专利名称：一种植物组织特异性表达dna调控元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。通过在启动子中利用本发明的DNA调控序列，使目标基因在特定的组织中特异性表达或优势表达，以产生有价值的转基因植物。
背景技术：
启动子对于利用基因工程修饰植物表型是不可或缺的。基因的表达主要通过对转录水平控制来调节的，即主要通过启动子来调节的。启动子是控制DNA转录的5’调控元件，是控制基因表达的主要成分。根据作用范围或组织特性，可将启动子分类。例如，组成型启动子可将其旁侧的DNA在多种组织中转录表达。组织增强或组织特异性启动子使DNA序列在特定组织中高表达或特异性表达。诱导型启动子可被外在刺激，如化学物质、发育或环境刺激(如非生物胁迫)等诱导表达。
在各种目的的转基因植物实践中，运用不同类型的启动子是非常必要的。例如，利用强启动子在组织中高水平转录BT毒蛋白基因而获得转基因抗虫作物；利用非生物胁迫诱导启动子在转基因植物中表达DREB1转录因子从而提高植物的抗旱、抗寒和抗高盐能力。通常，组织发育特异性启动子或条件表达启动子使外源基因在恰当的时期、恰当的部位或合适的条件下表达，从而将外源基因对宿主植物的不利影响降低到最小程度。
用遗传修饰的方法创建作物新种质已发展到多性状导入的时期。该方法通过导入多个基因使植物获得多种目标性状。在将多个基因导入植物时，优化每个基因的表达是非常重要的，这需要不同的启动子来完成，而且，使用不同的调控元件可以降低同源序列重组造成的基因沉默。因此，通过使用恰当的启动子来优化基因的表达以及使用不同的调控序列来降低基因沉默的风险对植物生物技术来说是非常重要的。
各类启动子可以通过不同的策略获得。例如，通过分离具有相应表达特性的基因的5’调控序列来获得；通过对天然启动子中的顺式作用原件的增删；通过对不同启动子或启动子的部分序列的组合等方法来获得新特性的启动子。这些启动子片段的分离或重组采用常规的分子生物学方法，如PCR和DNA重组技术等。
发明内容
烟草SAR8.2b基因受水杨酸诱导表达，其启动子的-728到-927bp和-197到-351bp这两段对水杨酸诱导的高表达特性是必需的。在对SAR8.2b基因启动子的序列分析发现，在-581到-470bp区存在一段重复序列，由一段37bp的序列重复3次构成，重复单元之间只有1个碱基的差别。为了鉴定该序列的功能，将该序列与CaMV35S启动子的基本转录元件连接构成一个新启动子，并用该启动子驱动GUS基因在拟南芥中表达，发现GUS的表达具有组织特异性GUS活性主要存在与表皮毛刺、子叶和根中。因此，SAR8.2b基因启动子中的这段重复序列赋予了SAR8.2b基因的组织特异性表达特性。包含该重复片段的启动子可以用于在棉花纤维、植物被毛、子叶以及根中表达目的基因，以获得抗病、抗虫转基因植物、纤维品质改良的棉花以及抗非生物胁迫的植物等。
本发明的目的是提供一种能使基因在植物毛刺、根和子叶中优势表达的分离的DNA片段。本发明包含了这些DNA片段的合成、利用这些DNA片段构建组织优势表达启动子以及利用该启动子指导基因在植物中表达等。这些DNA片段及其延伸序列可在转录水平上提高结构DNA序列、反义RNA、干扰RNA(RNAi)、mRNA、hnRNA以及其它核酸在特定的植物组织器官中表达。
具体的，本发明所说的DNA片段是SEQ ID NO1，或SEQ ID NO1的突变体，或包含SEQ ID NO1或其突变体的DNA片段，这些DNA片段可用于构建启动子，这些启动子有利于基因在植物的特定组织优势表达，特别是在表皮毛刺、根和子叶中。所述DNA片段可以采用化学合成、PCR、DNA重组等技术获得。
SEQ ID NO1序列ATGTAGACAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTG发明还包含了与序列SEQ ID NO1或其互补序列相同的核酸片段或核酸分子、包含序列SEQ ID NO1中至少10个以上连续的核酸序列或其互补序列或核酸分子以及能够赋予与之相连的操作基因、结构RNAs、RNAi、hnRNA、mRNA和反义RNA在植物的特定组织中优势表达；所述特定组织指的是茎、叶表皮被毛(刺)、种皮毛、棉纤维、植物根系和子叶。
一种载体，包含有上述核酸片段或与其它异源核酸片段组合的核酸片段的一个或多个组合。所述载体是指适用于植物细胞的质粒载体或表达载体；所述载体中可以插入有效基因；所述有效基因选自调节棉花纤维发育的基因、调节植物表皮毛发育的基因、促进植物根系发育的基因、抗生物或非生物胁迫的基因中的一种。
