专利名称：一种抗tom22蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供一种单克隆抗体，该抗体能特异识别线粒体中的Tom22蛋白；以及所述抗体在制备用于治疗肝脏疾病的药物中的应用，本发明还提供药物组合物，其包含所述单克隆抗体作为活性成分。
背景技术：
抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。随着基因工程抗体技术的发展和完善，抗体药物已从鼠单克隆抗体发展到人鼠嵌合抗体、人源化抗体及人源抗体。截至2010年美国FDA已批准超过40个抗体药物。此外还有超过120种抗体药物处于临床研究，超过500种抗体药物处于临床前研究。这些抗体主要应用于自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤的治疗。线粒体含有1000-2000种蛋白质，作为半自主性细胞器，其中，2%是由线粒体基因编码;98%的蛋白是由核基因编码的，它们经胞质核糖体合成后转运进入线粒体，每一种蛋白在特定位置才能发挥功效，所以定向的将蛋白质转运至线粒体的各部位十分重要。Tom复合体作为线粒体前体蛋白进入线粒体的门户，它调节未折叠的前体蛋白通过线粒体外膜。Tom复合体包括 核心亚基Tom40、Tom22、Tom5、Tom6和Tom7,以及外周亚基Tom20和Tom70。其中hTom22、Tom20以及Tom7是线粒体前体蛋白定位到线粒体上的受体；Tom40是Tom复合体的核心组成,形成了蛋白转运的通道(GIP) ;Tom5、Tom6和Tom7具有组装以及稳固Tom复合体的功能。它们各司其职，实现线粒体前体蛋白的转运。线粒体的不同前体蛋白的转运不是一个重复的过程，具有不同的路径，不同的机制，分别定位于外膜、内膜、基质以及膜间隙。高文祥等的“线粒体蛋白转运的研究进展”综述了有关转位分子介导的线粒体蛋白转运的研究进展，从不同复合物介导蛋白转运角度出发叙述线粒体前体蛋白的转运途径:Τ0Μ- Μ23介导内膜蛋白转运、Τ0Μ- Μ22介导内膜蛋白转运、TOM-SAM介导外膜蛋白转运、IMS蛋白转运以及OXAl复合物介导蛋白向外转运。孟紫强等的文章中简述了线粒体前体蛋白转运过程中的有意义部分:转运需要的能量、分子伴侣、线粒体前体蛋白的导肽、Tom复合体、Tim复合体以及位于膜间隙的异型多亚基蛋白质复合物的作用。而杨福愉的“蛋白质跨线粒体膜的运送”一文中从转送的目标位点出发，阐述了定位于基质蛋白质运输途径、定位于外膜的蛋白质运送途径、定位于膜间隙的蛋白质运输途径。hTom22是线粒体外膜上转运线粒体前体蛋白的重要组成成分。hTom22由三部分组成包括N-端、C-端以及虚拟存在的横跨膜。hTom22 N-端暴露在细胞溶质区域，富含84个酸性氨基，包括19个负电荷域以及9个正电荷域。这一区域主要是通过静电作用与线粒体前体蛋白带正电荷的导肽(含有将要到达线粒体部位的信息，致使线粒体前体蛋白准确定位)结合，是线粒体前体蛋白结合的受体领域之一。对于组装hTom22以及定位于线粒体外膜上hTom22正电荷域发挥着重要的作用，但是Court DA等提出hTom22的负电荷域却不是必需的成分，也不是线粒体前体蛋白的结合以及转运的必要成分。T0M22 N-端的转移膜螺旋束缚着Tom40的两个亚基，这样的作用并不影响线粒体前体蛋白的前序列。hTom22C-端即IMS功能域暴露在膜间隙区域具有将自身组装成Tom复合体以及转运前体蛋白的作用，但是对于前体蛋白的定位以及结合不是必需的组成部分。hTom22的MS功能域对于T0M22-TIM23前体蛋白三聚物的稳定性是必需的。hTom22的MS功能域和Tim23 N-末端50个氨基酸残基的片段可以促使前体蛋白由TOM复合物转运至 Μ23复合物。DEBORAH A.COURT通过中断方法使N.crassa的基因失活，使用遗传学的方法分析特定突变的等位基因。通过实验产生了 2种hTom22突变蛋白(缺乏2/3或者整个IMS)，发现hTom22的MS域不是hTom22组装成Tom复合体必须的组成部分,也不是线粒体前体蛋白的转运到线粒体的至关重要的组分，但是对于反式结合位点识别的前体蛋白的转运具有提高效率的作用。hTom22的IMS可以方便的将线粒体前体蛋白释放到线粒体外膜的脂质双分子中或是IMS，也是Tom复合体与线粒体内膜的接口。肝是人体内十分重要的器官，俗称“化工厂”，具有解毒以及代谢产物的作用。在Silvia Curado等的实验中，他们提出了 T0MM22突变体为肝再生提供了模型，是一个重要的脊椎动物的遗传模型，用来研究线粒体生物学和线粒体肝疾病。奥利弗突变体tom22s469在内胚层器官中高度的表达(如肝脏、肠)，是肝脏的特异性表型。他们在实验中使用tom22mo诱导肝细胞的凋亡以及吗啉反义寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表达。当使用tom22mo处理肝时诱发肝细胞的凋亡，肝细胞中出现奥利弗突变体tom22s469。用吗啉反义寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表达，使T0MM22基因瞬时中断。当T0MM22出现中断表达时，就会在tom22s469中出现肝细胞特异性再生表型并且可以达到野生水平并且在T0MM22恢复之时已经完成肝细胞的再生。T0MM22基因的临时中断对于成熟的肝细胞无影响。因此，我们可以发现，抑制T0MM22基因的表达或者抑制tom22蛋白的功能将有助于肝细胞和肝脏的再生恢复，本发明就是基于这个规律，筛选特异识别人源tom22蛋白的抗体，再运用该抗体来中和tom22蛋白的功能，从而为各种肝脏疾病患者的肝细胞再生提供一种新的治疗药物。
