专利名称：防御素及其在制备抗菌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及防御素及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。具体地， 涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。
背景技术：
防御素的结构特点及分类防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。 防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点(I)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加利福尼亚大学 Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类α防御素、β防御素和Θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6 个保守的半胱氨酸形成了 3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5 ； β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素一由18个氨基酸残基组成的环状Θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即ΗΝΡ1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β -防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β_防御素基因。防御素的表达与病源微生物的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。到目前为止,分离到的兔防御素有9个,其中7个为α防御素ΝΡ_1,ΝΡ-2,NP_3a, NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素:RK_1和RK-2， 来自于兔肾细胞。α-防御素NP-I比人防御素HNP-I的抗菌活性强5 10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质在NP-I分子中含有9个净正电荷，而在HNP-I 分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1, NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-I由33个氨基酸组成,属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为l-6，2-4，3-5(Ganz， 1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。防御素抗微生物机理
在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-I形成瞬时的，人防御素 HNP-I形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。 正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。不同防御素的抗微生物活性由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差别。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100 μ g/ml之间(Patterson Delafied et al., 1980,1981 ；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989 ;Selsted et al.，1984，1985c， 1987，1992 ;Ganz，1985a ;Segal et al.，1985 ;Daher et al. , 1986 ；Levitz et al.，1986 ; Shafer et al. ，1988 ;Eisenhauer et al. ，1989 ;Yamashita and Saito，1989 ;Cullor et al.，1990，1991 ;Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b ;Borenstein et al·，1991a， 1991b ；Kohashi et al.，1992 ;0gata et al.，1992 ;Nakashima，1993)。与其它抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素ΝΡ-1，ΝΡ-2，不但抗性谱广，抑菌活性也较强。1984年，Selsted等发现从兔中性粒细胞分离获得的NP-I在浓度为50 μ g/ml时对3个家系的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎链球菌(Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)， 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetella bronchiseptica)抑制生长或者杀灭作用(Selsted et al. 1984) ο1985年，Lehrer等首次发现兔MCP-I和MCP_2(现名分别为，兔防御素NP-I和 NP-2)在体外对I型单纯疱疫病毒(herpes simplex virus typel，HSV-1)具有中和活性作用，而4个结构同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5对HSV-I无效。兔防御素NP-I和 NP-2对单纯疱疹病毒的灭活作用依赖于肽浓度以及肽与HSV-I孵育的时间，温度和pH。2 型单纯疱疫病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，流感病毒 A/WSN(inf luenza virus A/WSN)也易被 MCP-1 和 MCP-2 直接中和，但MCP-I和MCP_2对巨细胞病毒(cytomegalovirus)，埃可病毒II型(echovirus type 11)，和呼肠孤病毒3型(reovirus type 3)无效。1986年，Lehrer等也首次报道HNPl对包膜病毒单纯疱疹病毒I和2(HSV_1和 HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接灭活作用，但对非被膜病毒埃可病毒和呼肠孤
