专利名称：用于在单子叶植物中基因表达的重组启动子的制作方法
本申请基于1990年5月18日申请的美国专利申请07/525866。
本发明一般涉及植物分子生物学领域，特别是涉及使基因表达增强的启动子区内的增强子序列及其重组排列。本发明可使得单子叶植物中所需的结构基因的选择表达增强。
研究植物转化过程所必须考虑的最重要因素之一是获得一种在靶细胞中能提供引种基因的可靠的高水平表达的启动子。例如，对于具有编码抗生素抗性标志的DNA转化植物细胞，显然希望获得引种基因的高水平表达以实现转化体的有效选择。况且，在未转化组织，如在卡那霉素(Hauptmann et al.(1988)Plant Physiol.86602-606)上选择的小麦和玉米的胚胎组织，对抗生素表现出一定程度的天然抗性的情况下，一种强型的选择体系对于转化植物的成功生产将是决定性的。
启动子为基因起始处DNA序列的一部份，它含有RNA聚合酶开始转录的信号，以使蛋白质合成能随后进行。其核启动子是复杂的，且含有包括相对于规定为+1的转录起始位点或帽位点的约-75bp5′的TATA盒同感序列的成分(Breathnath and Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50349-383;Messing et al.(1983)in Genetic Engineering of Plants，T.Kosuge，Meredith and Hollaender，(cds.)PP.211～227)。在很多情况下，对于精确的转录起始需要TATA盒。在通常于-80和-100间的上游处，可有一个与同感序列CCAAT同源的启动子元件(Breathnach and Chambon(1981)，见上文)。在植物中，CCAAT盒可被位于距帽位点距离相当的被Messing等人(1983)称作AGGA盒的同感序列所取代。认为在5′未转录区的另外的DNA序列应环境刺激而影响基因表达，如得到光照或营养素或包括热休克、厌氧生活的不利条件，或存在重金属。还有些DNA序列在发育期间，或在组织特异性方式方面控制基因表达。已发现有些DNA序列提高附近基因表达的水平;这样的序列在动植物体系中称作“增强子”。在酵母中，类似的刺激序列是已知的，它们被称为“上游激活序列”，还经常携带调节信息。启动子通常处于相对于相应基因编码区的起始处的5′端或上游，且包含影响调节或转录总水平的所有辅助元件的区段可含有低于100bp或多至1Kbp个碱基对。
被广泛用于植物细胞转化的启动子为那些编码醇脱氢酶，Adh1和Adh2的两种基因。Adh1和Adh2在厌氧生活开始后都被诱导(Freeling(1973)Mol.Gen.Genet.127215～227)。这两种酶中，Adh1在厌氧情况下是最为重要的(Freeling et al.(1973)Biochem.Genet.827-23)。如同Adh2已被克隆和序列分析(Dennis et al.(1985)Nucl.Acids Res.13727～743)，玉米Adh1也被克隆并序列分析(Dennis et al.(1984)Nucl.Acids Res.123983-4000)。来自其它源的Adh1基因最近也被克隆和序列分析(Lle -wellgn et al.(1987)J.Mel.Biol.195115-123)。Howard等人((1987)Planta 170535-540)测验了玉米原生质体中内源Adh1基因和嵌合Adh1基因的表达。Adh1嵌合基因ADH-CAT由连接于氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码序列的Adh1启动子和nopaline合酶(nos)3′信号组成。以电穿孔法引种到玉米原生质体内的ADH-CAT在低氧浓度下的表达比在控制条件下高近四倍。ADH-CAT表达相当于在玉米原生质体中的内源Adh1基因的表达且在细胞培养基中的厌氧反应与在玉米籽苗中的反应定性地相似。Walker等人((1987)Proc。Natl.Acad.Sci.846624-6628)发现了基于一系列体外操作的ADH-CAT嵌合基因系表达的ADH-CAT的厌氧所必需的序列元件。他们指出，在玉米Adh1启动子的-140至-99位置之间有一厌氧调节元件(ARE)，并且ARE由至少两个位于-133至-124和位于-113至-99的序列元件组成，这两个元件都是必要的，且两者一起对ADH-CAT基因活性的低氧表达是充分的。
据进一步报导(Walker等人(1987)，见上文)，玉米的Adh2基因也通过厌氧生活调节且含有Adh1ARE的同源。该同源在ARE的Ⅰ区约为81%以及在Ⅱ区约为69%。此外，来自Arabidopsis和豌豆的Adh基因的5′侧区在10pb的区域上的玉米Adh1ARE同源不多于60%。
