用于赋予对植物病害生物和植物病原体抗性的方法和材料的制作方法

专利名称：：用于赋予对植物病害生物和植物病原体抗性的方法和材料的制作方法用于赋予对植物病害生物和植物病原体抗性的方法和材料本申请要求2004年10月21日提交的美国临时申请第60/621,542号和2005年3月1日提交的美国临时申请第60/657,821号的优先权，两份申请在本文中完整地引用作为参考。发明领域植物病害生物(例如真菌病原体、细菌、线虫、昆虫、病毒等)引起世界范围、尤其在U中国家中食物和纤维的重要损失.损失包括直接产量损失或M前损失、收IL^损失和贮藏损失以^L食物品质和安全性降低(例如因为真菌毒素的产生).在因美学特性、芳香特性或生态特性而有^h值的植物中观察到源自植物病害生物的其它损失。植物病害生物有时可以通迚拖用化学品(例如杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀寄生虫剂)、操纵或管理微观环境或通过病原体抗性基因进行控制。发现并导入抗性"新"基因常导致能够感染含有这种"新"基因的病原体新种族的发生和选择。这已经通过谷物作物的锈菌病和黑粉病得到最充分证实，但是它还可能随土源疾病如分别由烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)和大豆疫霉(P.sojae)所致的烟草黑胫病和大豆根腐和茎腐病发生。存在至少两个种的烟草疫霉以J5U^过70个种的大豆疫霉，所有这些均需要不同基因或基因的组合用于疾病抗性。疫霉属真菌包含引起植物严重疾病的破坏力非常强的众多病原体物种。这些严重疾病包括影响种类繁多的粮食作物、纤维作物和油料作物，包括鲟梨(avocado)、可可(cacao)、卡诺拉油菜(canola)、柑桔(citrus)、胡椒(pepper)、马铃薯、大豆、烟草、番茄、松(pine)、橡胶(rubber)、栎树(oaktree)等的枯萎病、猝倒病、溃疡病、烂果病、根腐病、萎蔫和许多其它症状。基因沉默或RNA干扰(RNAi)现象过去十年间已经在众多生物如植物、真菌、线虫、水螅和人中描述和表征(Zamore和Haley，2005)。据认为该现象是一种古老的防御机制，其中宿主生物将双链RNA分子识别为外来物并且使之水解。得到的水解产物是称作小干扰RNA(siRNA)的长度21-30个核苷酸的小RNA片段，siRNA随后扩散或被携带至宿主全身各处，在那里它们与特定基因的mRNA杂交并且引起mRNA水解以产生更多siRNA。该过程每次在siRNA与其同源的mRNA杂交时重复，有效地阻止mRNA翻译，并且使特^Jl因的表达"沉默"。Fire等(2003)描逸法用RNA至宿主的方法，其中RNA由与宿主细胞的基因同源的有义序列和反义序列组成以沉默此宿主细胞的基因。US6,506,559。vanWest等(1999)得到的结果证实致病疫霉中的核间基因沉默。他们以处于有义方向和反义方向的infl激发素(elicitin)基因转化致病疫霉。此^f"致转基因以及内源基因的沉默。通过已沉默的转基因菌抹和野生型菌林的体细胞融合，他们说明两个重要论点；首先，转基因自身的存在对维持受沉默的状态不是必需的；其次，涉及的能够在细胞核间转运沉默信号的反式作用因子后来发现是siRNA。Waterhouse等(WO9953050Al)已经描述通过用针对植物病毒基因的基因沉默构建体转化植物而向植物赋予病毒抗性的方法。Wang等(US20030180945A1)描述通过提供真菌针对真菌基因的基因沉默构建体在真菌中沉默基因的方法.本
技术领域：
内所需的是可iSil适应于生物环境中的变化，如新发的严重植物疾病的植物抗性方法。例如，在美国直到2004年12月大豆中未出现亚洲锈菌病。预计亚洲锈菌病在2005-2006年引起预计10亿至70亿美元(USDA)损失，如果存在赋予植物对真菌、昆虫、线虫、细菌等抗性的通用遗传方法，也将显著推进^L术领域。发明概述本发明现在提供用于向植物赋予病害生物抗性的方法和构建体，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反5l^列，和(b)基本互补于所it^义序列的有义序列；其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有X^列编码的核苷酸的双链区；其中所述的有义序列和反义序列分别是长度至少大约19个核苷酸；并且其中反义序列与来自不同物种的至少两种病害生物的致病性基因同」害生物是抗';的。、、'土$，在另一个实施方案中，本发明提供了用于向植物赋予病害生物抗性的方法和构建体，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对第一病害生物致病性基因同源性的第一反义序列；(b)具有对第二病害生物致病性基因同源性的第二反义序列；(c)基本互补于所述第一反义序列的第一有义序列；和(d)基本互补于所述第二反义序列的第二有义序列，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由第一反义序列和第一有义序列编码的核苷酸的双链区，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由第二反义序列和第二有义序列编码的核苷酸的双链区，并且其中所述的第一和第二有义序列以及第一和第二反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸，因此，现在可以使植物对属于选自昆虫、细菌、真菌、植物和线虫的相同或不同成员的多种病害生物抵抗。在另一个实施方案中，本发明提供了用于向植物赋予病害生物抗性的方法和构建体，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)有效地连接至反义序列的第一启动子，其中所述反义序列与病害生物致病性基因同源并且有效地连接至终止子；(b)有效地连接至有义序列的第二启动子，其中所i^义序列与所i^义序列基本互补并且有效地连接至终止子；其中所述的第二启动子是相对于第一启动子的强启动子，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以在反义序列和有义序列所编码的序列间形成双链区，其中所述的有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供用于向植物赋予病害生物抗性的方法和构建体，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反义序列，和(b)基本互补于所i^义序列的有义序列；其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有:JC^列编码的核苷酸的双链区；其中所述的有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸，其中病害生物选自昆虫、细菌、真菌和线虫，并且其中病害生物致病性基因和病害生物选自本文中所教导的那些对象.发明简述图1植物转化质粒pCAMBIA1201的遗传图，该质粒用作为^i:授内容通篇范围的实例并且是pVZA100、pVZA200、pVZA300和pVZA400的骨架。图2在中间质粒pVZAl内的插入片段草图。图3是克隆在质粒pVZA3中并且随时用于转移至pCAMBIA1201的pVZA100沉默盒。图4M示从转基因烟草和从转基因烟草疫霉中分离的siRNA的放射自显影图。图4A和4B显示角质酶(cutinase)基因探针对分别来自野生型烟草植物和转基因烟草植物以及野生型烟草疫霉和转基因烟草疫霉的siRNA进行杂交的结果。图5显示温室中对烟草霜霉造成的烟草青霉病天然流行的植物反应。图6显示自转基因大豆胚产生的幼枝。图7显示以pVZA100转化的大豆的结果。图7A显示转化的大豆愈伤组织。图7B显示在转化的大豆愈伤組织中检测到的GUS和潮霉素磷酸转移酶基因。