4病毒没有作用。在包膜病毒的研究中，HNPl对HSV-I和HVS-2有很强的直接抑制作用，对水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有温和的直接抑制作用，对巨细胞病毒，仅在高浓度时， 才有轻微的作用。对少数禽类的β防御素抗菌活性的研究显示其具有广泛地抗革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌作用。在美国，每年由于感染造成的死亡人数超过250万例，因此感染已成为造成死亡的首要原因。而且在美国，每年有70%感染患者有抗药性，使耐药细菌迅速的增加，已成为世界所面临的最严重的医疗问题之一。感染耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA)仅4年已增加了 700% ο在美国，2008年MRSA的住院费用超过了 685，000美元，并预计到2013年增至240万美元。MRSA感染直接花费美国医疗系统的100亿美元和每年总花费达180亿美
J Li ο抗生素耐药菌的出现，甚至多重耐药菌的发现，以及耐药菌感染的急剧上升，急需不会带来病原菌耐药性的新药物。由于防御素具有强大的抗菌和免疫调节作用，防御素对抗生素耐药菌及多重耐药菌也均具有抑杀作用。与传统的抗生素相比，细菌从防御素中获得耐药性极为困难。因此，广泛地认为防御素是最具有潜力的新一代抗感染生物肽。防御素的杀伤效果可被血清抵消，可能是由于防御素结合到各种血浆蛋白如特异性补体成分，丝氨酸蛋白酶抑制剂和激活的a2_巨球蛋白(Lichtenstein et al. , 1986 and 1988 ；Okrent et al. , 1990 ；Panyutich et al. , 1991,1994 and 1995)。当 1%胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了 30%，而当5%胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了 75% (Lichtenstein et al. ,1986)。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌自然界存在多种多样的病菌，通过革兰氏染色法，能够把细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这种染色方法是先用龙胆紫(也称结晶紫)染色细菌，所有的细菌均被染成紫色，然后再用革兰氏碘液来加强染料与菌体的结合，再用95%的乙醇脱水短时脱水(20-30秒)，在这个过程中有些细菌染色很牢固，染色不被脱去，而仍保留着紫色，有些细菌染色不牢固，染色被脱去变成为无色，接着再用番红或沙黄复染I分钟，那么被脱色了的细菌可以染色，变成红色，未脱色的细菌不能再染色了，仍保持着原来的紫色; 据此，凡是被染成紫色的细菌就成为革兰氏阳性菌(G+菌)，被染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌(G-菌)。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有葡萄球菌(Staphyloccocus)、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌 (Diplococcus pneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)等,可以选择青霉素族,头孢曲松钠等； 大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。常见的革兰氏阴性菌有痢疾志贺氏杆菌(Shigella dysenteriae)、伤寒杆菌((Salmonella enterica serovar Typhi)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌(proteusbacillus vulgaris)、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)等革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约20 80nm。肽聚糖含量丰富，有15 50层，每层厚度Inm,约占细胞干重的50 80%。此外，尚有大量特殊组分磷壁酸(teichoic acid)。 磷壁酸是由核糖醇(ribitol)或甘油(glyocerol)残基经由磷酸二酯键互相连接而成的多聚物。憐壁酸分壁憐壁酸(wall teichoic acid)和膜憐壁酸(membrane teichoic acid) 两种，前者和细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸连结，膜磷壁酸又称脂磷壁酸(Iipteichoic acid)和细胞膜连结，另一端均游离于细胞壁外。磷壁酸抗原性很强，是革兰氏阳性菌的重要表面抗原；在调节离子通过粘肽层中起作用；也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，能粘附在人类细胞表面，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。