专利名称：昆虫抗性植物及产生该植物的方法
技术领域：
本发明涉及编码具有杀虫活性的经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA序列。本发明还涉及用于产生昆虫抗性植物的方法，该方法通过将包含该经修饰Cry1Ab编码序列的外源DNA导入植物基因组而实现。本发明还涉及在其基因组内包含本发明的经修饰Cry1Ab编码序列的植物或其部分。
背景技术：
众所周知，革兰氏阳性土壤细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)产生对多种鳞翅目、鞘翅目及双翅目幼虫具有毒性的蛋白质或δ-内毒素。已显示苏云金芽孢杆菌的不同菌株产生不同的杀虫晶体蛋白，所述蛋白质对特定种的昆虫具有特异毒性(由Hfte和Whiteley，1989；Schnepf等，1998综述)。
由苏云金芽孢杆菌产生的杀虫毒素对目标昆虫的特异毒性及其对植物和其他生物体的无毒性，使得包含不同Bt菌系的组合物成为用于农业虫害生物学控制的选择产品。已克隆出多种编码晶体蛋白的基因并测定了其DNA序列(Hfte和Whiteley，1989；Crickmore等，1995)。这已导致人工设计经修饰δ-内毒素编码基因以及研发表达该δ-内毒素基因的植物以使其具有昆虫抵性。
Cry1基因家族编码Cry1晶体蛋白，该蛋白主要对抗鳞翅目昆虫具有活性。Cry1δ-内毒素的原毒素形式由C-末端原毒素部分组成，该部分无毒且认为其对于晶体形成至关重要(Arvidson等，1989)。原毒素的氨基部分包含Cry1蛋白质的活性毒素片段。已进一步鉴定出活性毒素中的不同结构域，这些结构域参与毒性效应的不同方面(Grochulski等，1995)。然而，这些功能似乎依赖于检测的δ内毒素。
已进行了大量的尝试来修饰cry1基因以提高其在植物内的表达水平并同时至少保留其对目标昆虫的毒性。对cry1Ab和cry1Ac基因进行修饰以移除推定的植物聚腺苷酸化信号和不稳定基序(不改变编码的氨基酸序列)导致经这些序列转化的植物抗性增强(van der Salm等，1994)。在US 6,320,100、US 6,180,774和US 6114608中描述了cry1Ab基因的修饰。US 5,500,365描述了在cry1Ab基因编码区的240区域进行修饰以移除推定的植物标记，对于提高表达水平并由此提高Cry毒素在植物中的毒性是何等重要。
本发明涉及新型的经修饰Cry1Ab蛋白质和编码该蛋白质的DNA序列，所述物质可用于改造植物的昆虫抗性。更具体地，发现尽管具有天然的240区域，该修饰序列仍可确保在植物细胞内足够高的表达以赋予表达其的植物或植物组织具有昆虫抗性。
发明概述本发明涉及经修饰Cry1Ab编码序列，该序列编码SEQ ID NO1的经修饰Cry1Ab蛋白质，前述修饰蛋白质为一种杀虫蛋白质。根据本发明的一个特定实施方案，编码该经修饰Cry1Ab序列的DNA序列对应于SEQ IDNO2的序列，或包含SEQ ID NO2的序列。
本发明进一步涉及在植物中可表达的启动子控制下的包含本发明的经修饰Cry1Ab DNA序列的嵌合基因。根据本发明的特定实施方案，植物中可表达的启动子为组成型启动子、组织特异型启动子或创伤诱导型启动子，或是一种确保至少在易受昆虫袭击的植物细胞或组织中表达经修饰Cry1Ab蛋白质的启动子。
本发明进一步涉及包含本发明嵌合基因的重组载体，以及涉及应用该重组载体产生转基因植物。
本发明进一步涉及在其基因组内包含外源DNA的植物和其细胞、种子或组织，其中所述外源DNA含有在植物中可表达的启动子控制之下的本发明经修饰Cry1Ab DNA序列。
本发明也涉及通过将外源DNA导入植物基因组以用于人工设计植物昆虫抗性的方法，所述外源DNA包含在植物中可表达的启动子调控下的本发明的经修饰Cry1Ab编码序列。
根据本发明的特定实施方案，经修饰Cry1Ab编码序列特别适用于对如玉米和棉花的农作物设计昆虫抗性。最特别地，经修饰Cry1Ab蛋白质的表达赋予这些植物鳞翅目害虫的抗力。更特别地，这些害虫包括但不限于主要为玉米、棉花和水稻的鳞翅目害虫，如Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟或ECB)，Sesamia nonagrioides(地中海普通蛀茎夜蛾)，Sesamiainferens(粉茎螟)，Helicoverpa zea(谷实夜蛾，棉蛉虫)，Helicoverpaarmigera(美洲棉蛉虫)，Heliothis virescens(烟芽夜蛾)，Scirpophagaincertulas(黄茎螟)和Cnaphalocrocis medinalis(稻纵卷叶螟)。
发明详述此处应用的术语“基因”指包含几个可操作连接的DNA片段的任何DNA序列，所述DNA片段如启动子区、5’非翻译区(5’UTR)、编码区和包含聚腺苷酸化位点的非翻译3’区(3’UTR)。基因也可包括额外DNA片段如内含子。虽然用于本发明植物转化的基因中需要启动子和编码区，而包含聚腺苷酸化位点的3’UTR不必存在于被转移基因中，但在插入该不包含含有聚腺苷酸化位点的3’UTR的基因后所述3’UTR能够从上游植物DNA序列中获得。