图8显示在以pVZA100转化的马铃薯细胞的培养亚中所产生的根和微块茎，图9显示能够在引起大豆严重疾病的三个真菌物种中沉默必需基因的多顺反子基因沉默构建体。图10显示基于rDNA并且能够沉HML疫霉、在层锈菌(Phakopsora)及在这两种真菌中沉默那些必需基因的基因沉默构建体.图11显示野生型烟草植物(A)和pVZA100转基因烟草植物(B)，分别对烟草疫霉易感和抵抗。图12是从转基因烟草植物(3)和从生长在受到沉默的转基因烟草植物(4)上的烟草疫霉中分离的siRNA的放射自显影图.图13显示抗大豆疫霉的转基因大豆植物.图14显示pVZA300和pVZA400对转基因烟草疫霉和转基因大豆疫霉生长和发育的影响。序列简述SEQIDNO:1是如才艮据主艰良明所用的PCR引物VZA1F。SEQIDNO:2是如根据主舰明所用的PCR引物VZA2RSEQIDNO:3是如根据主狄明所用的PCR引物VZA3F。SEQIDNO:4是如才艮据主艰t明所用的PCR引物VZA4R。SEQIDNO:5《j艮据主艰良明所用的沉默构建体pVZAlOO,SEQIDNO:6;IJL据主艰良明所用的沉默构建体pVZA200。SEQIDNO:7是4Mt主艰良明所用的沉默构建体pVZA300。SEQIDNO:84_#据主现良明所用的沉默构建体pVZA400。SEQIDNO:9是如#据主^1明所用的正向PCR引物GUS。SEQIDNO:10是如根据主JiyC明所用的反向PCR引物GUS。SEQIDNO:11是如根据主艰良明所用的PCR引物pVZA100和潮霉SEQIDNO:12是如根据主题发明所用的PCR引物pVZA100和潮霉SEQIDNO.13是如絲主狄明所用的引物VZA165R。SEQIDNO.14是如才艮据主^JL明所用的引物VZA269F。SEQIDNO.15是如#据主^1明所用的引物VZA373F。SEQIDNO.16是如^^据主JH^明所用的引物VZA373F。SEQIDNO.17是如#^据主艰殳明所用的引物VZA165。SEQIDNO.18是如根据主^iC明所用的引物VZA670F。SEQIDNO.19是如才艮据主艰殳明所用的PCR引物VZA772F。SEQIDNO.20是如#>据主败明所用的PCR引物VZA879F。SEQIDNO.21是如^^据主艰良明所用的PCRVZA984F引物。SEQIDNO.22是如才艮据主狄明所用的PCRVZA1087F引物。SEQIDNO.23是如根据主狄明所用的PCRVZA1189F引物。SEQIDNO.24是如^4t主现良明所用的PCRVZA1290F引物。SEQIDNO.25是如^^据主艰夂明所用的PCRVZA1391F引物。SEQIDNO.26是如才艮据主狄明所用的PCRVZA1481F引物。SEQIDNO.27是如根据主艰良明所用的PCRVZA1582F引物.SEQIDNO.28是如根据主^liL明所用的PCR引物VZA683F。SEQIDNO.29是如才艮据主题发明所用的PCR引物VZA1785F。SEQIDNO.30是如^4t主^C明所用的PCRVZA1886F引物。SEQIDNO.31是如才艮据主艰t明所用的PCRVZA1964R引物。SEQIDNO.32是如才艮据主^C明所用的PCRVZA2077F引物。SEQIDNO.33是如根据主艰t明所用的PCRVZA2163F引物。SEQIDNO.34是如才艮据主现良明所用的PCRVZA2266R引物。SEQIDNO.35是如才艮据主艰良明所用的PCRVZA2380F引物。SEQIDNO.36是如#>据主艰良明所用的PCRVZA2492F引物。SEQIDNO.37是如^^据主艰t明所用的PCR引物VZA2593F。SEQIDNO.38是如#>据主艰1明所用的PCR引物VZA2R.SEQIDNO.39是如#>据主^1明所用的PCR引物组织蛋白酶.SEQIDNO.40是如根据主*1明所用的PCR引物^JL素。SEQIDNO.41是如^^据主艰t明所用的PCR引物rDNAFP。SEQIDNO.42是如根椐主题发明所用的PCR引物rDNARP。SEQIDNO.43是如根据主题发明所用的标志-大豆茎褐腐病菌(Phialophoragregata)核糖体RNA基因(rDNA)。SEQIDNO.44是如根据主狄明所用的基因型BDNA标志-大豆茎褐腐病菌核糖体RNA基因(rDNA).SEQIDNO.45是如根据主题发明所用的核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)RNA聚合酶II亚基的部分rpb2基因。SEQIDNO.46是如根据主题发明所用的大麦柄锈菌(Pucciniahordd)18S核糖体RNA基因。SEQIDNO.47是如根据主题发明所用的核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)己糖转运蛋白(hxt2)基因。SEQIDNO.48是如根据主题发明所用的豌豆茄腐镰孢(FusariumsolanipisO角质酶mRNA。SEQIDNO.49是如根据主题发明所用的烟草疫霉的基因组或保守蛋白质基序。SEQIDNO.50是如根据主题发明所用的豆薯层锈菌基因组中存在的核糖体DNA序列。SEQIDNO.51是如根据主J^明所用的接骨木镰孢翻译延伸因子la。SEQIDNO.52是如根据主题发明所用的致病疫霉基因组中存在的激发素基因序列。SEQIDNO.53是如根据主题发明所用的核盘菌RNA聚合酶II亚基的部分rpb2基因。SEQIDNO.54是如根据主艰吏明所用的玉米狹壳柱孢(Stenocarpellamaydis)的rRNA。SEQIDNO.55是如根据主题发明所用的来自玉米尾胞菌(Cercosporazeaemaydis)II组的18S核糖体RNA。SEQIDNO.56是如根据主艰良明所用的来自桃奸(Myzuspersicae)的组织蛋白酶B蛋白酶.SEQIDNO.57是如根据主题发明所用的来自马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)的半胱氨酸蛋白酶。SEQIDNO.58是如根据主题发明所用的大丽轮枝菌(VerticiUiumdahliae)rDNA。SEQIDNO.59是如根据主题发明所用的Peronosporaberteroae基因组中存在的5.8S核糖体RNA的部分序列，SEQIDNO.60是如根据主题发明所用的奇特伍德根结线虫(Meloidogynechitwoodi)细胞色素氧化酶的基因组亚基.SEQIDNO.61是如根据主题发明所用的斯克布纳短体线虫(P.scribneri)核糖体RNA。SEQIDNO.62是如才艮据主艰&明所用的大豆胞嚢线虫(Heteroderaglycines)核糖体RNA'SEQIDNO.63是如根据主题发明所用的稻痘病菌(Magnaporthegrisea)RNA聚合酶II序列。SEQIDNO.64是如根据主题发明所用的大麦柄锈菌18S的rRNA。SEQIDNO.65是如根据主题发明所用的漳草假霜霉(Pseudoperonosporahumuli)的5.8S核糖体RNA的部分序列。SEQIDNO.66是如根据主题发明所用的灰葡萄孢(Botrytisdnerea)细胞色素P450单加氧酶。SEQIDNO.67是如根据主题发明所用的丁^H^单胞菌(Pseudomonassying狄)rRNA。SEQIDNO.68是如根据主题发明所用的密执安棍状杆菌(Clavibactermichiganensemichiganense)CeIA基因。SEQIDNO.69是如根据主JHj1明所用的密执安棍状杆菌的内切B-葡糖苷酶基因。发明详述定义如本文中所用，如下定义适用细胞(或宿主植物细胞)意指细胞或植物细胞的原生质体并且包括分离的细胞以M完整植物、植物器官或植物碎片内的细胞。细JlfeiE包括未分离的细胞。双链区意指在其中核香酸能够彼此形成氬鍵的多核苷酸区域，此类氢键可以是分子间或分子内的(例如形成具有所谓发夹的双链区的单一转录单元或适宜地排列以便互补序列形成氢键的两个转录单元)。为形成双链区，根据本发明，不必要区域内100%核苷酸互补及形成氬键。