此外，某些革兰氏阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等，都与致病有关。临床上，常见的革兰氏阳性菌(G+菌)致病菌主要包括7大类金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Viridans streptococci)、肠球菌属(Enterococcus其中幾球菌(E. faecalis)更为常见)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、β -溶血链球菌(β -haemolytic streptococcus)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sau)是目前床上最常见的致病菌之一，青霉素从20世纪40年代开始应用于临床，但很快出现了耐药菌株。自从1961年 Jevons首次分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-reistant Staphylococcus aureus, MRSA)以来，MRSA在世界的感染率和分离率不断增加，已成为目前医院内感染的主要病原菌之一，由金黄色葡萄球菌引起的感染成为临床棘手的问题(Moran et al, 2006)。MRSA自出现以来，强大的致病毒力因子以及耐药性便使其成为临床上的一个难题，导致MRSA的感染率不断上升，感染范围不断扩大，感染的程度愈来愈严重。MRSA感染的治疗目前还是以药物为主，但其对抗生素的多重耐药导致治疗上的困难。其临床感染率和危害性已经引起医学界震惊和高度重视，因此人们把MRSA这种菌株形象地称为“超级细菌”。自从1968年首次发现MRSA I引起的感染，40年来，MRSA造成的院内与院外感染均成上升趋势，我国1989年全国部分城市调查MRSA平均检出率为42. 7 %，属MRSA 感染的严重国家之一。20世纪90年代以后我国北京、上海、广州等地大型医院MRSA的分离率都已超过了 50%，而其他地区的报道也大部分在25% -60%之间。上海2004年金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)中MRSA的分离率已达到63. 9%，2006年上海各大医院 MRSA的检出率最高达92. 5%。2006年中国CHINET细菌耐药性监测显示MRSA在金葡菌感染中所占比例平均为76. 3 %，说明MRSA感染已经达到了很严重的程度(汪复，2008)。 在国外，近年在南欧部分国家和英国MRS A在金葡菌感染中的检出率在大型医院达到了 30% -50%。在德国，1996-2006年间MRSA的感染率不断增长达到了 20% -22%，德国的一所大型教学医院(kath-arinen hospital)MRSA感染的病例在1994-2003年间上升了 277% (Trautmann et al. ,2007) 2004年美国大部分医院MRSA感染率都超过50%， MRSA在美国占院内感染金葡菌的比率从1975年的2. 4%上升到1997年的39. 9%。2005 年，美国Uehnert等在全美475所医院的调查显示，MRSA感染的住院病人相比1995年增长了 10倍，是2000年的3倍，比2004年增长了 30 %，而且由于检测及培养方面的差别与缺陷，实际的发生率可能更高(Jarvis et al.，2007)。近年来感染菌变迁的总趋势是革兰氏阴性杆菌占主要地位(张秀珍，1999)，临床上感染的革兰氏阴性菌菌群主要有 大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属 (Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)。季萍等 (2002)的研究结果表明，这些致病的革兰氏阴性菌大部分产生了耐药性肠杆菌科细菌对氨苄西林耐药率为80 % 100 %，除肺炎克雷伯菌外，对阿莫西林/棒酸耐药率为> 60 %。 除大肠杆菌外，对培氟沙星耐药率为<50%。除肠杆菌属外对奈替米星、头孢西丁的耐药率为15% 30%，铜绿假单胞菌对亚胺培南、庆大霉素、头孢他啶、妥布霉素耐药率为10% 25%。不动杆菌属对亚胺培南、妥布霉素耐药率2% 29%。产ESBLs菌株高度耐三代头孢菌素，对氨基糖苷类、复方新诺明、喹诺酮类交叉耐药率高达78. 9 % 100 %。兔防御素的生产目前文献报道获取兔防御素的途径大部分是从兔子中获得的(Judithet al.，
1980；Selsted et al.，1983，1984，1985 ；Lehrer et al.，1981，1983，1985 ；Sinha et al.， 2003)。中国科学院遗传与发育生物学研究所以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以NPTII和硝酸还原酶基因为筛选标记，以Ubiquitin启动子控制NP-I，获得了能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-I活性的转基因小球藻(安洋等，2008)。NP-1 的离体抗菌活性已有较多报道(Patterson-Delaf ield et al. , 1980,