本发明的特色是运用重组表达的tom22蛋白膜外区直接在非免疫鼠源ScFv噬菌体表面呈现表达库中筛选。本发明提供的单克隆抗体命名为HX1，经过检测单克隆抗体对特异性识别结合tom22蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体可与Tom22蛋白特异性结合，从而可以用于制备治疗肝病的药物。具体地，本发明提供以下:
1.一种单克隆抗体，其特征在于，它的重链可变区由120个氨基酸残基组成，序列如
下:Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lyslie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys GlnAla Leu Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro ThrTyr Val Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Asp Thr Thr AlaTyr Leu Gln lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg AspGly Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala LysThr
编码重链可变区的cDNA序列为:
gaggtgaagcttgaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctggatataccttcagaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctctaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaacatatgttgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgacaccactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacgcggctacatatttctgtgtaagagatggttcttatggtatggactactggggtcaaggaactccagtcaccgtctcctcagccaaaacg
其轻链可变区由108个氨 基酸残基组成，序列如下:
Thr Leu Cys Ser Pro Ser Leu Gln Gln He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr He His Trp Tyr Gln Gln Lys SerGly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Val Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Asn Thr Met Glu AlaGlu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Ser Pro He Thr Phe GlyGly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg
编码轻链可变区的cDNA序列为:
acattgtgctcacccagtctccagcaaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatacactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatgggtttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcaacaccatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaagtcacccatcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg
2.一种单克隆抗体，其特征在于，它的序列与权利要求书I所述的单克隆抗体的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。3.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含有的重链和轻链可变区序列是与以上I和2所述的可变区的序列是一致的；该基因工程抗体可以是:人一鼠嵌合抗体(chimericantibodies);或者是人源化抗体(humanized antibody, HAb)或改形抗体(Reshapedantibody, RAb);或者是抗体的功能性片段Fab ;或者是单链抗体(single chain FVfragment, SCFv);或者是重链可变区和完整轻链的融合的抗体功能性片段VH-L ;或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体或抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。4.如权利要求书1-2所述的单克隆抗体或权利要求书3所述的基因工程抗体，其特征在于，它与线粒体中的Tom22蛋白具有特异的结合能力。5.如权利要求书1-4所述的单克隆抗体或基因工程抗体，其特征在于，它与线粒体中的Tom22蛋白具有特异的结合能力，并广泛用于肝脏疾病的治疗
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求书1-4所述的单克隆抗体或基因工程抗体；以及药学上可接收的载体或缓冲液或添加剂或赋形剂。7.如权利要求书6所述的药物组合物，其特征在于，它可用于治疗各种肝脏疾病。附图表说明:
图1.与恒定区连接后表达的全长HXl抗体的12% SDS-PAGE检测。泳道1_4为经DTT还原后的HXl抗体重链和轻链；泳道5为蛋白标准分子量参考；泳道6-7为未还原的全长HXl抗体。
具体实施例方式为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例一、人源Tom22蛋白的重鉬表汰和钝化
设计引物(Primerl: 5，G ATAT CC ATG GCT GCC GCC GTC G 和Primer2:5，GATACTCGA GCTATG CCC TGG A AA ACC TG)从人肝细胞cDNA中通过PCR扩增(PCR主要反应条件:94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸35秒；共30个循环)，得到的目的片段经NcoI/XhoI双酶切后连接到表达载体pHAT2的Ncol/Xhol位点之间，筛选阳性克隆后，经测序发现得到的序列与理论序列完全一致:
ATGGCTGCCGCCGTCGCTGCTGCCGGTGCAGGGGAACCCCAGTCCCCGGACGAATTGCTCCCGAAAGGCGACGCGGAGAAGCCTGAGGAGGAGCTGGAGGAGGACGACGATGAGGAGCTAGATGAGACCCTGTCGGAGAGACTATGGGGCCTGACGGAGATGTTTCCGGAGAGGGTCCGGTCCGCGGCCGGAGCCACTTTTGATCTTTCCCTCTTTGTGGCTCAGAAAATGTACAGGTTTTCCAGGGCA ；
其编码的氨基酸序列为:
MAAAVAAAGAGEPQSPDELLPKGDAEKPEEELEEDDDEELDETLSERLWGLTEMFPERVRSAAGATFDLSLFV
AQKMYRFSRA
得到的重组质粒pHAT2-tom22转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，从该转化平板上挑单克隆于IOml新鲜培养基(含100ug/ml的氨苄青霉素)中37°C培养过夜；将过夜的IOml菌液转入IL新鲜培养基(含100ug/ml的氨苄青霉素)于37°C培养4小时后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导目的蛋白的表达，诱导6小时；于4°C 6000rpm离心收集菌体沉淀。将得到的菌体沉淀用60ml裂解缓冲液(25mM Tris，pH8, 500mM NaCl)重悬后，超声裂解细菌；15000rpm离心30分钟(4°C )，收集上清，加入到经裂解缓冲液平衡好的Iml的N1-NTA填料中，上样速度30ml/小时；再用裂解缓冲液清洗非亲和结合的吸附蛋白；然后用 IOml 洗脱缓冲液(25mM Tris, pH8, 500mM NaCl,200mM imidazole)将目的蛋白洗脱下来，15%SDS-PAGE电泳分析纯化结果。纯化的蛋白脱盐换到PBS缓冲体系中，_80°C冻存备用。实施例二、Panning筛选
噬菌体表面呈现文库是专利申请者之前构建的一个非免疫鼠源ScFv表达库。本专利就是从该文库中筛选能特异识别Tom22蛋白的抗体。用Tom22蛋白抗原包被塑料培养皿后，将重组噬菌体上清倾至其上，37°C培养2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后将培养至对数生长期的TGl倾至免疫吸附后的培养皿上，37°C培养I小时。如此“吸附一洗脱一繁殖”的过程即为Panning筛选，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。以后按上述方法进行7轮筛选。
实施例三、单个重组噬菌体克隆的抗原结合活性的鉴定
1.制备单克隆重组噬菌体