只需要存在足够的碱基配对以赋予RNA基本的双链特征(例如所指出的解链温度)，外源基因意指在给定宿主基因组中在现有形式下通常不存在的基因。就此而言，基因本身可以对宿主基因组是天然的，然而，此外源基因将包含因添加或缺失一种或多种不同调节元件或额外基因而受到改变的天然基因。基因意指这样的核酸序列(包括RNA或DNA)，其编码用于合成完整RNA、完整蛋白质或大到足以拥有所需特征的此完整RNA或完整蛋白质的任意功能性部分的遗传信息。异源多核苷酸意指在任何非转化宿主植物中不存在的任意多核苷酸。多核苷酸不因存在内源多核苷酸序列而不被认为是异源多核苷酸.同源性，M义序列与病害生物致病性基因(即结合RNA聚合酶并指导作为反义链的病害生物致病性基因mRNA转录的DNA链)间的关系而言，意指具有足以允许反义序列和病害生物致病性基因mRNA间在低严;NHt下进行体外、体内和/或离体杂交的序列相似性。宿主植物细胞抗性意指当与未经所述构建体转化的宿主植物细胞相比，植物对植物病害生物的有害影响易感性较低。基因表达的抑制意指来自耙基因的蛋白质和/或mRNA产物水平的降低。抑制的结果可以通过检查细胞或生物的外在特性(如在实施例中呈现)或通过生物化学技术如RNA溶液杂交、核酶保护、RNA印迹杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)逆转录PCR(RT/PCR)、以微阵列检测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、其它免疫测定和荧光激活的细胞分析法(FACS)加以证实，标记基因意指这样的基因，其赋予表达该标志基因的细胞明显表型因而允许经如此转化的细胞与不含该基因的细船目区别。有效地连接意指连接作为同一核酸分子的部分，处于合适于从启动子开始的转录的位置和方向，病害生物致病性基因意指在病害生物对宿主植物的有害影响中发挥作用的任何病害生物基因。有害影响意指例如对植物生长(植物的数量和/或大小)、发育、品质和/或繁殖不利的影响，仅在于举例，病害生物致病性基因可以是在病害生物生长、发育和/或繁殖，或病害生物侵袭或感染宿主植物的任意过程中发挥作用的病害生物致病性基因。涉及病害生物时，致病意指病害生物在植物上造成有害影响的能力。致病性由任意的病害生物致病性基因引起。植物病害生物意指对植物生长(植物的数量和/或大小)、发育、品质、产量和/或繁殖有害的任何活生物。此病害生物的非P艮制实例是昆虫、真菌、线虫、细菌和病毒。品质意指可以视*作受欢迎的植物的任何方面。通过非限制性举例，品质可以指植物的外观、产量、风味、营养价值、香^^内容物，就有义序列和反义序列而言，基本互补意指足够互补以允许形成双链分子.转化意指将外源DNA序列(例如载体、重组DNA分子)导入在其中该外源DNA以如此方式整合至染色体或能够自主复制以至于转录异源RNA的细胞或原生质体的过程。转录物意指由DNA编码的RNA。在本发明的有义转录物和反义转录物上下文中，此类有义转录物和反义转录物可以是同一多核苷酸的部分或是两个独立的多核苷酸(即各自具有自身5，端和3，端)。处理植物病害生物意指减少、消除、逆转或阻止植物病害生物对植物的有害影响。载体意指能够在宿主细胞中复制和/或向其中可有效地连接另一种DNA节段以至引起所连接节段发生复制的DNA分子.质粒是示例性的载体。本发明的多种实施方案的重点是通过以异源多核苷酸转化宿主植物细胞以赋予病害生物抗性而治疗植物，所述异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反义序列，和(b)基本互补于所itJl义序列的有义序列；其中所述有义和反义序列能够彼此杂交以形成双链区并且其中所述有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸。不被理论束缚，据信根据本发明转化的植物转录如此RNA分子，其具有与病害生物致病性基因同源的区域和与之互补的区域，并且其中转录物形成双链RNA(dsRNA)分子。植物将dsRNA识别有潜在的外来物质(例如病毒来源的物质)。植物的切丁酶将双链RNA切割为长度大约23个核苷酸的单链RNA片段，其称作小千扰RNA(siRNA)。这些siRNA由经消化植物细胞(例如角质)而已i^植物的侵入性病害生物所摄入。一旦吸收，siRNA可以掺入至病害生物的RNA诱导性沉默复合体(RISC)。RISC复合体随后消化病害生物同源基因的mRNA，P艮制病害生物损伤植物的能力。在一个实施方案中，向植物赋予病害生物抗性，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反义序列，和(b)基本互补于所i2L^义序列的有义序列，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有:JC^列编码的核苷酸的双链区，其中所述的有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因选自角质酶、激酶、核糖体RNA、黏附素、激发素和G蛋白；并且其中所述的病害生物是真菌。在一个实施方案中，向植物赋予病害生物抗性，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步驟，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反义序列；和(b)基本互补于所^A义序列的有义序列，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有:JC^列编码的核苷酸的双链区，其中所述的有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因选自激餘、核糖体RNA、G蛋白、蜕皮因子、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和保幼激素酯酶；并且其中所述的病害生物是昆虫.在一个实施方案中，向植物赋予病害生物抗性，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反义序列；和(b)基本互补于所述反义序列的有义序列，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有:^列编码的核苷酸的双链区，其中所述的有义序列和反义序列分别是长度至少大约19个核苷酸；其中所述的病害生物致病性基因选自激酶、核糖体RNA、G蛋白、角质层胶原蛋白和组织蛋白酶和其中所述的病害生物是线虫。在一个实施方案中，向植物赋予病害生物抗性，包括以异源多核苷酸转化宿主植物细胞的步骤，该异源多核苷酸包含(a)具有对病害生物致病性基因同源性的反:J^列；和(b)基本互补于所U义序列的有义序列，其中异源多核苷酸的转录物能够杂交以形成包含由反义序列和有iC^列编码的核苷酸的双J链区，其中所述的有义序列和反义序列长度分别是至少大约19个核苷酸，其中所述的病害生物致病性基因选自角质酶、离析酶(masceratingenzyme)、激酶、核糖体RNA、黏附素和G蛋白；和其中所述的病害生物是细菌。在一个实施方案中，宿主植物是大豆并且病害生物选自茄腐镰孢(Fusariumsolani)(例如猝死)、核盘菌(例如白霉病)、大豆茎褐腐病菌(例如褐色茎腐病)、豆薯层锈菌(例如亚洲锈病)和大豆疫霉(例如根腐和茎腐病)的成员之一。在一个实施方案中，宿主植物是十字花科植物并且病害生物是Alvcbgo(例如白锈病).在一个实施方案中，宿主植物是烟草并且病害生物是疫霉(例如茎腐病、根腐病).在一个实施方案中，宿主植物是马铃薯并且病害生物是疫霉(例如晚疫)。在一个实施方案中，宿主植物是青花菜(broccoli)并且病害生物U霉(Pythium)(例如猝倒病)。在一个实施方案中，宿主植物是豌豆(pea)和/或甜菜(sugarbeet)并且病害生物是丝嚢霉(Aphanomyces)(例如才艮腐病)。在一个实施方案中，宿主植物是烟草并且病害生物是霜霉(Peronospora)(例如青霉病)。