1981；Selsted et al.,1984,1985c ；Lehrer et al, 1983,1985a,986 ；Levitz et al.， 1986 ；Miyasaki et al. , 1990b, Borenstein et al. ,1991a,1991b ；Kohashi et al., 1992)，已报道的NP-I的抗菌谱有白色念球菌(Candida albicans)，粪肠球菌 (S. faecalis),枯草杆菌(B. subtil is),鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，月市炎链球菌(Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)， 李斯特菌(Listeria monocytogenes),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),大肠杆菌(Escherichia coli),肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetella bronchiseptica),曲霉(Aspergillus fumigatus),米根霉 (Rhizopus oryzae)，伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，哨蚀艾肯菌Eikenella corrodens), 二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga spp.),梅毒螺旋体 (Treponema pallidum)。但其在抗耐药细菌方面还未见报道,在活体抗细菌方面也未见报道。抗病毒方面的报道较少(Nakashima et al. , 1993 ；Lehrer et al, 1985b ；Sinha et al. ,2003)。
发明内容
本发明提供了一种改造的NP-I (即mNP-1)及其在抗细菌方面的应用，所述的改造的NP-I (即mNP-1)具有34个氨基酸，第一个氨基酸为甲硫氨酸，是新加上的，其余的33个氨基酸来自兔防御素NP-I的序列，改造后的NP-I的核苷酸序列为SEQ ID N0:15所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO :16(简称mNP-Ι)。mNP-1具有较强抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力，在离体水平mNP-Ι浓度为5 μ g/mL以上时，对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有杀灭作用。我们还在活体上证明了 mNP-Ι对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有显著杀灭效果，尤其是对耐药菌杀灭的效果更为显著。而前人从兔中获得的防御素NP-I浓度为50 μ g/ mL以上时，对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌杆菌，大肠杆菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，流感嗜血杆菌具有杀灭作用(Selsted et al.，1984)。我们比较了 mNP-Ι与从兔子中分离获得的天然NP-I抗革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌)及革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)的效果，结果表明mNP-Ι比从兔子中分离获得的天然NP-I的抗菌效果更好。至今未有报告从兔子中分离获得的防御素NP-I对耐药菌有杀灭作用，也未有报道在活体水平上对杀灭革兰氏阴性菌和阳性菌有效。1-10% (v/v)浓度的人血清对mNPl抑菌活性没有影响。具体地，在本发明的一个方面，提供了一种短肽mNP-Ι，其氨基酸序列为SEQ ID NO 16所示的序列。在本发明的另一个方面，提供了编码所述短肽mNP-Ι的核酸。优选地，所述核酸的序列为SEQ ID NO 15所不的序列。在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含上述之一的核酸。在一个具体的实施方案中，所述表达载体是通过将Nos终止子(SEQ ID NO: 6)，Ubiquitin 基因启动子(SEQ ID NO :1)，含有编码上述 mNP-1 (SEQ ID NO 13)的基因以及NR基因表达框(SEQ ID NO :5)依次连接到载体的多克隆位点中，获得表达载体 pGreen-NR-U-mNPlο在本发明的另一个方面，提供了宿主细胞，其包含上述的核酸或上述的表达载体。在本发明的又一个方面，提供了药物组合物，其包含上述的短肽mNP-Ι或上述的编码所述短肽mNP-Ι的核酸和任选地药用载体。优选地，所述的药物组合物为溶液、片剂、 胶囊、雾剂、膏剂、粉剂或注射剂的形式。在本发明的又一个方面，提供了上述的短肽mNP-Ι或上述的编码所述短肽 mNP-Ι的核酸在制备抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌药物中的应用。在优选的实施方案中，所述细菌是奈瑟氏菌属(Neisseria),葡萄球菌属(Staphylococcus),李斯特菌属(Listeria),假单胞菌属(Psdeuomnoda),埃希氏菌属(Escherichia),克雷伯氏菌属(Klebsiella),沙雷氏菌属(Serratia),嗜血杆菌属(Haemophilus),博德特氏菌属(Bordetella),螺旋杆菌属(Heliobacterium),链球菌属(Streptococcus),不动杆菌属(Acinetobacter),沙门氏菌属(Salmonella)。更优选地，所述细菌为淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA),铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐药铜绿假单胞菌， 大肠杆菌(Escherichia coli),幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum),肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)，沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichia coli)。在一个具体的实施方案中，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli),铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae),幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)和沙门氏杆菌(Salmonella)。在一个具体的实施方案中，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
