专利名称：提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高单子叶植物对非生物胁迫(abiotic stress)的抗性的方法。具体而言，本发明涉及一种通过在单子叶植物中表达海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)来提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性、同时又惊人地维持其正常生长和发育特性的方法。
背景技术：
2000年11月23日公开的国际申请WO 00/70067涉及一种水稻肌动蛋白2启动子和肌动蛋白2内含子及其使用方法。它描述了通过在细胞中引入编码海藻糖-6-磷酸合成酶的基因并通过天然磷酸酶的后续作用、或者通过引入和共同表达产生海藻糖(它是能够减轻胁迫作用的保护性化合物)的特定磷酸酶产生对干旱环境或胁迫的抗性(参见相应的USP6429357，第19和20栏)。
美国专利5925804涉及利用E.coli海藻糖磷酸合成酶基因来提高植物中的海藻糖产量，参见第7和8栏。
Seo Hs等人的Appl.Envrion.Microbiol.，662484-2490，(2000)涉及Escherichia Coli.的海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶的双功能融合酶(TPSP)的特性。
海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-[1，1]-α-D-吡喃葡糖)是非还原的二糖苷，因此它作为Maillard browning反应的部分不与氨基酸或蛋白质反应。海藻糖可存在于各种生物体中，包括细菌、藻类、真菌、酵母、昆虫和一些植物中，它不仅用作碳水化合物类保藏剂，还用作耐各种物理和化学胁迫的保护剂(参见Elbein A，Adv，Carbohydr.Chem.Biochem.，30227-256，1974；Eleutherio ECA等，Cryobiology，30591-596，1993；Strom AR and KaasenI，Mol.Microbiol.，8205-210，1993；van laere A，FEMS Microbiol.Rev.，63201-210，1989；以及Wiemken A，J.Gen.Microbiol.，58209-217，1990)。另外，还已知海藻糖在干燥条件下表现出很高的保水活性，由此可以维持细胞膜的流动性，并让植物对脱水和再水合周期中自然产生的胁迫产生抗性(参见Leslie SB等，Appl.Envrion.Microbiol.，613592-3597，1995；Drennan PM等，J.Plant Physiol.，142493-496，1993；以及Muller J等，PlantSci.，1121-9，1995)。对于对脱水有抗性的隐生植物物种如S.leidophylla等而言，已验证了海藻糖对胁迫抗性的这种作用。在这方面，已报导了在该植物物种的脱水过程中，海藻糖可以积累到植物干重的12％的水平，而海藻糖的积累在再水合过程中会降低(参见，Goddijn OJM和van Dun K，TrendsPlant Sci.，4315-319，1999)。
根据海藻糖的这种活性，人们试图用来提高植物的胁迫抗性。目前为止，人们在双子叶植物中发现了表达来自E.coli或真菌的海藻糖-6-磷酸合成酶(PTS)基因和/或表达海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的转基因植物。这些转基因植物一般以很低的水平表达海藻糖。但是，在这些转基因植物中，尽管胁迫抗性得到某种程度的提高，但也出现了负面作用，如严重的生长干扰和根系缠绕弯曲(warped)。即使在没有积累海藻糖的情况下也会显现这些负面作用(参见Holmstrom K-O等，Nature，379683-684，1996；Goddijn OJM等，Plant Physiol.，113181-1990，1997；Muller等，PlantSci.，14737-47，1999；Pilon-Smits EAH等，J.Plant Physiol.，152525-532，1998；Romeo C等人，Planta，201293-297，1997)。
在生产人类福利和生存食物的过程中，人们将包括水稻、大麦、小麦、玉米等单子叶植物看作经济作物。因此，已做了许多努力来提高这些农作物的产量和质量。具体来说，为了生产出对非生物自然条件如干旱、高含盐量、低温等有抗性的农作物，人们在不断努力着。