已经进一步发现可以将根据本发明在病害生物中的基因沉默作用赋予病害生物子代，这种子代从未与转化的宿主植物直揍接触过。在一个实施方案中，本发明还包含将病害生物与转化的宿主植物细胞一起培养的步骤。在一个实施方案中，本发明转化的宿主植物细胞与病害生物共培养.任选地，病害生物子代对除转化的宿主植物细胞以外的植物细胞致病性较低。在一个实施方案中，从根据本发明转化的宿主植物细胞中再生的植物在受病害生物污染的土壤中栽培.在另一个实施方案中，从根据本发明转化的宿主植物细胞中再生的植物在具有受病害生物污染的风险的土壤中栽培..在另一个实施方案中，病害生物与从根据本发明转化的宿主植物细胞中再生并随后在受病害生物污染的土壤中栽培的植物共培养。在另一个实施方案中，病害生物与这样的植物共培养，该植物从根据本发明转化的宿主植物细胞中再生并随后在具有受病害生物污染的风险的土壤中栽培。在一个实施方案中，病害生物与受到转化并随后在具有受病害生物污染的风险的土壤中栽培的植物共培养。病害生物的致病性基因同源性已经还发现根据本发明的基因沉默作用可以赋予对种类多得令人惊讶的病害生物的抗性并且对于本发明的效果来说，不需要有义序列的区域和病害生物感染性基因间的完全同一性。在本发明的一个实施方案中，病害生物致病性基因是提供交叉抗性的基因。此类病害生物基因在病害生物门(phylum)内保守以至当与;^发明一起使用时，使植物抵抗该病害生物门内的多种成员(即交叉抗性)。此外，病害生物致病性基因可以根据本发曰/息同源性分析加以选择以提供跨物种、跨属、跨科或跨目抗性的交叉抗性。例如将从本文实例中显而易见，将角质酶基因在植物中对赋予多个真菌物种抗性是有用的。rDNA的基因在本发明的病害生物(即昆虫、细菌、真菌和线虫)中是有用的.此类保守基因的非限制实例是激酶、黏附素、G蛋白、激发素、离析酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶、延伸因子、蜕皮因子、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、保幼激素酯酶、角质层J^^、蛋白和组织蛋白酶和如下所述的其它保守基因。在另一个实施方案中，选择了与植物基因缺少足够同源性以在宿主植物上引起异源多核苷酸的有害影响的病害生物致病性基因(例如防止对植物基因的沉默)。例如，在一个实施方案中，良义序列和病害生物致病性基因之间的同源性低于大约70%.在一个实施方案中，反义序列与病害生物致病性基因同源性为至少大约70%。任选地，同源性是至少大约75%,任选地，同源性是至少大约80%.任选地，同源性是至少大约85%,任选地，同源性是至少大约90%。任选地，同源性是至少大约95%。在一个实施方案中，有义序列的转录物与病害生物致病性基因的转录物(例如病害生物致病性基因mRNA)同源性为至少大约70%,任选地，同源性是至少大约75%.任选地，同源性是至少大约80%。任选地，同源性是至少大约85%.任选地，同源性是至少大约卯％。任选地，同源性是至少大约95%。如上所述的同源性可以任选地^/f申覆盖至少大约20个核苷酸，或至少大约25个核苷酸，或至少大约50个核苷酸或至少大约100个核苷酸的片段。任选地，反义序列与病害生物致病性基因(结合RNA聚合酶并指导病害生物致病性基因mRNA转录的DNA链)的同源性可以以至少三种方式中的寸壬一方式加以证实。(1)反义序列与病害生物基因有义链的对应区域间杂交。(2)反义转录物与病害生物致病性基因的对应区域间杂交。(3)互补于反义序列的DNA(即反义cDNA)的转录物与病害生物致病性基因mRNA的对应区域间杂交。如以上所述，杂交可以在低严4NHf下开展。任选地，此4Hf是通过本领域众所周知的技术所定义的中等严格性条件至高严格性条件中的一个糾，如在Keller,G.H.，M.M.Manak(1987)DNAProbs，StocktonPress,NewYork,NY，第169-170页中所述技术。在本文中提供中等严4MHf至高严4NHf的实例。具体地，使用标准方法(M肌iatis等)以32P标记基因特异性探针在RNA印迹上开展固定化DNA的杂交。通常，杂交及随后的洗涤在允许检测具有与本文中所例举序列的同源性的把序列的中等严格至高严旨fr下开展。对于双链DNA基因探针，杂交在低于DNA杂交体解链温度(Tm)20-25。C上在6xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml变性DNA过夜实施。寡核苷酸探针的解链温度由如下来自Bdtz等(1983)的公式描述Tm=81.5。C+16.6LoglNa++0.41(%G+C)-0.61(%甲酰胺)-600/碱基配对的双链体的长度。洗涤通常如下开展(1)在室温在lxSSPE、0.1%SDS中两次持续15^(低严格洗涤).(2)在Tm-20。C在0.2xSSPE、0.1%SDS中一次持续15分钟(中等严格洗涤)。对于寡核苷酸探针，杂交在低于杂交体解链温度(Tm)的10-20°C上在6xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml变性DNA过夜实施。解链温度由如下来自Suggs等(1981)的公式描述Tm(。C)=2(T/A>5^JJit数)+4(G/C4^JJt数)。洗涤通常如下开展(1)在室温在lxSSPE、0.1%SDS中两次持续15分钟(低严格性洗涤)。(2)在杂交温度在lxSSPE、0.1%SDS中一次持续15分钟(中等严格性洗涤)，通常，可以改变盐和/或温度以改变严格性。涉及长JL^过大约70个左右的4的标记DNA片段，可以使用如下M:低l或2xSSPE、室温低l或2xSSPE、42°C中等0.2x或lxSSPE、65。C高O.lxSSPE、65。C。双^^体的形成和稳定性取决于杂交体的两条链间大量的互补性，并且如上所述，一定程度的错配可以容忍。因此在主艰发明中有用的多核苷酸序列包含在所述序列中的(单个或多个)突变、缺失和插入，以及其组合，其中所述突变、插入和缺失允许与目的靶多核苷酸形成稳定的杂交体。突变、插入和缺失可以使用本领域已知的标准方法在给定多核苷酸序列中产生.其它方法可能在将来为人所知。本发明多核苷酸序列的突变性、插入性和缺失性变体可以以如所例举的多核苷酸相同的方式加以使用，只要该变体具有与原始序列大量的序列相似性。如本文中所用，大量的序列相似性指足以使变异的多核苷^ic挥如与原始序列相同的功能的核苷酸相似性程度。优选地，该相似性超过75%;更优选地，该相似性超过90%;并且最优选地，该相似性超过95%。途。产生设计旨在改善序列功能或提供方法学优势的突变性、插入性和缺失性突变完全在本领域技术人员的技术范围内，载体本领域技^A员完全能够构建本发明的载体(包括基于棵DNA的那些栽体)并设计用于重组基因表达的方案。细节见例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:第二版，Sambrook等，1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress。操作核酸的此类可应用技术和方案，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、导入DNA至细胞并表达基因以及分析蛋白质方面的技术和方案，在ProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等编辑，JohnWiley&Sons,1992中详细描述，先前成功地广泛用于植物的具体方法和栽体由Bevan，Nucl.AcidsRes.(1984)12，8711-8721)以及在PlantMolecularBiologyLabfax(CroyRRD编辑).Oxford,BIOSScientificPublishers，第121-148页中Guerineau和Mullineaux，(1993).Planttransformationandexpressionvectors描述。可以提供(即自其天然环境)分离和/或纯化的、处于基本纯的或均一形式或者不含或基本不含其它核酸的本发明栽体。