图1. PBI221质粒结构图。图2. pbinUGUS质粒结构图。图3. pGreen0029 质粒结构图。图4. pGreen0029nos 质粒结构图。图5. pGreen0029-U-nos 质粒的结构图。图6. pGreen0029-U-mNPl-nos 质粒结构图。图7pGreen-NR-U_mNPl 质粒结构图。图8.电击方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到的抗G418的藻落。图9.NPTII基因PCR检测结果。1泳道为阳性质粒，2泳道为未转化藻株nrm_4 ; 3-11泳道为转化藻株1-9 ；图10. Ubi-mNP-1-Nos基因PCR检测结果。1泳道为未转化藻株nrm_4 ；2泳道为 阳性质粒；3-11泳道为转化藻株1-9。图11. Sephadex G-50的紫外吸收峰图。图12. Sephadex C-25的紫外吸收峰图。图13.从转基因小球藻中纯化mNP-1的电泳图。1，4 :蛋白质分子量标准；2，3 :纯 化的mNP-1 (箭头所指)。图14. mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析结果。图15. mNP-1对淋病奈瑟氏菌抑杀结果。图16. mNP-1对金黄色葡萄球菌(药敏质控菌)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA)的抑杀结果。图16A1为mNP-1对药敏质控菌的抑菌试验，图16A2为mNP-1对MRSA 的抑菌试验，其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓 度(以U g/ml表示)mNP-l ;编号9为细菌对照(以PC表示，阳性对照)。细菌生长以“ + ” 表示，不生长以表示。图16B头孢西丁对金黄色葡萄球菌(药敏质控菌)(上图)和 MRSA(下图)的抑菌试验，其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号 2-8为不同浓度(以y g/ml表示)头孢西丁 ；编号9为细菌阳性对照，以PC表示。细菌生 长以“ + ”表示，不生长以表示。图17. mNP-1对铜绿假单胞菌(药敏质控菌)和临床多重耐药铜绿假单胞菌的抑 杀结果。图17A1为mNP-1对铜绿假单胞菌(药敏质控菌)的抑菌试验。图17A2为mNP_l 对临床多重耐药铜绿假单胞菌株的抑菌试验。其中试管编号1为培养基对照(以NC表示， 即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以y g/ml表示)NP-1 ;编号9为细菌阳性对照，以PC 表示。细菌生长以“ + ”表示，不生长以表示。图17B为头孢他啶对铜绿假单胞菌(药 敏质控菌，上图)和铜绿假单胞菌临床多重耐药菌株的抑菌试验(下图)，其中试管编号1 为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以yg/ml表示)NP-1 ;编 号9为细菌阳性对照，以PC表示。细菌生长以“ + ”表示，不生长以表示。图18. mNP-1对大肠杆菌的抑杀结果，其中80 y g/ml-5 u g/ml表不mNP-1的浓度， CK表示大肠杆菌对照。
图19.转mNP-Ι小球藻提取液对大肠杆菌的抑杀结果,其中含50 μ g/ml mNP-1的小球藻提取液以“TC”表示；非转基因小球藻(野生藻)提取液以“CK”表示。图20. mNP-Ι对幽门螺旋杆菌的抑杀结果。图21. mNP-Ι对肺炎链球菌的抑杀结果，CK表示细菌对照。图22. 1-10%的人血清对mNP-Ι的抑杀大肠杆菌生长的活性没有影响。图23. mNP-Ι与从兔子中提取的天然NP-1对金黄色葡萄球菌抗菌效果比较结果。图24. mNP-Ι与从兔子中提取的天然NP-I对肺炎链球菌抗菌效果比较结果。图25. mNP-Ι与从兔子中提取的天然NP-I对铜绿假单胞菌抗菌效果比较结果。图26. mNP-Ι与从兔子中提取的天然NP-I对大肠杆菌抗菌效果比较结果。
具体实施例方式下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6 X Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通 Taq酶，plus 2000 Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA 连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，购自鼎国公司；SephadexG_50, Sephadex C-25 购自 pharmacia 公司。实施例I.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO 1)设计引物，上游引物5’ CCGGAAGCTT GTGCAGCGTGACCCG3’ (SEQ ID NO 2):下游引物5’ GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3 ’ (SEQ ID NO:
