用lml冷的无菌PBS重悬尿细胞并转移于1.5ml螺帽微量离心管中。6) 室温下16,000g (13000rpm)离心10分钟。7) 弃净上清并轻弹离心管。8) 加150|il RNAlater (Qiagen, Cat# 76104)并彻底混匀。9) 简单离心以收集分散液体。 10并于-70°<:保存细胞样品。 ll)用干冰运送样品 反转录使用QIAGEN公司的SensiscriptRTKits，按照以下体系进行反转录10 X Buffer RT 2. OWdNTP Mix (5 mM each dNTP〉 2. (Mprimers: 1, RNase inhibitor (10 units/W) 1. (M Sensiscript Reverse Transcripase 1. CM RNase-free water程序:60 min 5min扩增体系如下:37°C 93 。C2 x Quantitech Multiplex PCRNoRox Master Mix: 12.5^1 Primers-probes Mix: 5^1 (各自终浓度为0.2pM)_cDNA:or (RNA):_2.5pl加水至25^1 25pl扩增程序如下Step 1 95 。C 15minStep 2 94 °C lminStep 3 60°C 卯sStep 4 Plate readGo to step 2 for 40 cycles End2.4结果如图9 (a)、 (b)、 (c)所示用脾脏cDNA和尿细胞cDNA为模板，分别扩增出了目标分子，且扩增时每个样品的三个平行对照所扩增结果基本一致。在RNA为对照的样品中，没有扩增信号，说明所设计的引物， 可以特异性的扩增目标基因片断，而不会从基因组引发错误扩增。为再次 证明所扩增分子是否为目标基因片断，我们将脾脏cDNA扩增产物与单重 扩增时的产物一同电泳，结果如图10所示，三重扩增时的产物大小与扩 增的目标产物大小完全一致。工业适用性本发明的技术创新点是(1) 应用生物靶标基因表达水平来监测移植肾器官的早期排斥。(2) 采用多通道实时荧光定量基因检测技术的"三联基因尿检法"对 于诊断肾移植免疫排斥具有快捷、敏感、有效、特异和无创等优点。(3) 对器官无任何损伤，对受试患者没有任何风险。(4) 能系统反映患者免疫系统对移植肾的排斥反应。本发明的用途是-患者在接受肾移植术后，用其尿液经常性地测定造成移植肾排斥的靶 标基因表达水平，用于临床肾移植排斥反应预测、诊断和监测。这对于早 期发现和治疗排斥反应以及指导临床医生合理调整免疫抑制剂用量、使之 适时减少或停药(将大大减轻病人的经济负担)，提高病人生存质量，降低 移植患者的死亡率，延长移植肾的存活时间均具有重要意义，将有力推动 器官移植事业的发展。参考文献1. Hariharan， S.， C. R Johnson, B. A. Bresnahan， S. E. Taranto， M.丄Mcintosh, and D. Stablein. 2000. 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〈210> 12 <211> 32 <212> DNA 〈213〉 12 〈400〉 12
ccatgttcaa ttatatcttc cac,aatcaag ac 3权利要求
1.一种用于检测肾脏移植后免疫排斥反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物IP-10的表达的第一对PCR引物和用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物粒酶B的表达的第二对PCR引物，所述第一对PCR引物中的正向和反向引物分别是SEQ ID NO4和SEQ IDNO5所示的寡核苷酸序列，所述第二对PCR引物中的正向和反向引物分别是SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的寡核苷酸序列，优选所述细胞是尿细胞。
2. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测细胞中 参照基因HPRT的第三对PCR引物，所述第三对PCR引物中的正向和反 向引物分别是SEQIDNO: 8禾卩SEQIDNO: 9所示的寡核苷酸序列。
3. 根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在PCR反 应过程中用于定量PCR产物的荧光染料，优选SYBRGI荧光染料。
4. 根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在PCR反 应过程中用于定量PCR产物的TaqMan探针，优选针对IP-10的TaqMan 探针是包含SEQ ID NO: IO所示的寡核苷酸序列的探针，针对粒酶B的 TaqMan探针是包含SEQ ID NO: 11所示的寡核苷酸序列的探针，针对 HPRT的TaqMan探针是包含SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸序列的探针。
5. —种用于检测肾脏移植后免疫排斥反应的诊断试剂，所述诊断试剂 包括用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物IP-10的表达的第一对PCR引 物和用于检测细胞中移植肾排斥蛋白标志物粒酶B的表达的第二对PCR 引物，所述第一对PCR引物中的正向和反向引物分别是SEQ ID NO: 4 和SEQ ID NO: 5所示的寡核苷酸序列，所述第二对PCR引物中的正向和 反向引物分别是SEQIDNO: 6禾卩SEQIDNO: 7所示的寡核苷酸序列， 优选所述细胞是尿细胞。
6. 根据权利要求5的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括用于检测细 胞中参照基因HPRT的第三对PCR引物，所述第三对PCR引物中的正向 和反向引物分别是SEQIDNO: 8和SEQ ID NO: 9所示的寡核苷酸序列。
7. 根据权利要求5或6的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括在PCR反应过程中用于定量PCR产物的荧光染料，优选SYBRGI荧光染料。
8. 根据权利要求5或6的诊断试剂，其中所述诊断试剂还包括在PCR 反应过程中用于定量PCR产物的TaqMan探针，优选针对IP-10的TaqMan 探针是包含SEQ ID NO: IO所示的寡核苷酸序列的探针，针对粒酶B的 TaqMan探针是包含SEQ ID NO: 11所示的寡核苷酸序列的探针，针对 HPRT的TaqMan探针是包含SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸序列的探针。
9. 一种体外检测尿细胞中IP-10和粒酶B的表达的方法，该方法包括 使用根据权利要求1至4中任何一项的试剂盒和根据权利要求5至8中任 何一项的诊断试剂，通过PCR方法来定量IP-10和粒酶B的表达。
10.根据权利要求9的方法，其中所述尿细胞是从肾脏移植患者的尿 液中分离的。
全文摘要
本发明公开了一种在尿液脱落细胞中同时定量测定两个移植肾排斥靶标基因(IP-10和粒酶B)和一个参照基因(HPRT)的表达水平的方法。本发明还提供了一种试剂盒，UC-QPCR-TARCINE^TM。该试剂盒内设有三种检测基因定量标准物，三种检测基因PCR引物。本发明采用多通道实时荧光定量基因检测技术的“三联基因尿检法”对于诊断肾移植免疫排斥具有快捷、敏感、有效、特异和无创等优点，能系统反映患者免疫系统对移植肾的排斥反应。
文档编号C12Q1/68GK101314792SQ20071009986
公开日2008年12月3日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者原 翟 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司