本发明的核酸可以完全是合成的或部分;l合成的，宿主植物本发明可用于转化众多植物，包括但不限于玉米(Zeamays)、卡诺拉油菜(欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青(Brassicarapassp))、苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(双色高粱(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghumvulgare))、向日葵(Helianthusan肌us)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(SoIanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖叫》(Cofeassp.)、椰子(Cocosnudfera)、凤梨(Ananascomosus)、柑桔树(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(CamelHasinensis)、香蕉(Musaspp.)、跨梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、^t^(Oleaeuropaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidental)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、扁杉fe(Primusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、燕麦(oat)、大麦、蔬菜、园艺植物和针叶树。任选地，本发明的植物是作物植物(例如、谷物和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯(tapioca)、稻、高粱、粟、木薯、大麦、豌豆和其它块根作物、块茎作物或种子作物(seedcrop)。对本发明重要的种子作物是油菜(oil-seedrape)、甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。可应用本发明的园艺植物包括莴夢(lettuce)、苦苣(endive)和芸荅类蔬菜包括巻心菜(cabbage)、青花菜和花椰菜(cauliflower)以;5L^:乃舉(carnations)、天竺葵(geraniums)、矮牵牛(petunia)和秋海裳(begonias)。本发明可以适用于烟草、黄瓜(cucurbits)、胡萝卜(carrot)、草莓(strawberry)、向曰葵(sunflower)、番痴、辣椒(pepper)、菊花(chrysanthemum)、杨(poplar)、桉树(eucalyptu)和松(pine)。任选地，本发明的植物包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。任选地，本发明的植物包括油料植物，油料植物包括卡诺拉油菜、棉花、大豆、红花(safflower)、向日葵、芸莒属(Brassica)、玉米、苜蓿、棕榈(palm)、椰子等。任选地，本发明的植物包括豆科植物.豆科植物包括豆类和豌豆.豆类包括瓜尔豆(guar)、槐豆(locustbean)、香豆子(fenugreek)、大豆、四季豆(gardenbean)、H豆(cowpea)、绿豆(mungbean)、利马豆(limabean)、蚕豆(favabean)、小扁豆(lentil)、鹰嘴豆(chickpea)等。在本发明中有用的宿主植物是作栽作用和撒:掩ft物(broadcastcrop),有用的非限制性作栽作用实例是玉米、大豆、棉花、苋(amaranth)、蔬菜、稻、高粱、小麦、高粱(milo)、大麦、向日葵、硬粒小麦(durum)和燕麦。有用的撒播作物的非限制的实例是向日葵、黍(millet)、稻、高粱、小麦、高粱、大麦、硬粒小麦和燕麦.在本发明中有用的宿主植物是单子叶植物和双子叶植物。有用的单子叶植物的非限制实例是稻、玉米、小麦、棕榈树、草坪草(turfgrasse)、大麦和燕麦。有用的双子叶植物的非限制实例是大豆、棉花、苜蓿、卡诺拉油菜、亚麻(flax)、番茄、甜菜、向日葵、马铃薯、烟草、玉米、小麦、稻、莴夢、芽菜(celery)、黄瓜(cucumber)、胡萝卜、花椰菜、葡萄(grape)和草坪草。在本发明中有用的宿主植物包括栽培用于审美或欣赏香味的植物。非限制性实例包括观花的植物、树、草、耐阴植物以及开花和不开花的园艺植物。在本发明中有用的宿主植物包括栽培用于营养价值的植物。宿主细胞类型本领域技术人员认识到可以与根据本发明的异源多核苷酸接触的多种类型的宿主细胞。此类细胞的非限制性实例是在胚性组织、I、II和III型愈伤组织、下胚轴、分生组织、根组织、用于在韧皮部内表达的组织等中的那些细胞。宿主植物细胞可以任选地富集以得到具有更高转化潜力和/或更高再生成熟植物的潜力的细胞。手工选择宿主植物细胞，例如通it^n型愈伤组织的表面筛选胚性细胞，是可以用于培养前(无论是在固M养基上或在悬浮液中培养)富集宿主植物细胞的一种手段，任选地，细胞可以从位于细胞团表面的那些细胞中选择，并且细胞可以还因它们缺少分化、它们的尺寸和致密胞浆是可鉴定的。在一个实施方案中，宿主植物细胞分化度较低或仍然未i^A分化。因此，在一个实施方案中，细lfe^Jt样的细胞中鉴定和选择，所述细胞胞浆致密、相对无液泡，细胞核与细胞浆比率(例如通过细胞学观察)高、尺寸小(例如10-20nm)并且能够持续分裂并形成体细胞性原胚。任选地，宿主植物细胞通过使用由具有相对非通透性膜的细胞如胚性所摄取的染料加以鉴定，如伊文思蓝。任选地，宿主植物细胞通过使用可以由细胞化学染色得以检测的胚性细胞同工酶标志加以鉴定，如谷氨酸脱氢酶(Fransz等，1989).本领域技术人员将认识到同工酶标志如谷氨酸脱氢酶可以从仍具有相对高的代谢活性的非胚性细胞如根细胞中产生某种程度的假阳性结果。几乎所有植物组织可以使用本文中所述的适宜技术在去分化期间加以转化。受体靶细胞包括，但不限于分生组织细胞、i、n型和ra型愈伤组织、未成熟胚以及配子细胞如小孢子、花粉、精子和卵细胞。预计从中可以再生能育植物的任何细胞作为受体细胞是有用的。i、n型和in型愈伤组织可以从包括但不限于未成熟胚、未成熟花序、幼苗顶端分生组织、小孢子等的组织来源中产生。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞也是用于遗传转化的受体细胞。本发明提供用于转化未成熟胚并且随后再生能育的转基因植物的技术。直接转化未成熟胚免除长时间发育受体细胞培养物的需要.花粉以及其前体细胞小孢子可能能够发挥作用，作为受体细胞用于遗传转化，或作为栽体以携带用于在受精期间导入的外来DNA。直接转化花粉免除细胞培养的需要，分生组织细胞(及能够持续进行细胞分裂并且以未分化的细胞学外观为特征的植物细胞，通常在植物的生长点或生长组织内存在，如根尖、茎端、侧芽等)可以代表另一类型的受g物细胞。由于它们未分化的生长性和器官分化潜能以及全能性，转化的单个分生组织细胞能够以完整的转化植物回收.实际上，人们建议胚性悬浮培养物可以是一种体外分生组织细胞系统，其保留在未分化状态下持续进行细胞分裂的能力，受培养基环境控制。病害生物在本发明中有用的植物病害生物(即根据本发明可以变成非致病的)包括真菌、线虫、昆虫、细菌和寄生性植物如糙伏毛(striga)、菟丝子(dodder)和槲寄生(mistletoe)。有用真菌的非限制实例包括在表4中所述的那些真菌。此类有用线虫的非P艮制实例包括在表3中所述的那些线虫。