3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从玉米基因组中得到Ubiquitin启动子，测序结果显示为Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO :4，其在SEQ ID NO :1的5’端及3’端分别添加了 Hind III酶切位点和BamH I酶切位点)。PCR反应条件为94°C预变性3min， 94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸2min, 30个循环结束后，72°C延伸IOmin0将PCR产物2007bp大小的片段，用HindIII和BamHI内切酶双酶切，质粒pBI221 (Clontech)(图I) 也经HindIII和BamHI内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37 °C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Hind III和BamH I内切酶双酶切鉴定，能够得到1987bp大小片段(即 Ubiquitin启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。实施例2.利用pGreen0029框架来构建表达载体。根据Nos终止子序列(SEQ ID NO 6)设计引物，上游引物:5，ATAAGAATGCGGCCGCTC GAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’ (SEQID NO 7)下游引物5，CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA 3’(SEQ ID NO :8)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从pBI221 (Clontech)中获得了 Nos终止子，PCR反应条件为94 V预变性3min，94 V变性30s，56 V退火30s，72 °C延伸30s， 30个循环结束后，72°C延伸lOmin。将PCR产物268bp大小的片段，用Not I和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(图3，来自BBSRC)也经Not I和Sac I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37°C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Sac I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029nos (图4)。实施例3.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体pGreen-NR-U-mNPl的构建.按照常规技术，将Ubiquitin启动子(SEQ ID NO :I)从载体pbinUGUS(图2) 中通过HindIII和BamHI双酶切回收后，连接到同样经过HindIII和BamHI双酶切的 pGreen0029nos载体上(图4)获得pGreen0029-U_nos初级中间载体(图5)。通过化学合成方法合成带有目的基因mNP-Ι的序列(其序列如SEQ ID NO 13)，为提高NP-I的抗病毒活性，在合成的过程中，在NP-I的N端添加了一个甲硫氨酸，将NP-I改造成了 mNP-1， 因mNP-Ι基因太小，为方便构建载体，在该基因的C端添加了 75bp辅助序列，同时在基因的5’和3’端分别添上两个酶切位点BamH I和Notl，最终得到合成的带有mNP-Ι基因的 201bp序列(SEQ ID NO : 13)，将合成的序列(SEQ ID NO :13)通过BamH I和NotI双酶酶切回收189bp的带有mNP-1基因的片段，然后与经同样经过BamH I和NotI双酶酶切的载体 pGreen0029-U-N0S 连接(图 5)，获得载体 pGreen0029-U-mNPl-nos (图 6)。最后通过HindIII酶切pSK-NR质粒(含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收号为AY275834，NR表达框序列如SEQ ID NO 5所示，涉及pSK_NR质粒及NR表达框的专利公开号CN1676597)，回收4518bp NR表达框片段，单酶切NR表达框和载体pGreen0029-U-mNPl-N0S，然后将它们相连，则构建成椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的 mNP-Ι 植物表达载体 pGreen-NR-U-mNPl (见图 7)。实施例4.小球藻电击转化小球藻E4液体培养基见表4。小球藻固体培养基液体培养基+7%琼脂pH 5. 4 7. O。小球藻筛选培养基小球藻固体培养基的Na2NO2O. 69g/L替换为10mmol/L N03_，并添加抗生素G418至终浓度为15mg/L。取50ml对数生长期的硝酸还原酶突变体小球藻nrm-4(公开号CN 1676597A), 50 X g,离心 IOmin 离心收集藻细胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2, HIACHI);用高渗液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M)冰上处理l-3h ；50g离心IOmin,去上清，沉淀用5ml电击缓冲液(山梨醇O. 2M，甘露醇O. 2M, KCL O. 08M, CaCL2O. 005M, HEPES O. 01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到I X IO6个/mL ;加入终浓度为10 μ g/mL的质粒pGreen-NR-Ubi_mNPl和 25 μ g/mL的鲑精DNA，混匀，冰上放置5_10min后电击，取400 μ I混合好的小球藻细胞放入电击杯中，电击。脉冲电压为6-10. 5KV，脉冲持续时间分别为O. 001-0. 2s，脉冲次数为21CI， 脉冲距离为2mm,循环周期为100。电击后将小球藻转入筛选培养基中培养(图8)。实施例5.转基因小球藻的分子检测a.转基因小球藻总DNA的提取挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25°C，光照 25001ux，120rpm)。2周后(浓度达到约为I X IO8个/mL)，1600g离心IOmin收集藻细胞， 在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻总DNA，提取的DNA存于-20°C备用。