单子叶植物启动子及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：单子叶植物启动子及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物启动子，以及所述启动子的制备 方法及用途。
背景技术：
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转 基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效 率表达外源基因的关键。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段 的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动 子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶 脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。单子叶植物基因中常见的启动子 有Ubi 启动子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin 启动子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 启云力子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。其中，Ubi 启云力子以其启云力 效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分 离得到启动子序列，如玉米基因组中的Ubi-I启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素 启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubi. U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄 泛素Ubil-I启动子，大麦泛素Mubl启动子。其中，玉米泛素Ubi-I启动子已经被广泛地应 用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中。水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的 应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型 启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是对邻近科属植物中的基因调控功 能却十分不理想。因此，许多相关研究力图通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功 在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续找到Actin启动子。Actin启动子对基因表达具有强调 控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-I启动子调 控ADHfelcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。 Adh-I启动子对单子叶植物如谷类植物中的水稻、燕麦和大麦，以及对少部分双子叶植物如 烟草等基因的调控功能比CaMV (花椰菜花叶病毒CaMV) 35S启动子提高10-50倍。Adh-I启 动子主要应用于单子叶植物，对大部分双子叶植物基因表达的调控效果却极为有限。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替(CaMV) 35S启动子，可以更有效 地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基 因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替(CaMV) 35S启动子，在转基因烟草 中也取得了很好的表达效果Naomi S S, Ichiro Μ. Constitutive Promoters Availablefor transgene expressioninstead of CaMV35S RNA promoter Arabidopsis promoters oftryptophan synthase protein subunit and phytochrome. Plantbiotechnology,2002, 19(1) :19-26。单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天 南星科等，是非常重要的农作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达 具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子 叶植物中的一些强效启动子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)启动子、番茄E8启动 子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作 用。本发明的发明者们通过对水稻基因组和转录组的深入研究，提供了一种新的单子 叶植物启动子——非共生血红素启动子RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2)，生物信息学 方法预测该启动子能在多种组织，特别是愈伤组织和根组织中高表达，上述启动子能够用 于调控单子叶植物中目的基因表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新 的工具和选择。表1、生物信息学预测RHB2驱动基因表的图式

发明内容
本发明的目的在于提供一种单子叶植物启动子，以调控单子叶植物中目的基因表达。本发明的另一目的在于提供一种含有上述单子叶植物启动子的重组载体。本发明的再一目的在于提供一种含有上述单子叶植物启动子的重组载体的重组 细胞。本发明提供的单子叶植物启动子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中序列表中序列1的具体碱基序列长度为1357个碱基。本发明所述单子叶植物启动子来源于水稻，具体为水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)本发明提供的如序列表中序列1所示的单子叶植物启动子称为非共生血红素启 动子(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))，简称为 RHB2 启动子(RHB2 (N0N-SYMBI0TIC HEMOGLOBIN 2))。本发明提供的单子叶植物启动子——RHB2启动子可以是下述核苷酸序列之一1)与序列表中序列1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；2)对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代或缺失或添 加修饰的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上相似性，且具有相同功能的 核苷酸序列。所述2)的对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代或缺 失或添加修饰的核苷酸序列，包括但不限于分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’ 端，和/或序列内部进行不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不 超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的 取代或缺失或添加修饰的核苷酸序列。所述对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代或缺失或 添加修饰的核苷酸序列，具有与序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活 性。