花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S启动子(Guilley et al.(1982)Cell30763-773;Odell et al.(1985)，见上文)是在植物转化过程中最频繁使用的启动子之一。这种双子叶植物病毒启动子引导了引种入双子叶和单子叶植物原生质体的基因表达(Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.825824-5828);Nagata et al.(1987)Mol.Gen.Genet.207242-244;Odell et al.(1988)Plant Mol.Biol.10263-273)。在转化的烟草细胞中(Morelli el al.(1985)，in Biotechnology in Plant ScienceRelevance to Agriculture in the Eighties，M.Zaitlin，P.Day.and A.Hollaender，(eds.)，Academic Press，New York，PP.227-236)或转基因矮牵牛植物中(Sander et al.(1987)Nucl.Acids Res.151543-1558)的相对转录本水平的定量测量表明，35S启动子比nos启动子至少强30倍。35S启动子的强度是它广泛用于转基因植物中所要求的区段的高水平基因表达的原因。Fang等人((1989)，The Plant Cell 1141-150)已通过5′、3′和内缺失表明，-343至-46的上游片段可细分为三个官能区，-343至-208，-208至-90和-90至-46。他们指出，当以适当的355启动子序列试验时，前两区加强了转录活性。比较起来，-90至-46区本身几乎没有活性，但它通过提高两个远侧区的转录活性而起辅助作用。
尽管CaMV 35S启动子是一强的启动子，在各种植物包括远于病毒寄主范围之外的植物中引发高水平的RNA生产，而它在农业意义上的禾本科植物，如小麦中具有比较低的活性(Lee et al.(1987)in“Progress in Plant Protoplast Research”，Proceedings of the 7th International Protoplust Symposium，Wageningen.The Netherland，December 6-11，1987，Puite et al.(eds);Hauptmann et al.(1987)Plant Cell Rep.6265-270)。相反地，来自玉米Adh1基因的单子叶植物启动子在双子叶植物烟草(Nicotiana plumbaginifolia)(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16)原生质体中产生非常低的表达。这些观察结果提示，就转录因子和启动子序列的识别而论，单子叶植物和双子叶植物间可能有些差别。
转移基因的表达水平通常可通过加入来自启动子的提高转录水平的增强子元件、顺式作用序列来提高(Banerji et al.(1981)Cell27299-308)。如Khoury和Gruss((1983)Cell 33313-314)所定义，增强子为一组真核启动子元件中的一种，它以相对地不受与附近基因相关的位置和取向制约的方式提高转录效率。在SV40的72bp重复内发现了原型增强子。它处在距转录起始位点多于100bp的上游，且有GTGGAAA(或TTT)G同感序列。作为一种惯例，动物或动物病毒增强子可在多达1Kbp 5′的距离范围内，在任何取向而起作用，并可或在5′或在3′至该基因的区间起作用。序列主题往往要重复多次。增强子已用在动物病毒体系中以用弱启动子研究基因(Lee et al.(1981)Nature 294228-232;Huang et al.(1981)Cell27245-255)。已有些源于植物基因的序列被认为与动物增强子同感核序列同源。Odell等人(1985)Nature 313810-812)已表明，-105至-46间的序列对CaMV 35S启动子的最高表达是必要的。该区内所含的是与动物增强子核同感序列部份同源的序列。Bouchez等人((1989)EMBO.J.84197-4204)进一步指出，35S启动子的-89至-59的31bp片段含有对玉米和烟草核中核内蛋白因子的束缚位点(Singh et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.863733-3737)且该片段对启动子的最大活性是必要的。目前在玄参花叶病毒(FMV)、麝香石竹蚀刻环病毒(CERV)和来自Ri和Ti质粒的7个T-DNA认为(Opine)合酶基因的上游区已发现类似的增强子序列。