此类有用昆虫的非限制实例包括蚜虫、叶蝉(leafli叩per)、飞虱(planthopper)、粉介壳虫(mealybug)和鳞翅目(Lepidoptera)幼虫'<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>甘蔗霜霉病甘蔑指霜霉(Peronosclerosporasacchari)=甘蔑指梗霉(Sclerosporasacchari)玉米穗干腐病(玉米芯、玉米籽和玉米茎腐病)稻黑孢霉(Nigrosporaoryzae)(有性世代Khuskiaoryzae)轻度玉米穗腐病灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)，黑曲霉(A.niger)，曲霉(Aspergillusspp.)，小克银汉霉(Cunninghamellasp.)，苍白弯孢(Curvulariapallescens)，具柄矛束孢(Doratomycesstemonitis)=Cephalotrichumstemonitis，大刀镰孢(Fusariumculmorum)，Gonatobotryssimplex,Pithomycesmaydicus，小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)，葡枝根霉(R.stolonifer)=黑^L^(R.nigricans)，Scopulariopsisbrumptii麦角病(horse，stooth,dientedelcaballo)大秃马勃(Clavk印sgigantea)(无性世代麦角菌(Sphacdiasp.)眼斑病玉米出芽短梗霉菌(Aureobasidiumzeae)=玉米眼斑病菌(Kabatiellazeae)镰孢穗茎腐病W^镰孢(Fusariumsubglutinans)=串珠镰"lfc^孢变种(F.moniliformevar.subglutinans)镰孢籽、根腐和茎腐病，烂种病和立枯病串珠镰孢(Fusariummoniliforme)(有性世代藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi))镰孢茎腐病，幼苗根腐病燕麦镰孢(Fusariumavenaceum)(有性世代燕麦赤霉(Gibberellaavenacea))赤霉玉米穗腐茎腐病玉米赤霉(Gibberellazeae)(无性世代禾谷镰孢(Fusariumgraminearum))灰霉玉米穗腐病Botryosphaeriazeae=Physalosporazeae(无性世代Macrophonmzc狄)灰霉叶腐病(尾孢(Cercospora)叶斑病)高粱尾孢(Cercosporasorghi)-高粱尾孢玉米变种(C.sorghivar.Maydis、C.zeae國maydis)长蠕孢(Helminthosporium)根腐病Exserohilumpedicellatum=Helminthosporiumpedicellatum沐性世代毛球腔菌(Setosphaeria)长蠕孢(Hormodendrum)玉米稳腐病芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides)=Hormodendrumcladosporioides，腐病)，草^^孢(C.herbarum(有性世代塔森球腔菌(Mycosphaerellatassiana))Hyalothyridium叶斑病Hyalothyridiummaydis晚萎病(Latewilt)玉米晚萎病菌(Cephalosporiummaydis)轻度叶斑病链^&(Alternariaalternate)，Ascochytamaydis、A.tritic、A.zeicola、维多利亚平脐蠕孢(股polarisvictoriae)=维多利亚长蠕孢(Helminthosporiumvictoriae)(有性世代维多利亚4t孢腔菌(Cochliobolusvictoriae))、麦根腐a腔菌(C.sativus)(无性世代'.麦根腐平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)=H.sorokinianum=H,sativum)，黑附球菌(Epicoccumnigrum)，Exserohilumprolatum=Drechsleraprolata(有性世代Setosphaeriaprolata)，Graphiumpenidllioides、Leptosphaeriamaydis、Leptothyriumzeae，匍毛蛇孢球菌(Ophiosphaerellaherpotricha)(无性世代Scolecosporiellasp.)、Paraphaeosphaeriamichotii、茎点霉(Phomasp)、Septoriazeae、S.zeicola、S.zeina北方型玉米叶枯病大斑病突脐蠕孢(Exserohilumturcicum)=Helminthosporiumturcicum,Setosphaeriaturcica北方型玉米叶斑病炭色旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)长蠕孢玉米穗腐病(品种l)玉米生平脐蠕孢(股polariszeicola)-炭色长蠕抱(Helminthosporiumcarbonum)青霉菌(PenicilHum)玉米穗腐病(蓝眼病、青霉病)青霉(Penicilliumspp.)、产黄青霉(P.chrysogenum)、扩展青霉(P,expansum)、草酸青霉(P.oxalicum)暗色座腔孢(Phaeocytostroma)茎腐和根腐病Phaeocytostromaambiguum，PhaeocytosporellazeaePhaeosphaeria叶斑病Phaeosphaeriamaydis，Sphaerulinamaydis嚢壳孢(Physalospora)玉米穗腐病Botryosphaeriafestucae=玉米囊孢壳(Physalosporazeicola)(无性世代干腐色二孢(Diplodiafrumenti))Purpleleafsheath半寄生性细菌和真菌棘壳孢(Pyrenochaeta)茎腐和根腐病Phomaterrestris，土棘壳孢(Pyrenochaetaterrestris)腐審根腐病腐霉(Pythium)若干种、强雄腐霉(P.arrhe加manes)、禾生腐霉(P.graminicola)腐審实腐病瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)-巴特勒腐霉(P.butleriL.)红籽病(玉米穗霉病、叶腐和种腐病)黑附球菌丝核菌(Rhizoctonia)玉米穗腐病玉米丝核菌(Rhizoctoniazeae)(有性世代Waiteacircinata)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表4病害生物-真菌性<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>病害生物致病性基因技术人员可以i^鉴定本发明中待把向的病害生物基因，此基因可以是在此病害生物对宿主植物的有害影响中起直接或间接作用的任意病害生物基因。仅作为例子，此基因可以是在病害生物生长、发育、增殖和繁殖、^A或感染中起作用的基因。在一个实施方案中，宿主植物不包含与病害生物致病性基因超过大约70%同源性的基因。任选地，同源性不大于大约60%。任选地，同源性不大于大约50%。在一个实施方案中，宿主植物不包含如此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约70%同源性的25个核苷酸的片段。在一个实施方案中，宿主植物不包^此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约60%同源性的25个核苷酸的片段。在一个实施方案中，宿主植物不包^此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约50%同源性的25个核苷酸的片段。