在本发明中，用于确定序列相似性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子 是 BLAST 和 BLAST 2. 0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文献中所述或者默 认参数，BLAST和BLAST 2. 0可以用于确定本发明的核苷酸序列相似性百分数。执行BLAST 分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。在本发明中，所述与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上相似性的核 苷酸序列包括与序列表中序列1所示的核苷酸序列基本同一的多核苷酸序列，且多核苷 酸序列与本发明序列表中序列1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性，优选95%或 96%或97%或98%或99%的同源性，或更高同源性。在本发明中，所述与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核 苷酸序列，具有与序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。本发明提供的一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体，是将上述单 子叶植物启动子——即序列表中序列1所示的核苷酸序列插入到克隆载体或表达载体 而得到的，其中所述克隆载体包括但不限于PMD18-T，pUC9，所述表达载体包括但不限于
5pCambial300, PROMOTER。所述含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体称为pPr0m0ter+RHB2 (RHB2 (N ON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体。本发明提供的一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体的重组细胞，是 将含有上述单子叶植物启动子的重组载体转化至宿主细胞而得到的，所述宿主细胞为大肠 杆菌或者农杆菌。本发明还涉及一种单子叶植物愈伤组织，并且所述愈伤组织转化为本发明所述的
启动子。本发明提供的一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤1)根据序列表中序列1所示的核苷酸序列，设计下列PCR扩增引物对上游引物Fl :CGGGATCCGTTGACTTCGGTGCAGGATGA,其中下划线部分代表BamHl酶切 位点；下游引物Rl :CGAAGCTTGGCTGCTTCGATTTGATTCCT,其中下划线部分代表 HindIII 酶 切位点；2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR引物对进行PCR 扩增。本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计 相应的PCR扩增引物对。本发明还涉及一种调控单子叶植物中目的基因表达的方法，所述方法包括用本发 明所述单子叶植物启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述单子叶植物启动子的重 组细胞。所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体为水稻日本晴愈伤组织。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农 杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。本发明还涉及所述单子叶植物启动子在单子叶植物中调控目的基因表达的应用。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体是水稻日本晴种。为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多 拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。发明具有下列优点和有益效果采用上述方案，找到了新的单子叶植物启动子，用 于调控单子叶植物目的基因表达，同时为研究单子叶植物基因表达提供新的工具和选择， 本发明的发明者们通过生物信息学研究获得单子叶植物启动子，并采用生物学实验验证了 所述启动子RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BTN 2))的功能。所述启动子能够在水稻
6中调控GUS基因表达。能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良水稻的 分子育种研究具有重大意义。


图1为本发明之单子叶植物启动子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))的 PCR扩增检测结果。图2为用于构建pPromoter质粒的pCAMBIA_1301质粒示意图。图3为构建的pPromoter质粒示意图。图4是经转化的水稻愈伤组织的⑶S染色结果。图4中，由带有本发明所述单子叶植物启动子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))序列的重组农杆菌 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))转化的水稻愈伤组织(左)经GUS染色后呈现蓝色，由不带有本发明启动子序列的重组 农杆菌pPromoter质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经⑶S染色后颜色未发生变化。图5是经转化的水稻根组织的⑶S染色结果。 图5中，由带有本发明所述单子叶植物启动子RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))序列的重组农杆菌 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))转化的水稻根组织(右)经GUS染色后呈现蓝色，由不带有本发明启动子序列的重组农 杆菌pPromoter质粒的水稻根组织(对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实 施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内 的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验 指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例A、单子叶植物启动子片段的PCR扩增使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN目录号DP320_02)，根据该启动子 在栽培水稻日本晴变种gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物，即上游引物Fl CGGGATCCAGTTCGCAAGCAAACGGCACGG，其中下划线部分代表 BamHl 酶 切位点；下游引物Rl :AAGCTTGCAGACGACGAGAG,其中下划线部分代表HindIII酶切位点；以自行提取的水稻日本晴变种的gDNA为模板，高保真Ex Taq (TaKaRa,DRR100B) 聚合酶进行PCR扩增，其中扩增的PCR体系见表2 ；表2基因启动子扩增的PCR体系
组成_体积(μ )