Ellis等人(1987)EMBO J.611-16)指出，Adh1启动子上游序列位于-1094至-140的缺失产生在烟草转移基因中只有极低表达的Adh1基因构建。然而，当由在双子叶植物中表达的两个基因(章鱼碱合酶(OCS)和CaMV35S基因)衍生得到的且具有增强子型性能的序列位于玉米Adh1启动子区上游时，则易于检测其活性。它指出，玉米Adh1基因转译起始密码子序列上游的前247bp对转移基因烟草中的杂种基因提供厌氧调节和精确的转录起始。还进一步指出(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)，由OCS启动子上游区衍生的176bp DNA序列在Zea Mays(一种单子叶植物)和Nicotiana plumbaginifolia(一种双子叶植物)的原生质体中起一增强子的作用。据报道，这种176OCS序列在两个取向都起作用，但发现其增强活性依赖于它距Adh1启动子的距离，并还由序列为ACGTAAGCGCTTACGT的16bp回文的存在而产生。
其它的研究(Kay et al.(1987)Science 2361299-1302)报道了在转基因烟草植物中采用含260bpCaMV35S上游序列复制区的CaMV35S启动子可得到高出10倍的转录活性。据报道，该复制区还具有异源启动子的强增强子的作用，将相邻和趋异的转录转移DNA基因活性提高数百倍。
Ow(et al.(1987)Proc.Natl.Acad.SCi.844870-4874)还报道，当自然的35S启动子相比，35S启动子远区的多体(位于-148和-89之间)能将35S启动子核活化到更高的表达水平。Fang等人(1989)见上文)进一步指出，上游35S启动子片段(-209至-46)的单体和多体可作为增强子以强化来自异源启动子的转录。在这些研究中，将35S启动子位于-209至-46间上游区的8个复拷贝克隆到rbcS-3A(双磷酸核酮糖羧基酶的小亚基)基因的-50位;与采用rbcS-3A上游区所得结果(Fang等人(1989)，见上文)相比，该八聚物将rbcS-3A转录本提高到更高水平。
从诸如病毒或细菌的基因组中获得的增强子在植物中强化所需基因表达方面显示了一定的作用。在这一情况下，通过将来自Agrobacterium tumefaciens的章鱼碱合酶(OCS)增强子加到玉米Adh1启动子中而使启动子的种特异性改变(Eills et al.(1987)EMBO J.611-16)。加入OCS增强子之后，该玉米Adh1启动子能够在转基因烟草植物中表现出强烈的厌氧诱导表达。在另一情况下，报道了当将OCS增强子置于直接与ARE相邻处时，该OCS-ARE构建在玉米原生质体中显示最高表达，且CAT表达不再因厌氧刺激而提高(Peacock et al.(1987)in Plant Gene Systems and Their Biology，Alan R.Liss，Inc.PP.263-277)。另据报道(Callis et al.(1987)Genes and Dev.11183-1200)，未转译先导区中Adh1启动子的玉米Adh1 Intron1下游的内含物表明，由于引种到玉米原生质体中的氯霉素乙酰转移酶(CAT)标志基因，使得表达提高十倍。
本发明的首要目的是提供一种重组启动子分子，它能够使本领域普通技术人员在靶细胞中获得引种基因的可靠的高水平表达。这一目的是通过利用来自植物可表达基因的5′未转录区的增强子序列的结合而实现的。在较佳的实施方案中，增强子序列由玉米醇脱氢酶1(Adh1)基因和章鱼碱合酶基因衍生得到，且最佳为含有多个或结合的增强子元件，如含有厌氧调节元件(ARE)、章鱼碱合酶元件(OCS)和来自Adh1基因的Intron1。
本发明的另一目的是提供一改进的启动子构建，与采用花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子所得结果相比，它使单子叶植物悬浮细胞原生质体中的引种标志基因的表达提高10～50倍。较佳的是，本发明的重组启动子分子含有彼此间或间隔或相邻而组在一起的多个ARE拷贝和彼此间或间隔或相邻而组在一起的多个OCS元件拷贝。更佳的是，ARE元件置于5′至OCS元件之间以及ARE和OCS元件置于5′至TATA盒区之间。在一示例方案中，用于单子叶植物的改进的启动子构建含有玉米Adh1基因的6个ARE衔接重复拷贝、来自Agrobacterium tumefaciens(OCS)章鱼碱合酶基因的OCS元件的4个衔接重复拷贝、来自植物可表达启动子的TATA盒区、一个为植物可表达基因未转译先导区的一部份的内含子〔如玉米Adh1基因的Intron1(未转译先导区的一部份，从核苷酸-119至+672)〕、一个植物可表达的结构基因〔如大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(GUS)〕以及一个植物可表达终止信号(如来自Agrobacterium tumefaciens的nopaline合酶基因的nos终止区)。