当谈及基因或DNA序列时，术语“嵌合”用于指出这样的事实，即基因或DNA序列包含至少两种功能相关的DNA片段(如启动子，5’UTR，编码区，3’UTR，内含子)，上述片段并非天然地相互联结和/或所述片段例如源自不同的来源。关于植物种类所谈及基因或DNA序列的“外源”用于表示基因或DNA序列并非天然存在于该植物内，或并非天然地存在于该植物内的遗传位点中。此处将应用的术语“外源DNA”意指由于转化已导入植物基因组内的DNA序列。
如此处所应用的植物、植物组织或植物细胞的基因组，意指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
如此处所应用的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”意指涉及的原始DNA或蛋白序列(核酸或氨基酸)的一部分或其人工形式(例如适合植物最佳表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。此处应用的序列“变体”是指这样的DNA分子或蛋白质，即其序列(核酸或氨基酸)与术语所指的序列基本相同。
“基本相同”的序列意指当两个序列进行比对时，百分序列同一性，即较短序列内具有相同核苷酸或氨基酸位点的数量除以核苷酸或氨基酸的数量，高于70％，优选地高于85％，更优选地高于90％，特别优选地高于95％，最优选地在96％与100％之间。两个核苷酸序列的比对通过Wilbur和Lipmann(1983)所描述的算法进行，该算法应用的窗口大小为20个核苷酸，字长为4个核苷酸，缺口罚分为4。
如此处所应用的“植物中可表达的启动子”意指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。该启动子的示例为本领域内公知。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例为领域内已知，并包括来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、胭脂碱合成酶(NOS)启动子、ubi启动子(Christensen等，1992)、水稻GOS2基因的启动子(de Pater等，1992)。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)(如PEP羧化酶启动子)。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。‘创伤诱导’启动子或指导如此处所应用的创伤诱导的表达模式的启动子意指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达显著提高。创伤诱导启动子的示例包括马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pin1和pin2)(Johnson等，1989)和玉米蛋白酶抑制(MPI)基因的启动子(Cordero等，1994)。
如此处所应用的“TR2’启动子”涉及包含来源于农杆菌的TR1’-TR2’双启动子元件(Velten等，1984；Langridge等，1989)的TR2’(或甘露碱合成酶，简写为mas)功能部分的任何启动子。因此，在单子叶中特别是在玉米中，只要基本保留了本发明的创伤诱导特征，其可以只包含TR2’元件或包含其与全部或部分趋异TR1’元件(Guevara-Garcia等，1998)或其它调节(元件)的组合，其中所述其他(调节)元件包括但不限于增强子区、内含子等。在本发明的优选实施方案中，RT2’启动子区指导转录(且编码序列因此在TR2′启动子序列下游)，尽管使用了TR1’-TR2’双启动子(或保留了TR2’启动子元件的其任何部分)。
此处所应用的“杀虫的”意指对农作物害虫是有毒的。更具体地，在本发明的上下文中，目标昆虫是害虫，例如，但不限于，大部分鳞翅目害虫，如Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟或ECB)，Sesamia nonagrioides(地中海普通蛀茎夜蛾)、Helicoverpa zea(谷实夜蛾，棉蛉虫)、Helicoverpaarmigera(美洲棉蛉虫)和Heliothis viriscens(烟芽夜蛾)。
在本发明的优选实施方案中，编码杀虫晶体蛋白(ICP)的DNA为编码ICP的经修饰Cry1Ab DNA序列，所述ICP为经修饰Cry1Ab蛋白质。根据一优选实施方案，经修饰Cry1Ab编码序列编码与SEQ ID NO1序列相应的经修饰Cry1Ab蛋白质。根据本发明进一步优选的实施方案，经修饰Cry1Ab编码序列对应于SEQ ID NO2序列。根据本发明，用于植物特别是玉米、棉花或水稻转化的DNA序列，除了包含编码经修饰Cry1Ab蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区。