基因组DNA 0. 2 dNTPs (2. 5 mM) 2 IOX Ex Buffer (含镁离子) 2.5 引物 Π (50 μ Μ) 1 引物 Rl (50 μ Μ) 1 Ex taq 0. 2 ddH20_补满至总体积25 μ 1PCR扩增程序为94°C预变性5min，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7min ；PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为1357bp的条带(如图1)， 用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209-03)进行纯化回收，即得PCR扩增 产物；B、pMD18-T+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体的构建B1、将上述步骤A得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD 18_T质粒，TaKaRa， D103A)，其中，Τ/Α克隆的连接条件如下Τ/Α 连接体系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I 5μ 1PCR 扩增产物10 20ng，ddH20补齐至 10 μ 1于16°C在PCR仪中连接8h 以上，得到含有RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))启动子的重组载体，即 pMD18-T+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载 体；B2、将上述步骤 Bl 得到的 pMD18-T+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重 组载体按照如下方法转化大肠杆菌从超低温冰箱中取出按照《分子克隆》(第三版)所示氯化钙法制备 的感受态细胞DH5a 100 μ 1，冰上融化后，加入10 μ 1上述步骤Bl所得的含有 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体的连接产物，轻轻搅勻， 冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C预冷的SOC培养基，37 °C 220rpm 复苏45min，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板，37 °C倒置培养16h_24h ；获得含有 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体的重组大肠杆菌，命名为 pMD18-T+RHB2-DH5a ；B3、对步骤 Bl 获得的 pMD18-T+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重组载 体中的 RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))进行测序验证；
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C、pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体的构建Cl、按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号DP103_03)的操 作手册，从上述步骤B2获得的重组大肠杆菌pMD18-T+RHB2-DH5a中，提取 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体，经过常规纯化后，用相 应的限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与 pPromoter质粒用相同的限制性内切酶切后回收的载体大片段进行连接，得连接产物；将 所得连接产物 pPromoter+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体转化《分子 克隆》(第三版)所示氯化钙法制备的感受态细胞，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行 PCR检测和酶切鉴定；其中，pPromoter质粒的构建如下将常规的pCAMBIA-1301 (kan抗性)用Pstl和 Ncol酶切，这一步的目的是将其原有的报告基因GUS前的35S启动子切除，因此酶切后可以 看见大小两条带，小带约lkb，多为原有35S启动子，胶回收较大的条带(大约IOkb以上)， 接头 pPromoter-AD-U (GAAGCTTGCGGCAAC)与 pPromoter-AD-L (CATGGTTGCCGCAAGCTTCTGCA) 退火，具体方法是将其1 1摩尔比混合于水中，放置于1.5ml tube中，将其密封好，置于 1-2L沸水中冷却至室温；加入少量接头，与载体混合，连接过夜，转化，筛选克隆，挑选PCR 阳性结果(用载体通用引物做显示已经成功切除35S启动子的克隆)(参见图3)；所述pPromot er质粒中的多克隆位点和⑶S序列如序列表中序列2所示，筛选转 化子所用的引物 5，-GCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3’ 5’ -GAGTCGTCGGTTCTGTAAC-3，；C2、pPromoter+RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体的构建根据常规的限制性内切酶操作说明，按照下列条件分别对上述步骤Bl所得的 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体，以及步骤 Cl 所构建的 pPromoter 质粒进行酶切，其中，重组载体pMD18_T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))以及pPromoter质粒的酶切条件如下酶切体系50 μ 1无菌水34. 8 μ 110*buffer H5 μ 1EcoRI0. 1 μ 1 (10U)PstI0. 1 μ 1 (IOU)pMD18-T+RHB210 μ 1(< IOOOng)或 pPromoter 质粒 10 μ 1 ( < 1000ng)；按照常规方法，分别回收经酶切的pPromoter质粒以及重组载体 PMD18-T+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))中的启动子 RHB2 片段，根据 T4 连接 酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接连接体系10 μ 110Χ T4buffer1 μ 1pPromoter 质粒1 μ 1 (20ng)启动子片段10 20ng无菌水补齐至9. 5 μ 1T41igase(TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1
T4buffer冰上融化，载体加入量20ng，加入IOng步骤A所得经PCR扩增得到的产 物——RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2)，于16°C在节能型智能恒温槽中连接8h以上， 得到 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))质粒；D、重组农杆菌 EHA105-RHB2(RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))细胞的制备将上述步骤C2 构建的 pPromoter+RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2)) 质粒以及作为对照的PPromoter质粒，分别转化按照(《分子克隆实验指南》，第三版， 科学出版社)所述氯化钙方法制备的农杆菌EHA105的感受态细胞，具体方法如下将 农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，置于冰上解冻，融化后，加入5μ 1质 粒(即 pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))重组载体)，轻轻混勻， 冰浴lOmin，放入液氮中冷冻5min，37°C解冻5min，加入800 μ 1常温的LB液体培养基， 28 0C 160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200 μ 1吹勻，涂布于常规的加有 kan-rif (卡那霉素-利福平)双抗的平板上，28°C倒置培养2_3天，得到含有pPromoter +RHB2 (RHB2 (N0N-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))重组载体的重组农杆菌，命名为重组农杆菌 EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))；同样按相同方法得到含有 pPromoter 质粒的对照重组农杆菌，命名为重组农杆菌EHA105-pPromoter ；E、水稻愈伤组织的诱导和转化按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组农杆菌 EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))和 EHA105-pPromoter 转化所述愈伤 组织1)水稻日本晴变种种子去壳，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5%的次氯 酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于表2所示 的N6D培养基上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培养3 4周，直至长出愈伤组织；2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1 3mm)，在表3所示的N6D培 养基上29. 