本发明的再一目的是提供一改进的启动子构建，它在单子叶植物细胞中优于CaMV 355启动子使标志基因的表达增强，如在大麦中约增强16倍;且在双子叶植物原生质体中与CaMV 355启动子相比，使标志基因表达增加7-10倍。较佳的是，该重组启动子分子含有彼此间隔或相邻定位的多个OCS元件拷贝。在一实施方案中，这种改进的启动子构建含有4个衔接重复的OCS拷贝、一个来自植物可表达启动子〔如截短的CaMV △35S启动子(缺失到核苷酸-90)〕的TATA盒区、一个为植物可表达基因未转译先导区一部份的内含子(如来自玉米Adh1基因的Intron1)、一个植物可表达结构基因(如GUS编码区)以及一个植物可表达终止信号(如来自Agrobacterium tumefaciens nopaline合酶基因的nos终止区)。
使转化植物细胞的有效选择体系得以发育也是本发明的一个目的。这一改进的选择体系基于在转基因组织中结构基因表达的可靠的增强上。例如，本发明提供的重组启动子构建，当被连接到抗生素抗性基因上时，对导致转化期选择的抗生素抗性水平的提高是有效的。
本发明的又一目的是提供一用来显示植物中高水平组织特异性表达的重组启动子构建。在一实施方案中，本发明的p40CS△35SIGN构建对叶子特异性表达显示出优良的效力。
本发明还提供一种在单子叶植物细胞中获得所要求基因高水平表达的方法。如本领域普通技术人员所公知，这类要求的植物可表达基因包括Bacillus thuringiensis结晶毒素蛋白质基因、甘草膦抗性基因、变异种子贮藏蛋白质基因等等。本方法包括构建重组启动子分子，在一实施方案中，该构建含有位于5′至带有TATA盒区的植物可表达截短的启动子间的多个AREs和/或多个OCS元件，并在其3′方向可选择地跟随玉米Adh1基因Intron1、一植物可表达结构基因(如GUS基因)和来自Agrobacterium tumefaciens nopaline合酶基因的nos终止区。在一较佳方案中，在构建启动子构建的过程中采用了6个ARE拷贝和4个OCS拷贝。
本发明的还一个目的是提供一种再现关于基因表达调节的诱导基因组成的方法，在本发明的一个实施方案中，将通常应厌氧生活而发生作用的Adh 1启动子设计为带有增强子元件并能以某一组成方式表现出高水平基因表达。
重组启动子分子构建是采用如上所述的植物增强子片段以常规技术制成。进一步讲，这类DNA分子的构建可以采用来自在此描述的已知基因的特异性序列或采用来自表现出可使置于调节控制下的异源基因表达增强的其它来源的功能相当序列，如780T-DNA增强子。可采用其它的截短的植物可表达启动子代替截短的Adh1启动子和截短的CaMV△35S启动子以提供这些构建中必需的TATA盒序列。任何植物可表达结构基因都可用于这些构建中。
构建之后，将含有在此所述的改进的启动子分子的重组DNA表达体系引种到植物组织中以使增强子元件/截短的启动子/结构基因的结合体在所需的植物组织中，较佳的为在单子叶植物组织中以高水平表达。采用异种DNA使植物细胞和组织的转化可用本领域公知的多种方式完成。在一实施方案中，采用了电穿孔技术。
本发明方法一般可用于单子叶和双子叶两种植物中结构基因的表达。采用为单子叶植物构建的启动子的这一方法特别适用于禾本科(Graminaceae)，尤其适用于玉米和小麦。
本发明的其它目的在于含有于此所述的重组启动子分子的植物、植物细胞和植物组织。另外一些目的在于含有所述重组启动子分子的载体和表达盒以及含有这类适于维持、复制和植物转化的载体的细菌细胞。
图1为用于不同重组启动子分子构建的DNA结合体示意图。(a)用于测定启动子区×的启动子活性的一般性质粒。(b)不同构建中启动子区×的结构。(c)△ADH启动子已标出TATA盒和转录起始位点。在此没有转录起始位点下游的ATG转译起始。(d)△35S启动子已标出TATA盒和OCS元件。(e)6ARE元件已标出每个ARE(在玉米Adh1基因中的-140至-99位置)的RegionⅠ和RegionⅡ。该元件由一个自然取向的ARE和在其之前的五个反取向ARE构成。(f)4OCS元件该元件含有四个来自OCS基因的-211至-172区的40bp直接重复。在(c)至(f)中所有碱基对编号指的是在产生该构建的基因序列中碱基对的天然位置。