含有与本发明相一致的DNA的转基因植物可以是任何植物，包括小麦、玉米、黑麦、水稻、燕麦、大麦、草皮草、高梁、小米、甘蔗、烟草、番茄、马铃薯、大豆、棉花、苜蓿、太阳花和拟南芥，本发明的一个具体例子是拟南芥。依据本发明的转基因植物可以是任何世代，包括有性或无性的T0转基因植物及其种子，任何包含SEQ IDNO.1或其一部分的种子。发明也包括可育T0植株的任何子代植株，任何包含SEQ ID NO.1或其一部分的子代植株以及它们的种子。
本发明提供的DNA片段，可用于灵活的构建植物组织特异性表达启动子，特别是该片段赋予启动子在植物表皮毛、根和子叶中优势表达。因此具有下列优点1.在棉花纤维品质改良的基因工程中可以实现外源基因在纤维中优势表达，从而在改良纤维发育特性的同时，减少外源基因对棉花其它生物性状的影响。
2.可以消除植物转基因中引起的基因沉默现象。植物基因工程中，如果使用的植物启动子与受体植物基因组具有一定的同源性或在多个基因的导入时使用的启动子具有相同的序列时，往往会在寄主植物体内引起基因沉默现象。而本发明中的DNA调节序列可以与其它启动子片段组合成各种新启动子，因此可以灵活使用，避免序列的重复，减小基因沉默的风险。
3.应用本发明中的DNA片段构建的启动子，可以进行植物分化机制研究。棉花纤维细胞是研究植物细胞分化、极性生长和纤维素沉积的理想模型。纤维特异性启动子为阐述基因对棉纤维细胞发育提供有力工具。
图1是植物表达载体图。其中“SAR”是SEQ ID NO1序列；“mini-35S”为CaMV35启动子的最小转录元件，单独使用无启动子活性。“Ω”为翻译增强序列。其后连接有GUS报告基因。
图2是在真叶中转基因拟南芥的GUS表达染色图片。其中叶表皮毛被染色。
图3是在子叶中转基因拟南芥的GUS表达染色图片。其中叶肉细胞和叶脉均被染色。
图4是拟南芥表皮毛转基因的GUS表达染色图片。其中拟南芥表皮毛的三个分枝均被染色。
图5是拟南芥植株的转基因的GUS表达染色图片。
具体实施例方式
用下列非限定性实施例对本发明进一步说明(一)SEQ ID NO1序列的合成SEQ ID NO1为一段具有3个单元的重复序列，用PCR法分离有困难，因此采用大引物延伸法合成该片段。首先分别合成该片段的左右两个部分，然后利用这两个小片段的3’端的互补粘端相互延伸，即获得完整序列。片段合成的同时，在两端引入HindIII、SalI、SpeI和XbaI位点，以便后续的重组操作。片段合成具体操作如下1.设计并合成下列引物(上海生工)p1ATCTACGTCAAGAGTTp2CCCTCTAGAATGTAGACAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCGAGTGACTCCp3AACTCTTGACGTAGATp4CCGAAGCTTGTCGACACTAGTCAAGAGTTGGAGTCACTCGGCCACCAATTATCTACGTCAAGAGTTGGAGTCACTCGCCACCAATT2.用DNA热聚合酶Tsg(上海生工)分别将引物p1和p2、p3和p4互补延伸。反应体系ddH2O 25.5μl10×PCR buffer5.0μldNTPs(各2.5mM)5.0μlMgCl2(25mM) 4.0μlp1(p3)(50μM) 5.0μlp2(p4)(5μM) 5.0μltotal 49.5μl
在PCR管内混合上述试剂后，95℃变性5min，然后加入0.5μl TsgDNA聚合酶(5U/μl)，在45℃，30s和72℃，30s两个过程中循环10次。
3.将p1和p2、p3和p4的合成产物等体积混合，在55℃，30s和72℃，60s两个过程中循环10次。
4.用2.5％的琼脂糖凝胶分离3的合成产物，回收140bp片段，用PCR产物胶回收试剂盒(WizardSV Gel and PCRClean-UpSystem，Promega)纯化。
5.将回收片段克隆到T-载体上(pGEM-T easy Vector Systems，Promega)，测序确定序列正确。
(二)Mini-35S-Ω片段的合成SEQ ID NO1单独不具有启动子活性，必须和其它启动子或启动子的基本转录元件连接才能构成新的或完整的启动子。例如与CaMV35S启动子的基本转录单元(-62-+2区域)相连。单独的CaMV35S启动子的-62-+2区域同样不具有转录活性，被称为Mini-35S启动子。当SEQ ID NO1与Mini-35S启动子相连，即构成了具有转录活性的完整启动子。为了提高基因的表达量，本例在Mini-35S启动子后还连接了来自TMV的“Ω”翻译增强序列，该序列转录产物的蛋白质翻译水平。