在本发明的优选实施方案中，经修饰Cry1Ab蛋白对如玉米、棉花和水稻这样的农作物的大多数鳞翅目害虫具有毒性。本发明的植物在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA，通过表达控制量的该蛋白而保护其免受害虫的威胁。控制量是指有毒的(致死的)或杀气的(亚致死的)剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物应当基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对由经修饰Cry1Ab蛋白质所靶向的昆虫)。
植物材料中ICP的表达水平可通过领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量(如由Cornelissen和Vandewiele所描述的，1989)，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量，如通过免疫学检测方法实现前述直接检测。更具体地，根据本发明，经修饰Cry1Ab蛋白质的表达水平用如通过此处描述的免疫特异ELISA所检测的可溶性杀虫蛋白质与可溶性蛋白质总量(如通过Bradford分析测定(Bradford，1976))的百分比来表示。本发明中优选的ELISA为夹心ELISA(Clark等，1986)。
可应用不同的试验测定植物中ICP表达的杀虫效果或功效。根据本发明，目标昆虫为如玉米、棉花和水稻的农作物的大部分鳞翅目害虫，更具体地为玉米中的欧洲玉米螟(ECB)和地中海普通蛀茎夜蛾(SMG)，棉花中的棉蛉虫(CBW)和烟芽夜蛾(TBW)，水稻中的黄茎螟、粉茎螟和稻纵卷叶螟。在玉米植物内产生的ICP对ECB的毒性可通过测试从植物提取出的蛋白喂养ECB幼虫进行体外检测，或通过计算培养皿内分布于转化植物的叶片材料上的幼虫死亡率(这两种检测方法由Jansens等，1997描述)，或通过在单独的圆柱内隔离的植物上检测。田间第一批欧洲玉米螟(ECB1)侵害是基于叶片损伤级别进行评估(Guthrie，1989)，而通过评估每株植物茎上虫道的总数和茎上虫道的长度来指示第二批ECB(ECB2)茎干进食伤害。
类似地，可应用体外和/或体外试验测定在经修饰Cry1Ab基因转化的棉花植物中产生ICP的功效。转化的植物组织对CBW幼虫的毒性可通过在棉蕾、叶或顶端上喂养CBW幼虫并测试存活幼虫的重量而进行测定。在田间，人为地使植物大量感染新生CBW幼虫，并定期检测对叶、顶端、棉蕾、白花和棉桃的损害(如此处所描述)。人们会理解，可研发用于任何目标或非目标昆虫的类似检测方法以测定植物内产生的抗这类昆虫的ICP的功效。
本发明的植物也任选地在其基因组内包含编码除草剂抗性的基因。更具体地，除草剂抗性基因为赋予植物glufosinate耐受力的bar基因或pat基因，即植物对除草剂LibertyTM耐受。可通过不同的方法测试对LibertyTM的耐受。例如，可通过LibertyTM喷雾施用测试耐受力。为得到最好结果，喷雾处理应在植物V2和V6期进行(玉米期的测定见“玉米植物如何生长(“How a Corn Plant Develops”)，特别报告48期，Iowa State Universityof Science and Technology，Cooperative Extension Service，Ames，Iowa，，1993年6月再版；也可参见网址http//www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agriculture/corn/corn_develop/CornGrowthStages.html)。耐受植物的特征为以下的事实，即以最少200克活性成分/公顷(g.a.i./ha)优选地为400g.a.i./ha且可能达到1600g.a.i./ha(4倍正常田间比率)喷洒植物而不会杀死植物。广泛施用应以28～34盎司LibertyTM+3磅硫酸铵/英亩的比率进行施用。使用扁平扇形喷嘴施用体积为20加仑水/英亩为最佳，同时应注意不要直接喷洒施用到植物的轮生体内以避免表面活性剂灼伤叶子。除草剂效果应在48小时内出现，并在5-7天内清晰可见。
其他除草剂抗性基因的实例为编码苯敌草抗性的基因(如pmph基因；US 5,347,047；US 5,543,306)、编码草甘膦抗性的基因(如EPSPS基因，US5,510,471)、编码溴苯腈(bromoxynil)抗性的基因(如在US 4,810,648中描述的)、编码磺酰脲抗性的基因(如在EPA 0 360 750中描述的)、编码对除草剂茅草枯的抗性的基因(如在WO 99/27116中描述的)和编码对氨腈抗性的基因(如在WO 98/48023和WO 98/56238中描述的)和编码谷氨酰胺合成酶抑制剂如PPT的抗性的基因(如在EP-A-0 242 236、EP-A-0 242 246、EP-A-0 257 542中描述的)USUSUSUS。