为了免除其用于说明书和权利要求书中意义和范围上的含混，作出如下定义。
表达是指结构基因的转录或转译以使蛋白质合成。
启动子表示在结构基因5′端的引导转录开始的序列。启动子序列用来引发下游基因的表达是必要的，但并非总是充分的。真核启动子通常含有与同感序列5′-TATAAT-3′(TATA盒)同源的约10-35bp5′至转录起始(帽)位点(习惯以+1编号)的序列;3′至帽位点的碱基对给以正数编号而5′至帽位点的碱基对给以负数编号，该编号反映了其距帽位点的距离。约30-70bp5′至TATA盒间常常有另一个同源于典型形式5′-CCAAT-3′(R.Breathnach and P.Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50349-383)的启动子成分。在植物中CCAAT“盒”有时被AGGA“盒”(Messing et al.(1983)in Genetic Engineering of Plants，T.Kosuge et al.(eds)，Plenum Press，PP.211-227)替代。可以发现，响应于环境信号或转录最大效率的其它可给出组织特异性的序列也散布着这些启动子元件，或发现其至5′方向距帽位点更远。这样的序列常常发现于距帽位点400bp以内，但也可能延伸远至100bp或更远。
截短的启动子表示含有引发转录所需的近端序列但除增强子序列而外的TATA盒区。本发明中希望截短的启动子所含的区位于距帽位点(+1)约200bp5′和约200bp3′之间，更佳的是该区位于距帽位点约100bp5′和约110bp3′之间。
ADH一般指植物可表达醇脱氢酶基因，且特别是指来自玉米的醇脱氢酶基因。
Adh1启动子指跨越玉米醇脱氢酶基因1中核苷酸位置约-1094至约-106区间的DNA片段，或表示功能相当的一个同源片段。该序列是按Ellis等人(1987)上文)出版的校正法将帽位点定为+1而编号的。
前面有△符号的启动子(如对Adh启动子为△ADH或对35S启动子为△35S)指文中所定义的截短的启动子。
△ADH一般指能提供引发转录所必需的TATA盒序列的截短的植物可表达Adh启动子，特别是指来自玉米Adh1基因的跨越约自核苷酸-100至核苷酸+106的DNA区的截短的Adh1启动子(如Ellis等人(1987)见上文所述)，或指功能相当的同源片段。
△35S一般指能提供引发转录所必需的TATA盒序列的截短的植物可表达CaMV启动子，特别是指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的跨越约自核苷酸-90至核苷酸+3的DNA区的截短的35S启动子，或指功能相当的同源片段。在CaMV35S启动子中的核苷酸约-90至-45区间含有一个OCS元件(Bouchez et al.(1989)，见上文)。
ARE或ARE元件指如Walker等人((1987)上文)所定义的厌氧调节元件，或指功能相当的同源片段。来自玉米Adh 1基因的ARE片段跨越核苷酸位置-140至-99间的DNA区。该ARE由至少两个位于-133至-124和位于-113至-99的序列元件组成，两者对Adh -CAT基因表达(Walker et al。(1987)见上文)的低氧表达是必要的而它们一起是充分的。区Ⅰ和区Ⅱ的DNA序列必须含有5′-GGTTT-3′，且大多须含有5′-TGGTTT-3′。在本发明中，希望ARE只含区Ⅰ而不含区Ⅱ。此外，希望起作用的植物ARE元件来自不同来源的厌氧诱导基因，这包括但不限于来自用于玉米Adh1和Adh2和玉米醛缩酶的基因上游区的序列。
OCS或OCS元件指章鱼碱合酶基因的176bp的OCS增强子片段(跨越核苷酸位置-292至-116)，该基因用于增强转基因烟草中玉米Adh1启动子的表达(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16 and(1987)EMBO J.63203-3208)，或指功能相当的同源片段。该OCS含有16bp回文序列5′-ACGTAAGCGCTTACGT-3′的OCS元件，它是OCS增强子的基本成分。该OCS元件出现于来自Agrobacterium tumefaciens的章鱼碱合酶基因中核苷酸-193至-178之间。现已证实在其它来源中存在与OCS元件同源和功能相当的序列(Bouchez et al.(1989)见上文)。希望在本发明中采用的OCS元件也含有与Ellis(et al.(1987)EMBO J.63202-3208)的OCS元件至少约50%同源和功能相当的来自其它来源的序列(Bouchez et al.(1989)见上文)。
在启动子增强子元件设计中的I代表内含子(Intron)。