Mini-35S-Ω片段同样采用大引物延伸法合成，并在两端分别加上XbaI和BamHI位点1.合成引物P5
GACTCTAGACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGATCGTATTTTTACAACAATTACCAACAAP6CGGGGATCCTGTACAATGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTTGTAAA2.用DNA热聚合酶Tsg(上海生工)将引物p5和p6互为模板延伸。反应体系ddH2O 25.5μl10×PCR buffer 5.0μldNTPs(各2.5mM) 5.0μlMgCl2(25mM) 4.0μlP5(50μM) 5.0μlP6(5μM)5.0μltotal 49.5μl在PCR管内混合上述试剂后，95℃变性5min；然后加入0.5μl TsgDNA聚合酶(5U/μl)；45℃，30s；72℃，7min。
3.产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。
(三)植物表达载体构建1.构建最小启动子中间载体pBSO将Mini-35S-Ω片段，通过XbaI和BamHI位点，克隆到中间载体pBI221上，构建成中间载体pBSOa)Mini-35S-Ω片段经XbaI和BamHI双酶切后，用3％的琼脂糖凝胶分离回收160bp片段，用PCR产物胶回收试剂盒纯化。同法，用XbaI和BamHI双酶切pBI221，电泳回收5660bp片段(WizardDNA Clean-Up System，Promega)。
酶切反应体系(MBI Fermentas)为DNA 5μgBuffer 10X TangoTM2μLXbaI(10U/uL) 1μLBamHI(10U/uL) 1μL补ddH2O至 20uL37℃酶切2h。
b)连接反应(DNA Ligation Kit Ver.2.0)将1μLMini-35S-Ω酶切片段和4μL pBI221酶切片段混合后加入5μL SolutionI，16℃，30min。
c)转化筛选和鉴定取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞(化学转化法，分子克隆III，中文版)，经氨苄青霉素平板(60μg/mL)筛选后，测序。
2.构建成中间载体pBSAR用HindIII和XbaI将SEQ ID NO1从T-载体上切下，相连到pBSO的相应位点，即构建成中间载体pBSAR。方法同1.。
3.构建植物表达载体用HindIII和EcoRI从pBSAR上切下完整的表达框SAR∷GUS∷NOS，将其连接到植物表达载体pCAMBIA1301的相应位点，构建成植物表达载体pCB212。方法同1.。
(四)拟南芥植物的转化拟南芥转基因采用真空渗透法(vacuum infiltrationtransformation)1.拟南芥材料准备将春化(0.05％琼脂糖浸泡，4℃冰箱中放置3天)后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型种子播种在直径9cm塑料花钵中，基质由1/3草甸土和2/3蛭石组成。培养温度19～24，前3周生长在短日照下(8/16光/暗)，此后在长日照下促进开花和结实(16/8光/暗)。当二级花序出现时，开始转化。
2.农杆菌的制备电激法转化农杆菌从农杆菌菌株GV3101平板上挑取一个单菌落，接种到1ml液体LB培养基(50mg/l利福平，25mg/l庆大霉素)中，28℃，200r/min振荡培养20～24h；将上述培养液50ml液体LB培养基(50mg/l利福平，25mg/l庆大霉素)中继续培养至OD600值为0.4～0.6，培养条件同上。上述培养液到无菌的50ml离心管中，置冰上放置10min，4℃、5000r/min离心2min；弃上清，用50ml冰预冷的去离子水洗两次；最后，用残存在离心管中的液体悬浮菌体即制成农杆菌感受态细胞。电激转化时，取0.1μg质粒，加入50μl农杆菌感受态细胞(在电激转化杯中)，轻弹混匀，冰浴10min，按BIO-RAD电激转化仪手册操作转化。