在一个实施方案中，宿主植物不包含多于一个的如此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约70%同源性的25个核苷酸的片段。在一个实施方案中，宿主植物不包含多于一个的如此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约60%同源性的25个核苷酸的片段。在一个实施方案中，宿主植物不包含多于一个的如此基因，该基因包含与病害生物致病性基因超过大约50%同源性的25个核普酸的片段。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>例如，角质酶基因是根据本发明有用的基因。当真菌菌丝侵入植物细胞并吸收营养时，其从植物中吸收siRNA并使真菌必需且组成型的角质酶基因沉默。仅作为例子，此基因可以是在病害生物生长、发育、增殖和繁殖、侵入或感染中起作用的基因。其它非限制性实例包括表6中的那些实例。有义(和反义)序列根据本发明的有义序列和反义序列可以(分别)是具有与病害生物致病性基因的有义链和反义链的同源性的任何序列。有W列和反:^列可以在相同的DNA链上或在不同的DNA链上。当有义序列和反义序列在相同的DNA链上时，这些序列的转录可以由相同启动子驱动或由不同启动子驱动(例如相同启动子或不同启动子的不同拷贝)。当有义序列和反i(^列在不同的DNA链上时，这些序列的转录可以由不同启动子驱动。有义序列和反义序列可以在DNA中排列作为互补的、双链体DNA或是有义序列和反:5U^列可以位于DNA的不同区域内(即彼此不形成双链体DNA)。有义序列和反义序列的每一序列包含至少大约19个核苷酸。任选地，每一序列包含至少大约50个核苷酸、任选地至少大约100个核苷酸、任选地至少大约150个核苷酸、任选地至少大约250个多核苷酸、任选地至少大约500个核苷酸、任选地至少大约600个多核苷酸。在一个实施方案中，来自病害生物致病性基因中的序列受到修饰以产生或增加对多于一种病害生物的致病性基因的同源性。在另一个实施方案中，来自病害生物致病性基因中的序列受到修饰以缩短可读才匡。在另一个实施方案中，来自病害生物致病性基因中的序列受到修"饰以导致对植物、动物或人基因的较低同源性。在另一个实施方案中，有义序列和反义序列包含病害生物致病性基因的重复区域。此类区域的选择根据本文中本发明的教授内容进行(例如高度保守的区域)。在其它实施方案中，可以重复病害生物致病性基因的区域或甚至病害列和反义序列所形成双链区的长度.不被理论束绰，据信在本发明的某些实施方案中，siRNA的阈值水平必须达到以在病害生物中^Jt有用的基因沉默并且向植物赋予病害生物抗性。基因序列的重U增加双链区长度和增加siRNA数目的一种有用的方式。这种(基因重复)方法使用包含致病疫霉激发素INFl(GenBank基因座AY766228〗的异源多核苷酸pVZA300(SEQID7)在本文实施例中阐明。选择该序列是因为它与由疫霉属所表达的众多其它激发素基因的高度同源性，从而提示该序列可能使众多其它激发素基因沉默，并且因此提供对众多疫霉物种的抗性。所选序列长282nt,因此该序列在有义方向和反义方向上重复(-564nt)以接近于已经非常成功的pVZA100(SEQID5)、pVZA200(SEQID6)和pVZA400(SEQID8)的有义部分和反义部分的长度。该方法的成功通过与经pCAMBIA1201、pVZA100或pVZA200转化的效果相比，pVZA300在减少转化的烟草疫霉和大豆疫霉(图14D、F)的菌丝生长并引起其畸形方面的明显效果加以证实.质粒pVZA200和pVZA300因两者均含有组织蛋白酶基因而部分相同，但pVZA300还含有重复的激发素基因。因此pVZA300对真菌的有害影响应当归因于激发素基因。这对于开发抗疫霉植物以及将此方法应用于经疫霉污染的土壤的脱致病性具有积极意义。转化方法可获得多种方法用于导入本发明的异源多核苷酸l处于允许该多核苷酸稳定维持和表达条件下的把宿主。特定转化技术的选择由该技术对转化某些植物种的效率以及用选择的特定方法学实施本发明的人的经验和偏爱决定。对于技术人员显而易见，选择特定转化系统以导入核酸^M1物细胞不是本发明的必需或限制因素，同样，选择用于植物再生的技术也是如此。尽管多种转化方法在本文中作为独立的方法教导，技术人员将容易认识到可以组合地使用某些方法以增强转化方法效率.此类方法的非限制实例包括以包被孩吏粒的土壤杆菌轰击(EP-A-486234)或微粒轰击以诱导伤口，随后通过与土壤杆菌共培养(EP-A-486233)。直接送递可以用于转化本发明的植物宿主，通过非限制性地举例，此类直接送递方法包括聚乙二醇处理、电穿孔、脂质体介导的DNA摄取(例如Freeman等PlantCellPhysiol.29:1353(1984))或涡旋混合方法(例如Kindle,PNASU.S.A.87:1228(19卯d)。直接送递DNA的一种形式是直接基因转移进入例如来自胚性细胞悬浮培养的原生质体(Lazzeri和Lorz(l988)AdvancesinCellCulture,第6巻，Academicpress,第291页；OziasAkins和Lorz(1984)TrendsinBiotechnology2:119)。授粉途径技术人员知道基因型依赖性转化的某些难度，其来源于谷物的低再生活力.因此，在本发明的一个实施方案中，转化通过基于授粉途径的基因型非依赖性转化方法(01^￥.，1986)而实现。在玉米中，高效率的遗传转化可以通过花粉与外源DNA的混合物实现(LuoZ.X.等WuR.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:715-719)。玉米可以通过自花授粉或异花4^l^技术进行育种。玉米在同一植林上具有独立的雄花和雌花，分别位于*穗和耳穗中。当风将花粉vWMt穗吹至从耳穗顶部突出的穗丝时，在玉米中发生天然;^粉。本发明稻的转化也可以通^粉管途径完成(PlantMolecularBiologyReporter6:165-174),花粉管途径的主要潜在优势包括(a)基因型非依赖性；(b)无镶嵌现象；(c)不需要复杂的细胞培养和组织培养汰术。用本发明的异源多核苷酸对番茄和瓜的转化可以通过授粉途径实现进入完整植物(Chesnokov，Yu.V"等，1992，USSR专利号1708849;USSR专利^^"，第4号；ChesnokovYu.V.&KorolA.B.1993;GenetikaUSSR,29:1345-1355).基于授粉-受精途径的遗传转化的方法包括(i)使用花粉与起转化作用的DNA的混合物(浆)；(ii)授粉后，递送外来DNA至花粉管；和(iii)微粒轰击小孢子或花粉粒。土壤杆菌技术在本发明的一个实施方案中，宿主植物使用土壤杆菌技术转化。土壤杆菌介导的转移是导入基因至植物细胞的广泛应用的系统，因为DNA可以导入完整植物组织，因而不再需要从原生质体中再生完整植物。在本领域是众所周知利用土壤杆菌介导的植物整合栽体以将DNA导入植物细胞。见例如由Fraley等，(1985)，Rogers等，(1987)和美国专利号5，563，055所述的方法，所述文献特别在本文中完整引用作为参考。土壤杆菌介导的转化可以有效地用于本发明的双子叶宿主植物，通过非限制性举例包括拟南芥(Arabid叩sis)、玉米、大豆、棉花、卡诺拉油菜、烟草、番茄和马铃薯。土壤杆菌介导的转化还可用于几乎所有本发明的单子叶植物。通过非限制性举例，此类单子叶植物技术适用于稻(Hiei等，1997;Zhang等，1997;(Ishida等，1996);美国专利号5,591,616，所iUL献特别在本文中完整地引用作为参考)、小麦(McCormac等，1998)和大麦(Tingay等，1997;McCormac等，1998)。根据本发明，土壤杆菌介导的转化可以用已分离培养的原生质体并通过转化完整细胞或组织而完成。在双子叶植物中土壤杆菌介导的转化与其它转化方法如粒子轰击、电穿孔、聚乙二醇介导的转化方法等相比促进送递异源核酸的较大片段。此外，土壤杆菌介导的转化似乎引起相对较少的基因重排并且更典型地导致低数量的基因拷贝R至植物染色体。