b.转基因小球藻的PCR检测以转基因藻基因组DNA为模板，分别进行NPTII基因(载体质粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列为SEQ ID NO 14)和Ubiquitin启动子mNP-1-Nos终止子的PCR扩增。检测 NPTII 基因的 PCR 引物为:正向引物 NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’ (SEQ ID NO 9);反向引物 NPTn-r，5' TCCGGTGCCCTGAATGAACT3，(SEQ ID NO :10)。PCR 反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s，57°C退火40s，72°C延伸Imin 30s，30个循环结束后，72°C延伸IOmin0可以扩增出约501bp的片段。Ubiquitin-mNPl-Nos的基因序列的 PCR 扩增，扩增的引物分别为Ubi-852-L :5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’ (SEQ ID NO: 11) ;Nos-2429-R :5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’ (SEQ ID NO :12)。PCR 反应条件为 94°〇预变性311^11，941变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环结束后，72°C延伸 IOmin0可以扩增出约1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNPl-Nos片段。共对9个藻株进行了检测，检测结果见图9，10。转化藻株1-9，能够扩增出外源 NPTII基因，在转化藻株1-4和6-9中能够扩增出外源Ubiquitin-mNPl-Nos片段，在转化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNPl-Nos片段都能够扩增出来。证明NPTII和 Ubiquitin-mNPl-Nos片段PCR均为阳性的藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步检测转基因藻株的mNPl活性。实施例6.转基因小球藻可溶性蛋白的提取用E4培养基(培养基成分见表4)培养转基因藻，离心收集对数生长期(浓度约为I X IO8个/mL)的细胞，约3g湿藻重，然后按湿藻重无菌水=I : I进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，沸水煮IOmin使大分子量蛋白质变性沉淀。4°C过夜后7500g离心lOmin，取上清液。表4培养基组成
权利要求
1.一种短肽mNP-1，其氨基酸序列为SEQ ID N0:16所示的序列。
2.编码权利要求I所述短肽mNP-1的核酸，优选地，其序列为SEQID NO: 15所示的序列。
3.表达载体或宿主细胞,其包含权利要求2所述的核酸。
4.药物组合物，其包含权利要求I所述的短肽mNP-1或权利要求2所述的核酸和任选地药用载体，优选地，其为溶液、片剂、胶囊、雾剂、膏剂、粉剂、或注射剂的形式。
5.权利要求I所述的短肽mNP-1或权利要求2所述的核酸在制备抗细菌的药物中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中所述的细菌为革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌。
7.权利要求6所述的应用，其中所述的细菌为奈瑟氏菌属(Neisseria)，葡萄球菌属(Staphylococcus),李斯特菌属(Listeria),假单胞菌属(Psdeuomnoda),埃希氏菌属(Escherichia),克雷伯氏菌属(Klebsiella),沙雷氏菌属(Serratia),嗜血杆菌属 (Haemophilus),博德特氏菌属(Bordetella),螺旋杆菌属(Heliobacterium),链球菌属 (Streptococcus),不动杆菌属(Acinetobacter),沙门氏菌属(Salmonella)。
8.权利要求6所述的应用，其中所述细菌为上述属中的具体的细菌。
9.权利要求6所述的应用，其中所述细菌为淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA),铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),泛耐药铜绿假单胞菌,大肠杆菌(Escherichia coli),幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum),肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichia coli)。
10.生产权利要求I所述短肽mNP-1的方法，其特征在于在小球藻中表达序列为SEQID NO 15所示的核酸。
全文摘要
本发明利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对革兰氏阴性菌和阳性菌等具有很强的抑制或杀灭作用，也可杀灭耐药菌。本发明的结果可应用于制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物，也可用于制备抗耐药的超级细菌的药物。
文档编号A61K48/00GK102603885SQ20111044506
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者储成才, 孙勇如, 孙永华, 宋丽英, 尹维波, 张建中, 张英涛, 彭宜红, 杨鹤鸣, 白丽莉, 胡赞民, 赵世民, 陈凡, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所