挑取含植物表达载体的GV3101农杆菌菌斑，接种在1ml培养基中过夜培养，将培养物转入500ml YEP培养基中(50mg/lrif，25mg/l gen，50mg/l kan)，28℃下振荡过夜培养，使菌液浓度OD600＞2.0，离心收集菌体，重悬在1L渗透液中。
渗透液(1L)1/2MS盐+1X B5有机物+50g蔗糖+0.5g MES+0.01mg/L 6-BA+200μl Silwet L-77，用KOH调pH至5.7。
3.拟南芥转化——真空渗透法将拟南芥倒置，地上部分全部浸入渗透液中；400mm Hg真空5min，取出花钵，简单地甩去拟南芥上的渗透液，将花钵侧放在盘中，用塑料薄膜覆盖保湿；在培养室培养1天后，揭去薄膜，将花钵立起正常培养。转化后1个月，停止浇水，待种子成熟后收获。
4.转基因植株的筛选取40μl种子，用70％乙醇消毒10分钟，无水乙醇脱水3次，在超净台上彻底风干，用4ml 0.1％琼脂糖重悬种子，倒在筛选培养基平板上。4℃春化3天后，移入培养室发芽(20℃、24光照)，培养10-15天，选择生长健壮的抗性苗移入土壤中。
筛选平板MS盐+0.8％琼脂，pH 5.7，高压灭菌后，加羧苄青霉素300mg/l，卡那霉素100mg/l，倒在150×15mm平板中。
(五)植物组织GUS染色方法1)X-Gluc溶液100mM磷酸缓冲液(pH7.0)，0.3mM高铁氰化钾，0.3mM亚铁氰化钾，0.2％Triton-X100，100μg/ml氯霉素，1mM X-Gluc2)将拟南芥叶片或幼苗放入2ml离心管中，加入5适量X-Gluc溶液，使所有组织均被浸没，37℃温浴2小时。
3)除去X-Gluc溶液，分别用30％、50％、70％和100％乙醇脱色。
4)70％乙醇保存，用立体显微镜观察照像。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其特征是包含与序列SEQ ID NO1或其互补序列相同的核酸片段。
2.一种分离的核酸分子，其特征是包含序列SEQ ID NO1中至少10个以上连续的核酸序列或其互补序列。
3.一种启动子，其特征是包含权利要求1或2所述的核酸分子。
4.根据权利要求1或2所述的核酸分子或权利要求3所述的启动子，其特征是能够赋予与之相连的操作基因、结构RNAs、RNAi、hnRNA、mRNA和反义RNA在植物的特定组织中优势表达；所述特定组织指的是茎、叶表皮被毛，种皮毛，棉纤维，植物根系和子叶。
5.一种构建体，包含有权利要求1-4中的一个或多个组合的核酸片段或与其它异源核酸片段组合的核酸片段。
6.一种植物，包含权利要求5中的核酸构建体。
7.根据权利要求6中所述的植物，其特征是所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
8.一种权利要求书6所述的植物的产生方法，其特征在于包括以下步骤a)在植物细胞的基因组中插入重组DNA分子，该DNA分子包括启动子、基因和终止子三个可操作连接的片段；启动子片段包含SEQ ID NO1或其变异体序列，该启动子与编码蛋白质或可转录为RNA的基因相连，再与在植物中具有转录终止功能的终止子相连；其中第一个DNA片段与第二个DNA片段异源。b)得到转化的植物细胞；c)使上述转化的植物细胞再生成植株；d)从上述植物中选择高产类型。
全文摘要
本发明公开了一种能赋予植物启动子组织特异性表达或在特定组织中优势表达的DNA调控元件，以及对其修饰、制备和应用的方法；利用调控元件与植物的基本启动子或其它植物启动子的重组能调节与之相连的DNA序列的转录表达水平，如使其在植物的某些特定组织中转录或转录增强，而在另一些组织中不转录或转录水平下调，特别是在植物茎、叶表皮被毛(刺)，种皮毛，棉纤维，植物根系和子叶中特异或优势表达。本发明包含了含有该调节元件的合成的或天然的启动子及其变体，这些启动子可以应用于棉纤维品质改良、植物抗病或抗虫基因工程，以及其它的植物遗传改良工程中。
文档编号C12N15/82GK101058813SQ200710100469
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月12日 优先权日2007年4月12日 公开号200710100469.发明者崔百明, 彭明, 周鹏, 张秀春 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所