现代的土壤杆菌转化栽体能够在大肠杆菌(E.coli)以及土壤杆菌内复制，这如所述允许方便地操作(Klee等，1985)。此外在用于土壤杆菌介导基因转移的栽体方面的最新技术i^H已经改进栽体中的基因和限制性位点排列，以便促进构建能够表达编码多种多肽的基因的栽体.所述栽体(Rogers等，1987)具有方便的多接头区域并且因此适合于本发明目的，其和M苷^化位点。此外，含有装甲和卸甲Ti基因的土壤杆i可以用于转化。在土壤杆菌介导的转化是有效的那些植物林系内，因为基因转移容易而确定的性质，土壤杆菌介导的转化是所选择的方法。当土壤杆菌(例如根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)用于转化本发明的植物细胞时，待插入的DNA可以克隆至特定质粒，即克隆至中间载体或至双元栽体。中间载体可以通过因与T-DNA的序列同源的序列发生同源重组而整合至Ti质粒或Ri质粒。Ti质粒或Ri质粒还包含为T-DNA转移所需的vir区域。中间载体自身不能在土壤杆菌中复制。中间载体可以借助辅助质粒(接合)转移至根瘤土壤杆菌。双元栽体自身可以在大肠杆菌和土壤杆菌中中复制。此类载体可以包M择标记基因以及由T-DNA左边界区和右边界区所界定的接头或多接头。双元载体可以直接转化至土壤杆菌(Holsters等1978Mol.Gen.Genet.163:181-187)。作为宿主细胞使用的土壤杆菌将包含携带vir区域的质粒。vir区域为转移T-DNA至植物细胞所必需。额外的T-DNA可以纳入。如此转化的细菌用于植物细胞的转化.植物外植体可以有利地与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一^^培养用于转移DNA至植物细胞。随后，完整植林可以从合适培养基中的已感染植物材料(例如叶子的小条、根、茎的节段、以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生，其中该培养基可以含有用于选择的抗生素或杀生物剂。如此得到的植抹可以随后测试所插入异源多核苷酸的存在。在注射法和电穿孔法时，对质粒没有特别要求。有可能使用常用质粒，如pUC衍生物。其它转化技术化包括whiskers技术，见Zeneca的美国专利5j302，523和5，464，765，,轰击任选地，宿主植物细胞根据本发明通过微粒轰击(美国专利号5,550,318;美国专利号5，538，880;美国专利号5，610，042和美国专利号5，5卯，3卯；每一文lt^本文中特别引用作为参考)转化。在该实施方案中，粒子以核酸包被并且通过推动力送递至细胞。示例性的粒子包括由鵠、铂和优选地由金组成的粒子。预期在某些情况下，对于使用微粒轰击送递DNA至细胞，不必需使DNA沉淀至金属粒子表面。然而预期粒子可以含有DNA而非以DNA包被。因此，提出DNA包被的粒子可以通it^立子轰击增加DNA送递水平，但就其本身而言不是必需的。为了轰击，将悬浮液里的细胞在滤器或固体培养基上浓缩。备选地，将未成熟胚或其它靶细胞排列在固体培养基上。将待轰击的细胞放置在微粒终止板下的合适距离。用于送递主题载体至植物细胞的转化方法的示例性实施方案是使用BiolisticsParticlesDeliverySystem(BioRad，Hercules,Calif.)加速，该系统用于推动包被DNA或细胞的粒子穿过屏障如不锈钢或尼龙屏障，抵达以悬浮方式培养的植物细胞所覆盖的滤器表面。屏障使粒子^t以至于将粒子不以巨大团集物的形式送递至受体细胞。不被理论束繂，据信屏障在微粒装置和待轰击的细胞间的介入降低了微粒团聚体的尺寸并且可能通过降低因过大体积的微粒在受体细胞上所产生的伤害而有助于较高的转化率。为了轰击，将悬浮液里的细胞在滤器或固体培养基上浓缩。备选地，将未成熟胚或其它靶细胞排列在固>^养基上.将待轰击的细胞安置在微粒终止平台下的合适距离.根据需要，可以将一个或多个屏障置于加速设备和待轰击细胞之间。通过使用本文中所述的技术，可以获得瞬时表达标记基因的高达1000个或更多的细胞转化灶.转化灶中轰击后48小时表达外源基因产物的细胞数常常是1至10个并且平均是1至3个.本领域技^A员可以优化轰击前的培养条件和轰击参数以产生最大数量的稳定转化体.用于轰击的物理M和生物参数均在该技术中是重要的.物理因素是涉^L^作DNA/微粒沉淀或影响巨大微粒或微粒的飞行和速度的那些因素.生物因素包括在轰击前或紧随其后所涉及的操作细胞的4^步骤、为有助于减轻与轰击有关的创伤而对耙细胞的渗透调节作用并且还包括转化用DNA的性质，如线性化DNA或完整的超螺旋质粒.据信轰击前的操作对成功转化未成熟胚尤其重要。因此，预计技术人员可以在小M^研究中调整轰击参数以充分优化条件。技术人员可能尤其希望调整物理M，如间隙距离、飞行距离、組织距离和氦气压力.技术人员还可以通过调整影响受体细胞生理状况以及可能因此影响转化和整合效率的条件而使创伤减少因素(TRF)降到最少。例如，可以调节渗透压状态、组织水合和传代培养阶段或者受体细胞的细胞周期用于最佳的转化。来自此类小规^^优化研究的结果在本文中公开并且实施其它常规调节在本公开的启示下对本领域技术人员而言是已知的，微粒轰击转化应用广泛，并且可以用于转化几乎任何植物物种。单子叶植物任选地根据本发明通过轰击加以转化，例如玉米(美国专利号5,5卯，3卯)、大麦(Ritala等，1994;Hensgens等，1993)、小麦(美国专利号5，563，055，特别在本文中完整引用作为参考)、稻(Hensgens等，1993)、燕麦(Torbet等，1995;Torbet等，1998)、黑麦(Hensgens等，1993)、甘蔗(Bower等，1992)和高粱(Casa等，1993;Hagio等，1991)。双子叶植物任选地根据本发明通过轰击加以转化，例如烟草(Tomes等，19卯；Buising和Benbow，1994)、大豆(美国专利号5,322,783，特别在本文中完整引用作为参考)、向日葵(Knittel等1994)、花生(Singsit等，1997)、棉花(McCabe和Martinell，1993)、番薪(VanEck等1995)和常见豆科植物(美国专利号5,563,055，特别在本文中完整引用作为参考)。电穿孔在一个实施方案中，植物细胞使用电穿孔方法转化.参见例如属于BoyceThompson研究所的WO87/06614;美国专利号5，472，869和5,384,253，两者均属于Dekalb;和WO92/09696和WO93/21335,两者均属于PlantGeneticSystem.Krzyzek等的方法(美国专利号5，384，253，在本文中完整引用作为参考)充分适用于本发明.在该方法中.采用某些降解细胞壁的酶例如果胶降解酶以使乾受体细胞与未处理的细J^目比对电穿孔转化更易感。备选地，通过M致伤使受体细胞变得更易转化.尔j如Tada，Y.等的方'法(Efficientgeneintroductiontoricebyelectroporationandanalysisoftransgenicplants:Useofelectroporationbufferlackingchlorideions，TheorApplGenet,Vol.80:475-480，1990)适用于转化稻。在一个实施方案中，为通过电穿孔法有效地转化，使用易碎组织如细胞或胚性愈伤组织的悬浮培养物。任选地，直接转化未成熟胚或其它组织化的组织。在此技术中，通过使细胞壁接触果胶降解酶(果胶酶)或以可控方式;Wfe致伤部分地降解细胞壁。限制性实例是小麦(根据例如Zhou等，1993)、番茄(根据例如Hou和Lin，1996)、大豆(根据例如Christou等，1987)以及烟草(Lee等，1989)。还参见美国专利号5,384,253;Rhodes等，1995;和D，Halhiin等，1992.在一个实施方案中，将植物转化用于原生质体的电穿孔法(根据例如Bates,1994;Lazzeri，1995)。可以根据本发明通过原生质体的电穿孔加以转在PCT发明者C·L·尼布勒特申请人:文甘扎公司