于是，发明人认真研究，开发一种提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法。结果，发明人识别出，当将海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的融合基因引入单子叶植物并在其中表达时，能提高该植物对脱水、高含盐量和低温胁迫的抗性，同时又不会抑制生长水平，由此完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种通过表达TPS基因和TPP基因的融合基因来提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性、同时又维持其表型常态的方法。
本发明的另一目的是提供一种生产单子叶植物的方法，该植物通过表达TPS基因和TPP基因的融合基因提高了对非生物胁迫的抗性。
本发明的再一目的是提供一种生产单子叶植物的方法，该植物通过表达TPS基因和TPP基因的融合基因(TPSP)提高了对非生物胁迫的抗性，同时还没有形态学上的生长缺陷，如生长和发育干扰以及缠绕根系等。
本发明的另一目的是提供一种生产单子叶植物的方法，该植物通过表达TPS基因和TPP基因的融合基因(TPSP)提高了对非生物胁迫的抗性，同时它还表现出正常的生长和发育特性。
发明公开本发明涉及一种增强单子叶植物较好地耐受非生物胁迫如脱水胁迫、盐-胁迫或冷-胁迫等胁迫的方法，其包括利用含海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的双功能融合酶基因(TPSP)的双组质粒来转化单子叶植物，以表达TPSP基因，由此限制了海藻糖-6-磷酸酯(trehalose-6-phosphate)的累积，增强了海藻糖在转化单子叶植物中的累积，同时又维持其正常的生长特性。
优选的是，TPS基因和TPP基因源自E.coli或者真菌。依照本发明的方法可用于提高单子叶植物、尤其是商业价值高的植物如水稻、小麦、大麦和玉米等单子叶植物的抗性。
依据土壤杆菌(Agrobacterium)介导方法将可表达的双功能融合基因引入受体植物细胞中、即实施转化。
附图简要说明
图1是表示作为TPS和TPP的融合重组基因的TPSP基因图的视图；图2是表示重组质粒pSB-UTPSP的基因图的视图；图3a是海藻糖的标准HPIC色谱图；图3b是表示Ubil::TPSP植物叶子的碳水化合物特征曲线的HPIC色谱图；图3c是表示Ubil::TPSP植物种子提取物的碳水化合物特征曲线的HPIC色谱图；图4a是表示经脱水-胁迫处理的Ubil::TPSP水稻植株中的叶绿素荧光的图；
图4b是表示经盐-胁迫处理的Ubil::TPSP水稻植株中的叶绿素荧光的图；图4c是表示经冷-胁迫处理的Ubil::TPSP水稻植株中的叶绿素荧光的曲线图。
本发明实施方式根据本发明，用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法包括以下步骤用含有海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因与海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的融合基因(TPSP)的重组质粒转化单子叶植物，使其表达TPSP基因。在该方法中，TPS基因和TPP基因源自E.coli或者酵母菌，根据土壤杆菌介导法将它们引入单子叶植物如水稻、大麦、小麦或者玉米中。尽管该方法中没有具体限制非生物胁迫，这些非生物胁迫包括脱水胁迫、盐胁迫或者冷胁迫。
除了将含有TPSP基因的重组质粒引入单子叶植物或者它们的祖(ancestor)细胞(只要这些细胞能重新长成植物)之外，根据本发明的提高非生物胁迫抗性的单子叶植物的生产方法按照与提高单子叶植物的所述非生物胁迫抗性的方法的步骤相同的步骤进行。
下面，将对本发明进行具体说明。
到目前为止，由于缺少适合单子叶植物的媒介物、研究论文缺乏等困难，仅在双子叶植物中进行了利用海藻糖来提高植物胁迫抗性的尝试。但是，尽管海藻糖的表达提高了双子叶植物中的胁迫抗性，但由于存在着严重抑制植物生长的负效应，很难取得任何显著效果。因此，也就未对单子叶植物作这样的尝试。
为了提高作为有价值食物资源的单子叶植物的胁迫抗性，发明人将海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)(它们都是海藻糖合成所需的酶)的编码基因的融合基因结合到含有Ubil启动子(其能在单子叶植物中表现较高活性)的载体中以构建重组质粒，然后通过根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化将它们导入水稻植株中。
然后，利用Southern Blot分析转化后的水稻基因型，以鉴别引入基因是否稳定地整合到水稻染色体中。此外，利用Northern Blot分析从所述水稻叶子提取的水稻RNA，以鉴别引入基因是否得到了正常表达。另外，通过碳水化合物定量分析确定，海藻糖的表达水平是现有技术中利用TPS或TPP转化的西红柿中已知表达水平的200倍。对培育水平的观察揭示，与双子叶植物相反的是，水稻植株中海藻糖的过表达不会象单子叶植物中那样严重影响水稻生长。另外，还鉴定出，海藻糖导致了抗非生物胁迫(如脱水、盐或低温)能力的提高。