可应用领域内所描述的常规转化方法将外源DNA导入植物细胞。这些方法包括但不限于，农杆菌介导的转化(US6,074,877，Hiei等，1997)，微量发射轰击(例如由Chen等，1994；Casas等，1995；Christou，1997，Finer等，1999，Vasil等，1999所描述的)，直接将DNA摄入原生质体(例如由De Block等，1989；Poulsen，1996，Datta等，1999所描述的)，电穿孔(D’Halluin等，1992，US5,641,665；Bates，1995)或硅晶须介导的DNA导入(Dunwell，1999)或其他由Potrykus(1990)，Sawahel等(1995)，Komari等(1998)，Bogorad(2000)和Newell(2000)所概括性综述的方法。
下面的非限定实施例描述了编码经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA序列的产生，描述了用于植物内表达的包含该序列的嵌合基因的构建，以及描述了由其获得的昆虫抗性植物。实施例中除特别声明外，所有重组DNA技术都根据Sambrook和Russell(2001)《分子克隆实验指南》(MolecnlarCboningAlaboratong Manual)第三版，冷泉港实验室出版社，NY，及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的第一和第二卷及Brown(1998)Molecular BiologyLabFax，第二版，Academic Press(UK)的第一和第二卷中描述的标准方案进行。植物分子操作的标准材料和方法在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。聚合酶链式反应的标准材料和方法可以参见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerALaboratory Manual，冷泉港实验室出版社和McPherson等(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第一版，Springer Verlag，德国。
在描述和实施例中，参考在序列表中描述的下列序列。
SEQ ID NO1经修饰的Cry1Ab蛋白质SEQ ID NO2编码经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA序列实施例1.经修饰Cry1Ab基因的生成此处应用的经修饰Cry1Ab DNA序列编码由Hfte等(1986)所描述的与1到616位氨基酸相应的Cry1Ab5蛋白质部分，所述序列在ATG起始密码子的3’插入一丙氨酸密码子(GCT)(AlaAsp2…Asp616)。经修饰Cry1Ab蛋白质的蛋白序列在SEQ ID NO1中提供。编码该经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA序列在SEQ ID NO2种提供。
2.玉米中的Cry1Ab基因I.玉米中Cry1Ab事件的生成对于用农杆菌转化玉米时，产生的构建体中cry1Ab编码序列置于不同启动子35S启动子(Odell等，1985)、ubi启动子(Christensen等，1992)、来自水稻的GOS2基因的启动子(de Pater等，1992)的调控之下，具有来自矮牵牛的cab22前导序列(Harpster等，1988)、来自水稻GOS2基因的5’前导序列，含有GOS转录体(de Pater等，1992)的第二外显子、第一内含子和第一外显子，或TR2’启动子区(Velten等，1984)；所有的构建体均包括35S-bar基因。通过将源自未成熟胚的I型愈伤组织与菌株C58C1(pTiEHA101)(pTTS35)共培养进行农杆菌介导的转化，(用携带有非致癌Ti质粒pTiEHA101的pTiC58处理的农杆菌C58C1RifR菌株(Hood等1986)且下面表格中的质粒含有置于T-DNA边界间的目的基因)。
原生质体转化通过PEG介导的原生质体转染进行，所述原生质体从源自Pa91xH99xHE89 Z15胚的悬浮培养物制备。用于转染的DNA为以下表格中质粒的纯化片段，该质粒在T-DNA边界间含有目的基因。
基于Liberty耐受性和/或通过ELISA(Clark等，1986)进行PAT蛋白质水平检测筛选再生植株苗。
II.事件评估a)总体特征检测农杆菌转化株在T-DNA左边界的载体序列的存在。对初级转化株(T0)的叶片材料进行Southern印迹分析。
b)经修饰Cry1Ab蛋白质的表达在温室中对Cry1Ab表达事件进行分析，所述分析通过检测可溶性的经修饰Cry1Ab蛋白质在不同组织中的水平实现，检测应用缩聚IgG级分进行Cry1Ab夹心ELISA，以抗Cry1Ab的多克隆兔抗血清作为一级抗体并以抗Cry1Ab的单克隆抗体作为二级抗体。