5°C光照培养3天，得继代培养的愈伤组织；3)分别挑取上述步骤D所构建的重组农杆菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))单菌落和EHA105-pPromoter)，于表6所示的添加有抗生素(50mg/l Kan, 10mg/l Rif)的YM液体培养基上划线培养3天，培养温度28°C ；分别刮取上述重组农杆菌 置于30ml表5所示的添加有30 μ 1 AS的AAM培养基中(0D600 = 0. 05-0. 1)，温和重悬农 杆菌细胞；4)将步骤2)的继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将步骤3)制备的农杆菌 悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min ；5)倒掉农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于表4所示的 N6-AS培养基上放一张灭菌滤纸，加Iml表5所示的含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至 滤纸上，密封培养皿，28°C暗培养48 60h，使愈伤组织受感染；6)将上述受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清 液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死农杆菌细 胞；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/lCarb的表4所示的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29. 5°C光照培养3 4 周，诱导产生愈伤组织；
F、水稻愈伤组织中的⑶S的表达为检测经过步骤E中的6)所转化的水稻愈伤组织中目的基因⑶S的表达情况，通 过常规方法对分别用重组农杆菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))和EHA105-pPromoter转化的水稻愈伤组织进行染色，其中⑶S染色液的配方为 (Iml) 610 μ 1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc ；分别将用重组农杆菌EHA105-RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTICHEM0GL0BIN 2))和 EHA105-pPromoter转化的水稻愈伤组织浸泡在⑶S染色液中，37 V保温至出现蓝色， 拍照记录，结果如图5所示，经含有启动子的pPromoter+RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEM0GL0BIN2))重组载体的重组农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图4左)经染色后呈 现蓝色，经不含有启动子的pPromoter质粒重组农杆菌介导转化的水稻愈伤组织经⑶S染 色后颜色未发生变化(作为对照，如图4右)。结果显示，本发明所述单子叶植物启动子 RHB2 (RHB2 (NON-SYMBIOTIC HEMOGLOBIN 2))对 GUS 基因表达具有调控作用。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。表3N6D培养基
N6Hiacro 母液(20X) Fe2EDTA 贮存液(100X) Nemicro 母液(1000X) N6维生素贮存液(1000X) 肌醇(500X)
2, 4-D 贮存液(lmg/ml) 脯氨酸(Proline) 水解酪蛋白(CH) 庶糖(sucrose) 植物凝胶(Phytagel)
50 ml 10 ml 1 ml
1ml
2ml
2ml
2. 88 g 0. 30 g 30 g
3g
25 ml 5 ml 0. 5 ml 0. 5 ml 1 ml 1 ml 1.44 g 0. 15 g 15 g 1.5 g
100 ml 20 ml 2 ml 2 ml 4 ml 4 ml 5. 76 g 0. 6 g 60 g 6 g(用IN氢氧化钾调节pH值到5. 8，封口后按常规方法灭菌，121°C下灭菌20分钟)表4N6-AS共培养基
11 表5AAM培养基 (加IN氢氧化钾调节pH值至5.2，按常规方法灭菌，121°C下灭菌20分钟)表6YM 液体培养基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif)

权利要求
一种单子叶植物启动子，其特征在于所述单子叶植物启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.如权利要求1所述的单子叶植物启动子，其特征在于所述单子叶植物启动子是下述 核苷酸序列之一A、与序列表中序列1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；B、对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代或缺失或添加修 饰的核苷酸序列；C、与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的核苷 酸序列。
3.一种含有如权利要求1所述的单子叶植物启动子的重组载体，其特征在于是将上 述单子叶植物启动子插入到克隆载体或表达载体而得到的重组载体pPromoter+RHB〗，即 RHB2 (N0N-SYMBI0TICHEM0GL0BI 2)重组载体，其中所述克隆载体包括但不限于pMD18_T， pUC9，所述表达载体包括但不限于pCambial300，pPromoter。
4.一种含有如权利要求3所述重组载体的重组细胞，其特征在于是将含有所述单子叶 植物启动子的重组载体转化至宿主细胞而得到的，所述宿主细胞为大肠杆菌或者农杆菌。
5.如权利要求1所述的单子叶植物启动子在培育单子叶转基因植物中的应用。
6.一种如权利要求1所述的单子叶植物启动子的制备方法，其特征在于包含如下步骤1)根据序列表中序列1所示的核苷酸序列，设计下列PCR扩增引物对上游引物Fl :CGGGATCCAGTTCGCAAGCAAACGGCACGG，其中下划线部分代表BamHl酶切位占.下游引物Rl AAGCTTGGCTGCTTCGATTTGATTCCT，其中下划线部分代表HindIII酶切位占.2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR引物对进行PCR扩
全文摘要
本发明提供一种单子叶植物启动子及其制备方法和用途。该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的启动子可以调控单子叶植物中目的基因表达，尤其能够在水稻中调控GUS基因表达，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良水稻的分子育种研究具有重大意义。
文档编号C12N15/63GK101892229SQ20101021913
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者徐讯, 王文, 董杨 申请人:中国科学院昆明动物研究所