因此，由于本发明的方法能提高单子叶植物对各种胁迫的抗性，人们期望该方法能有助于大大提高重要价值农作物的产量和质量。下面，将通过以下例子具体说明本发明。相关技术领域中具有普通知识的人员可以理解的是，这些例子仅用于具体解释本发明，本发明的范围并不由这些例子来限定。
实施例1水稻植物的质粒构建和转化通过PCR去掉E.coli TPS的终止密码子，然后连接TPP基因，以构建作为TPS和TPP的融合重组基因的TPSP。(参见图1和Seo HS等人，Appl.Environ.Microbiol.，662484-2490，(2000)，在此引入作为参考，如同做了完整阐述一样)。将所得TPSP连接到玉米的遍在蛋白启动子上，构建Ubil:TPSP，再将其插入到含有35S启动子和bar编码区(膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰基转移酶基因)的表达载体中，以构建重组质粒pSB-UTPSP(参见图2)。图2是表示重组质粒pSB-UTPSP的基因图，其中BR表示右边界序列；BL表示左边界序列；3’pinII表示马铃薯蛋白酶抑制因子II基因的3’区，35S表示35S启动子；而3’nos表示胭脂碱合成酶基因的3’区。由于可被编码进bar基因的膦丝菌素乙酰基转移酶具有去除源于膦丝菌素的除草剂毒性的作用，其可用作选择标记。通过三亲交配将pSB-UTPSP导入根瘤土壤杆菌LBA4404中。
为了利用所述根瘤土壤杆菌LBA4404转化水稻植株，将70％(v/v)的乙醇加到约200粒未去壳种子中(Oryza sativa L.cv Nakdong)，将它们轻轻混合1分钟，为种子灭菌。然后，弃掉乙醇，将种子与100ml的20％(v/v)的Clorax轻轻混合1小时，进一步为种子灭菌，然后用蒸馏水清洗数次。按照以前描述的方法(参见Jang，I-C等人，Mol.Breeding，5453-461，1999)实施种子愈伤组织诱导、对含有按上述方法构建的质粒的土壤杆菌与愈伤组织进行共培养、以及选择转化愈伤组织。在温室内培育利用土壤杆菌介导法转化的水稻植株，以便仅选择对除草剂Basta有抗性的植株。通过根据按照上面所述方法转化和选择的转基因水稻植株的Southern blot分析，可以鉴定，引入的转基因已整合到水稻染色体中，具有一到三拷贝数。为了进一步检测，选择含单拷贝数TPSP基因植株，通过对所选植株叶子的全RNA样品的Northern blot分析可以观察到mRNA约为2.4kb，由此鉴定TPSP得到正常表达。
实施例2对转基因植物中海藻糖积累水平的研究为了研究转基因植物中海藻糖的积累水平和海藻糖对植物中碳水化合物的影响，将实施例1中产生的转基因水稻植株的Ubil::TPSP叶子和种子在液氮中消化，然后用10ml/g的水在100℃条件下提取10分钟。对提取物进行离心，用0.45Nm过滤器过滤所得上清液。然后通过装备了4×250nmCarbo-Pak PAL柱子的DX500HPIC(高效离子色谱仪，Dionex500，Dionex，USA)设备对碳水化合物进行定量分析。在线性梯度条件下利用含有0mM到250mM醋酸钠的150mM NaOH溶液实施HPIC。以商业可得的海藻糖(SigmaChemical Co.，USA)为标样，用ED40电化学检测仪监测HPIC结果(参见图3a)。
海藻糖对各碳水化合物组分和分配的影响如图3b和3c所示。图3b和3c分别是表示Ubil::TPSP植物叶子和种子提取物中的碳水化合物的特征曲线的HPIC色谱图，其中NT表示未转化的水稻植株，而Ubil::TPSP-1和Ubil::TPSP-2表示按照例1选择的含单拷贝数TPSP的两植株。由图3b和3c看到，在Ubil::TPSP水稻植株的叶提取物和种子提取物中出现了含量大约为1.076mg/g的海藻糖，这比已知的利用TPS或TPP基因转化的转基因烟草作物的含量高200倍。另外，还能鉴定，Ubil::TPSP水稻植株的叶提取物中的碳水化合物含量基本上不变，而在种子提取物中变化很大。
另外，根据Ubil::TPSP水稻植株培育水平的观察结果，可以鉴定，Ubil::TPSP水稻植株能长到与未转化水稻植株类似的水平。至此，对于双子叶植物来说，用E.coli或酵母的TPS和/或TPP转化的转基因植物都是已知的，在这些转基因植物中，已经报导了尽管海藻糖以极低的水平表达，但它出现了严重阻碍生长、发育以及根系缠绕的现象。但是，Ubil::TPSP水稻植株即使过多产生了含量占植物质量0.1％的海藻糖，但在根系外观以及它们的生长方面没有表现出任何变化。因此可以发现，与双子叶植物不同的是，海藻糖在水稻植株中的过表达不会抑制植物的正常生长。