表1中提供了经p35S-cry1Ab构建体转化的早期轮生体植物的不同组织中经修饰Cry1Ab蛋白质的表达水平。由p35S-cry1Ab事件所获得事件的不同植物后代中，发现其表达为组成型，且均值为0.5％以上。
表1 早期轮生体植物的不同组织中Cry1Ab的表达
对于经p35S-cry1Ab、pGos-cab-cry1Ab、pGos-gos-cry1Ab和pTR2-cry1Ab构建体转化的植物，表2中提供了在早期V、R1和R4-5期的叶子、R4-5期核和花粉的不同组织中Cry1Ab蛋白质的表达水平。结果表示为从5株植物中采取的叶子和核样本的平均值以及从3株植物中采取的花粉样本的平均值(括号内为标准差)。单株p35S-cry1Ab植物的ICP表达高于总可溶性蛋白质的0.1％。显示在pGos-cab-cry1Ab植物的叶片内Cry1Ab的表达约为0.01-0.06％。由pGos-gos-cry1Ab构建体获得的事件在叶片组织中表现为高表达(0.2-0.6％)。在经创伤诱导的TR2’启动子调控下的经修饰Cry1Ab DNA序列(pTR2’-cry1Ab)转化的植物叶片内，蛋白质的基础表达低到无法检测。
表2 经Cry1Ab基因转化的植物的不同组织中Cry1Ab蛋白质的表达
在温室研究中，对于用不同构建体获得的事件测定下述物质中经修饰Cry1Ab蛋白质的表达，所述物质为V3期植物的叶片样本，以及能够获得的R1期植物的叶片和花粉，和收获时植物的叶片、茎和花粉。具有pGos-gos-cry1Ab构建体的植物也在叶片中显示出Cry1Ab的高表达(＞0.2％总可溶性蛋白质)(与所应用的转化方法无关)。对于这些植物而言，在茎内也存在高水平的表达(平均0.8％总可溶性蛋白质或更多)。在所有测试组织中经pTR2’-cry1Ab构建体转化所获得事件显示出低表达(平均0.02％总可溶性蛋白质或更少)或检测不到Cry1Ab蛋白质的表达。
c)可诱导的Cry1Ab表达对于经pTR2’-cry1Ab构建体获得的事件，在温室内进行研究以检测机械损伤后Cry1Ab蛋白质的表达。在损伤前和机械损伤后18小时采集叶片样本，并通过ELISA检测Cry1Ab蛋白质水平(表3)。切下损伤的叶片部分并在培养皿中于Murashige和Skoog(MS)培养基湿润的滤纸上室温培养18小时(Plant Molecular Biology Labfax(1993)，R.D.D.Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications联合出版，英国)，然后用夹心ELISA试验检测Cry1Ab蛋白质水平。从植物上切下未损伤的对照叶片部分(与损伤部分的大小类似)，并立即置于干冰上以用于蛋白质分析。
表3机械损伤之前和之后在植物不同部分中杀虫蛋白质的表达
在检测的不同pTR2’事件的叶片、茎和核中，Cry1Ab蛋白质的表达或者不存在或者位于检测极限附近。在植物脱落期的轮生体和花粉中，叶片和花粉中未发现高于背景水平(如在未经转化的对照植物内所发现的)的表达。在根内也存在组成型表达。当叶片受到机械损伤时，诱发了经修饰Cry1Ab蛋白质的表达，并在V4期叶片中表达升至0.02-0.1％。
d)ECB功效ECB功效试验在温室内和在田间的两个不同场所中进行。同时，评估导入的构建体对植物的毒性效应。表4显示了对ECB测试的功效的结果。在温室内，通过测定10株植物的茎上虫道长度(cm)/茎确定ECB功效，且表述为茎上虫道的平均长度/最大数目的茎上虫道/每棵植物(括号内为标准差)。在田间，ECB功效以从10棵植物的不同组获得的3个值的均值表示。
表4 在温室内和田间不同位置里的ECB功效试验
在温室内及在田间不同位置的试验内，p35S-cry1Ab事件给出了绝对的ECB控制，这与高剂量表达(如上所述)相关。类似地，在所有测试位置，pGos-gos-cry1Ab和pGos-cab-cry1Ab事件显示出良好的ECB控制。pUbi-cry1Ab事件不显现良好的ECB控制。
对于p35S-cry1Ab或pGos-cab-cry1Ab事件的任意一个，未观察到植物毒性。在正常绿色植物的田间，pGos-gos-cry1Ab事件的自花授精种子显示出分离，且矮小的微黄植物(其较低叶片死亡)提示对农业特性的某些影响。
用pTR2’-cry1Ab构建体获得的14个事件在温室和田间试验中评估ECB功效(表5)。5个单拷贝事件中的4个(用*标记)给出了总体的ECB2控制。
表5温室内和田间对于pTR2’-cry1Ab事件的ECB功效
因此，显然，本发明提供了一种具有宏观表面特征的非织造布。虽然已结合具体实施方案描述了本发明，但显然，本领域技术人员在研读了上面的说明以后将十分清楚，尚有许多替代、修改和变换方案。因此，本发明将包括所有这些替代、修改和变换方案，只要它们落在所附权利要求的精神和概括范围之内。
II.事件分析a)经修饰Cry1Ab蛋白质的表达用ELISA检测叶片、顶端、棉蕾、花及棉桃样本中经修饰Cry1Ab蛋白质的表达(表7)。结果代表采集于9棵植株的样本中Cry1Ab蛋白质与总蛋白含量百分比的平均值。样品采集的时间点代表种植后的天数(括号内)。