Panning筛选后，将TGI茵液按原液；1:10 ;1:100 ；1:1000 4个稀释度稀释，铺于SOBAG琼脂板上，3 (TC倒置培养过夜。挑选90个单菌落，分别接种于100 u I的2XYTAG中，30°C培养过夜，取20u I培养物，加入200u I含5X10pfu/ml M13K07的2XYTAG中，37°C振荡培养2h，离心，用2XYTAK 200u I重悬沉淀，30°C培养过夜.离心后的上清即为单个重组噬菌体。2.ELISA 检测抗原结合活性(Douillard , et al., Enzyme-linkedImmunosorbent Assay for Screening monoclonal antibody production usingenzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74, 1983)
设I个阴性对照孔，I个阳性对照孔，90个待测孔。100 u 10.5% BSA包被阴性对照孔，100 u I羊抗M13噬菌体抗体包被阳性对照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待测孔。1%BSA 3 7°C封闭I小时。对照孔加M I 3噬菌体，待测孔加5 O u I待测上清与5 O u I封闭液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 uI工作浓度的HRP/羊抗M13噬茵体抗体，37 V反应I小时。PBST洗板4次，加新鲜配制的H202-ABTS，在 4 I O n m 测每孔 OD 值。
实施例四、阳性克隆的ScFv基因序列测定，真核表达和纯化
选择筛选获得的阳性克隆分别送公司进行DNA测序。设计引物将阳性克隆的轻重链可变区与鼠源IgG的对应的轻重链恒定区连接后插入到真核表达；然后分别转染CHO细胞筛选稳定表达株。取Iml的ProteinG-sepharose FF介质到柱子中，经PBS平衡后，将收集的细胞培养上清经ProteinG-sepharose FF柱子纯化，然后用PBS清洗50柱体积后，用IOOmMGlycine (pH3)将目的蛋白洗脱到IM Tris, pH8.5平衡液中。在分别透析到PBS缓冲液中。10%SDS-PAGE鉴定纯化得到的抗体纯品。
实施例五、抗体的活性鉴定
设I个阴性对照孔，I个阳性对照孔，4个待测孔。IOOul 10.5% BSA包被阴性对照孔，100 u I羊抗鼠抗体包被 阳性对照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待测孔。1%BSA 3 7°C封闭I小时。对照孔加IgG，待测孔加5 O u I待测抗体与5 O u I封闭液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 u I工作浓度的HRP/羊抗鼠抗体，37°C反应I小时。PBST洗板4次，加新鲜配制的H202-ABTS，在4 I O n m测每孔OD值。结果发现一株抗体与抗原有很强的反应。命名为HX1。
参考文献
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1.一种单克隆抗体，其特征在于，它的重链可变区由120个氨基酸残基组成，序列如SEQ ID NO:1所显示；其轻链可变区由108个氨基酸残基组成，序列如SEQ ID NO:2所显/Jn ο
2.一种单克隆抗体，其特征在于，它的序列与权利要求书I所述的单克隆抗体的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。
3.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含有的重链和轻链可变区序列是与权利要求书I和2所述的可变区的序列是一致的；该基因工程抗体可以是:人一鼠嵌合抗体(chimeric antibodies);或者是人源化抗体(humanized antibody, HAb)或改形抗体(Reshaped antibody, RAb);或者是抗体的功能性片段Fab ;或者是单链抗体(singlechain FV fragment, SCFv);或者是重链可变区和完整轻链的融合的抗体功能性片段VH-L ；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体或抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。
4.如权利要求书1-2所述的单克隆抗体或权利要求书3所述的基因工程抗体，其特征在于，它与线粒体 中的Tom22蛋白具有特异的结合能力。
5.如权利要求书1-4所述的单克隆抗体或基因工程抗体，其特征在于，它与线粒体中的Tom22蛋白具有特异的结合能力，并广泛用于肝脏疾病的治疗。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求书1-4所述的单克隆抗体或基因工程抗体；以及药学上可接收的载体或缓冲液或添加剂或赋形剂。
7.如权利要求书6所述的药物组合物，其特征在于，它可用于治疗各种肝脏疾病。
全文摘要
本发明提供了一种能特异性结合线粒体Tom22蛋白的单克隆抗体及其在治疗肝病中的功用。该单克隆抗体稳定性好、特异性强。本发明提供了该抗体的可变区序列。本发明还提供了一种药物组合物。
文档编号A61P1/16GK103183737SQ20111044498
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者安祺 申请人:北京和信非凡生物技术有限公司