实施例3海藻糖增强了胁迫抗性按实施例1的方式经乙醇和Clorax消毒、并清洗的种子在28℃下于生长室土壤中发芽，其周期为16小时光照/8小时黑暗，然后生长14天，以长成幼苗。对于脱水胁迫处理而言，要将所有植物在28℃、150 的光照条件下风干l小时。对于盐胁迫处理而言，让所述幼苗在0.1％(v/v)的Hyponex(Hyponex，Japan)营养液中生长2天，然后转移到含有9％(w/v)NaCl的新鲜营养液中，在28℃、150 的光照条件下生长2小时。对于冷胁迫处理而言，让所述幼苗在4℃、150 的光照条件下生长6小时。然后，将在各种条件下经过胁迫处理的未转化对照组和转基因测试组在黑暗条件下保持2小时，利用脉冲调制(PAM)荧光仪测量它们的叶绿素荧光水平。叶绿素荧光水平可用所测最小荧光(Fv)对最大荧光(Fm)的比值(Fv/Fm)来表示，其中Fv/Fm比值表示光合体系II的活性，所以它可用作评价植物功能型损伤的测定(参见图4a、4b和4c)。
图4a、4b和4c是表示脱水、盐和冷胁迫处理后的Ubil::TPSP水稻植株中的叶绿素荧光的图。由图4a、4b和4c可以看出，经脱水、盐和冷胁迫处理过的所有水稻植株都表现出一定水平的Fv/Fm比值，它比对照组的高15-19％。因此，可以确定，海藻糖起到提高水稻植株对非生物胁迫的抗性的作用。
按照上面的解释和说明，本发明涉及一种用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，它包括以下步骤利用含有海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的融合基因(TPSP)的重组质粒转化单子叶植物以表达TPSP基因。本发明提高了单子叶植物对各种胁迫的抗性，由此大大有助于改善重要价值农作物的产量和质量。
权利要求
1.一种用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，该方法包括下述步骤，利用含有海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的双功能融合酶基因(TPSP)的重组质粒转化单子叶植物以表达TPSP基因，由此在维持植物正常生长和发育特性的情况下，限制了转化的单子叶植物中海藻糖-6-磷酸酯的积累，促进了海藻糖的积累。
2.根据权利要求1所述的用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，其中TPS基因和TPP基因源自E.coli或酵母。
3.根据权利要求1所述的用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，其中单子叶植物是水稻、小麦、大麦、小麦或玉米。
4.根据权利要求1所述的用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，其中转化按照土壤杆菌介导法来实施。
5.根据权利要求1所述的用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，其中非生物胁迫是脱水胁迫、盐胁迫或冷胁迫。
6.一种用于生产具有抗非生物胁迫得到提高的单子叶植物的方法，它包括利用含有海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因的双功能融合酶基因(TPSP)的重组质粒转化单子叶植物或其祖先以表达TPSP基因的步骤，由此限制了转化的单子叶植物中海藻糖-6-磷酸酯的积累，增强了海藻糖的积累，从而使其在表型生长没有变化的情况下生长。
7.一种用于产生转基因单子叶植物的方法，它包括(a)构建由融合的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因组成的(TPSP)融合基因序列；(b)将所述TSPA融合基因序列转化到受体植物细胞中；以及(c)将所述植物细胞再生为成熟植株，其中所述成熟植株是包括所述(TPSP)融合基因序列的转基因单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因单子叶植物选自水稻、小麦、大麦或玉米组成的单子叶植物组。
9.通过权利要求7的方法生产的转基因单子叶植物。
全文摘要
本发明涉及一种用于提高单子叶植物对非生物胁迫的抗性的方法，该方法包括以下步骤在维持单子叶植物的正常生长和发育特性的情况下，利用含有海藻糖－6－磷酸合成酶(TPS)基因和海藻糖－6－磷酸磷酸酶(TPP)基因的融合基因(TPSP)的重组质粒转化单子叶植物、以表达TPSP基因。本发明能够提高单子叶植物对各种胁迫的抗性，其大大有助于改善重要价值农作物的产量和质量。
文档编号C12N15/29GK1649482SQ02829484
公开日2005年8月3日 申请日期2002年12月20日 优先权日2002年6月20日
发明者金周坤, 南伯熙, 崔良焘, 张仁澈, 崔源彬, 金渊植, 金正昊, 宋尚翼 申请人:绿色基因生物技术公司