表7.应用ELISA测定不同组织中的Cry1Ab表达
b)实验毒性测试CBW幼虫饲养在从田间取得的棉蕾、叶片和叶片顶端上。检测用于不同事件检测存活幼虫的重量(表8)。来自2株非转基因植物和一株来自包含除草剂抗性基因(LL25事件)的植物的样本用作对照。
表8.棉花中表达的经修饰Cry1Ab对CBW幼虫的毒性
c)田间昆虫控制的功效在田间，植物用新生CBW幼虫进行人工感染。评价对叶片、顶端、棉蕾、白花和棉桃的损伤级别，且在8月和9月间每8天进行计数。从5个观察数据计算均值。统计分析表明，发现顶端、白花和棉桃的平均损伤严重性存在显著的差异。对照的棉蕾损伤和棉桃损伤的平均值也高于Cry1Ab事件；与对照相比，棉蕾内幼虫的平均数量也显著降低。
实施例4.水稻的Cry1Ab基因制备用于在水稻中表达的经修饰Cry1Ab基因的构建体。构建体包含位于启动子控制下的经修饰Cry1Ab编码序列(编码由Hfte等，1986描述的Cry1Ab5蛋白部分，该序列在ATG起始密码子的3’插入一丙氨酸密码子(GCT))，所述序列具有来自水稻GOS2基因的5′引导序列，含有GOS转录体的第二外显子、第一内含子和第一外显子(de Pater等，1992)。该构建体用于水稻的转化。获得的事件进行分子分析以证实转基因的存在。
通过计算存活幼虫的数量测试25个不同事件的植物对稻纵卷叶螟、黄茎螟和粉茎螟的控制。以对叶片的损伤(对卷叶螟)或在开花前期死心数量/分蘖数量(黄茎螟和粉茎螟)或在开花期白头数量/分蘖数量(黄茎螟)评价对植物的损伤。仅在2个事件植物上发现存活有一些幼虫(25个中存活5-7个)。其他所有事件的全部植物出现90-100％的死亡幼虫。而当用稻纵卷叶螟感染对照植物时，要么完全干死要么出现许多卷叶，cry1Ab事件的植物无一出现任何显著的损伤。类似地，用黄茎螟或粉茎螟感染的cry1Ab事件的植物，也未检测到死心或白头。
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序列表<110>拜尔生物科学公司<120>昆虫抗性植物及产生该植物的方法<130>MOD1AB WO1<150>US 10/137682<151>2002-05-03<160>2<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>617<212>PRT<213>人工序列来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的经修饰蛋白<400>1Met Ala Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys1 5 10 15Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr20 25 30Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu35 40 45Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile50 55 60Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln65 70 75 80Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln85 90 95
Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala100 105 110Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg115 120 125Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr130 135 140Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser145 150 155 160Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val165 170 175Ser Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser180 185 190Arg Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala195 200 205Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser210 215 220Arg Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr225 230 235 240Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr245 250 255Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro260 265 270
Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile275 280 285Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile290 295 300Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His305 310 315 320Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe325 330 335Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val340 345 350Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr355 360 365Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu370 375 380Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala385 390 395 400Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro405 410 415Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser420 425 430His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile435 440 445
Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn450 455 460Asn Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser465 470 475 480Thr Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr485 490 495Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu500 505 510Arg Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile515 520 525Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly530 535 540Arg Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser545 550 555 560Asn Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe565 570 575Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe580 585 590Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala595 600 605Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp610 615
<210>2<211>1854<212>DNA<213>人工序列编码经修饰苏云金芽孢杆菌蛋白的序列<400>2atggctgaca acaaccccaa catcaacgag tgcatcccct acaactgcct gagcaaccca 60gaggtggagg tgctgggtgg tgagaggatc gagaccggtt acacccccat cgacatcagc120ctgagcctga cccagttcct gctgagcgag ttcgtgcctg gtgctggctt cgtgctggga180ctagtggaca tcatctgggg catcttcggt cccagccagt gggatgcctt cctggtgcag240atcgaacagt taattaacca aagaatagaa gaattcgcta ggaaccaagc catctctaga300ctggagggcc tgagcaacct gtaccagatc tacgccgaga gcttccgcga gtgggaggct360gaccccacca acccagccct gcgcgaggag atgcgcatcc agttcaacga catgaactct420gccctgacca ccgccatccc actcttcgct gtccagaact accaggtccc tctcctgtct480gtctatgtgc aagctgccaa cctccatctc agcgtccttc gcgacgtgag cgtctttggg540cagaggtggg ggttcgacgc tgccaccatc aacagccgct acaacgacct gacgcgtctg600atcggcaact acaccgacca cgcagtgaga tggtacaaca ctgggcttga gagggtctgg660ggtcccgaca gccgcgactg gatcaggtac aaccagttca ggcgtgaact cactctcacc720gtcttggata tcgtcagtct cttccccaac tacgacagca ggacctaccc tatccggact780gtgagccagc tgacccgcga gatctacacc aaccccgtgc tggagaactt cgacggcagc840ttcaggggct ctgcccaggg catcgagggc agcatccgca gcccccacct gatggacatc900ctgaacagca tcaccatcta cactgacgcc cacaggggtg agtactactg gtctggccac960cagatcatgg cttctcccgt gggcttcagc ggtcccgagt tcaccttccc cctgtacggc 1020acaatgggca acgctgcccc acagcagagg atcgtggccc agctgggcca gggcgtgtac 1080
cgcaccctga gcagcaccct gtacaggagg cccttcaaca tcggcatcaa caaccagcag 1140ctgagcgtgc tggatggcac cgagttcgcc tacggcacca gcagcaacct gcccagcgcc 1200gtataccgca agagcggcac tgtggacagc ctggacgaga tcccacccca gaacaacaac 1260gtgcccccta ggcaggggtt ctctcatcgc ctctcacacg tgagcatgtt ccgcagcggc 1320ttcagcaaca gcagcgtgag catcatcagg gctcccatgt tcagctggat ccaccgcagc 1380gctgagttca acaacatcat tccaagtagc cagatcactc agatcccact caccaagagc 1440accaacctgg gctccgggac tagcgttgtc aagggaccag ggttcactgg aggcgacatc 1500ctgaggagga ccagcccagg ccagatcagc accttaaggg tgaacatcac cgctcccctc 1560agccaacgct acagggtcag gatcaggtac gcttccacca ccaacctgca gttccacacc 1620agcatcgacg gcaggcccat caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc 1680aacctgcaga gcggaagctt ccgcactgtg ggcttcacta ccccattcaa cttctccaac 1740ggcagcagcg tgttcaccct gtctgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc 1800gacaggatcg agtttgtccc agctgaggtg accttcgaag ctgagtacga ctga 185权利要求
1.DNA序列，其包含编码含有SEQ ID NO2核苷酸序列的经修饰Cry1Ab蛋白质的编码区。
2.嵌合基因，其包含位于植物中可表达的启动子调控下的权利要求1的DNA序列。
3.重组载体，其包含权利要求2的嵌合基因。
4.转基因植物细胞，其包含权利要求2的嵌合基因。
5.转基因植物，其包含权利要求4的植物细胞。
6.权利要求5的转基因植物，其选自玉米、棉花或水稻。
7.权利要求6的植物的种子，其包含SEQ ID NO2的DNA序列。
8.用于保护植物免受鳞翅目昆虫虫害的方法，该方法包括将权利要求2的嵌合基因导入植物。
9.权利要求8的方法，其中所述昆虫害虫选自欧洲玉米螟、地中海普通蛀茎夜蛾、棉蛉虫、烟芽夜蛾、黄茎螟、粉茎螟和稻纵卷叶螟。
全文摘要
本发明涉及编码具有杀虫活性的经修饰Cry1Ab蛋白质的DNA序列。本发明进一步涉及用于产生昆虫抗性植物的方法，所述方法为将包含该经修饰Cry1Ab编码序列的外源DNA导入植物基因组。本发明还涉及在其基因组中包含本发明经修饰Cry1Ab编码序列的植物或其部分。
文档编号C07K14/325GK1650018SQ03810038
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月29日 优先权日2002年5月3日
发明者S·简森斯, S·范霍德特, A·雷纳尔特斯 申请人:拜尔生物科学公司