内含子一般指植物可表达基因中位于转录起始位点和转译起始位点之间的作为内含子而天然发现的核苷酸序列。专用于本文实例中的内含子为来自玉米Adh1基因Intron1的跨越核苷酸119至672(核苷酸按Dennis et al.(1984)Nucl.Acids Res.123983-4000所述编序)的一个557bp的片段，或为功能相当的同源片段。
Emu或Emu盒指由“6ARE4OCS△ADH1”构建组成的表达盒。
pEmuGN为p6ARE4OCS△ADHIGN构建的缩写。
G指大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因。
N指来自nopaline合酶基因的转录终止信号序列。
高水平表达指在相同植物系统中与在CaMV35S启动子控制下所得结果相比，于单子叶植物中在本发明的重组启动子控制下的所要求基因的表达至少提高约10-50倍。
调节控制一般指由DNA序列元件，特别是由那些位于(5′至)转录起始位点上游的DNA序列元件诱导的基因表达调节。调节可模拟成一响应环境条件的离合开关，或调节可导致基因表达水平的变化。例如，厌氧调节元件以这样一种方式起作用，它使得下游基因表达仅在厌氧环境条件下产生。实验性厌氧生活系指植物组织、培养细胞或原生质体处于含有5%氧/95%氮的气氛中。
在启动子或调节序列元件的调节控制下置放结构基因是指将该结构基因定位以使该基因的表达受控于这些序列。启动子通常位于5′上游至它所控制的基因之间。在异源启动子/结构基因的组合体的构建中，通常优选地将启动子定位于距基因转录开始位点的约与启动子和基因间的距离相同处，该基因控制启动子在其中的天然位置，即该启动子由该基因衍生得到的。如本领域所公知，这一距离的某种变化是可调节的而不会损失启动子的功能。类似地，调节序列元件相对于异源基因(置于调节序列元件的控制下)的较佳定位，由该元件在其天然位置的定位而确定，即该调节元件是由该基因衍生得到的。再次指出，如本领域所公知及本文中调节元件的多个拷贝所示，该距离可以发生某些变动。
结构基因为含有编码为蛋白质、多肽或其一部份的DNA小片段的部份基因。该术语可指天然存在于细胞之中的结构基因的拷贝，但不指人工引种的，或可以编码为蛋白质但通常在该基因所引入的植物细胞中不存在的结构基因，在后一种情况下称之为异源基因。异源结构基因可全部或部分地由细菌的基因组或游离基因、真核的基因组DNA或质体DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成DNA衍生得到。允许结构基因在或编码区或未转译区含有一个或多变异，这将影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达控制的方式。这类变异包括但不限于突变、插入、缺失以及一个或多个核苷酸的取代。该结构基因可构成一连续的编码序列或可包括一个或多个以适宜的植物机能性交接点为界的内含子。该结构基因可为来自天然存在或合成的多种来源的小片段组合体。只要实验性操作在编码序列的连续处维持官能度，该结构基因还可编码融合蛋白质。
结构基因、增强子或调节序列、或其它序列的同源体在此为功能相当的同源序列，且在此至少有50%同源。这类序列可由本领域技术人员利用核酸在本领域公知的(如Hames and Higgins(eds)(1985)Nucleic Acid Hybridisation，IRL Press，Oxford，UK中所述)适当的严格条件下的杂交能力加以证实。应当明确，在本发明中所使用或公开的序列或片段内可以有少数序列变化。这些变化可借助标准技术手段确定以使本领域普通技术人员能够对调节元件、引发转录起始所需的启动子元件和随后附有植物可表达转录终点(也可是聚腺苷酸化)信号的结构基因等的功能性单元进行操作并加以使用。
例如，OCS元件首先是作为OCS基因启动子中的增强子元件而分离的，它在该基因内被证实为-16bp回文序列(Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16)。OCS元件的转录增强活性在体外与转录因子的结合有关。OCS元件还被证实存在于包括在认为(opien)合酶中的六种其它T-DNA基因启动子区内和三种包括CaMV35S启动子的植物病毒启动子中(Bouchez et al.(1989)见上文)。这些元件显示了在体外对OCS转录因子的约束和植物细胞中转录的强化。比较这十个元件(表现出与首先于OCS基因中证实的OCS元件至少同源50%)的20bp核苷酸序列，确定了20bp同感序列TGACG(T/C)AAG(C/G)(G/A)(A/C)T(G/T)ACG(T/C)(A/C)(A/C)，在其中心含有16bp回文。在本发明中可以予料该OCS元件通过其中的上述由Bouchez等人((1989)见上文)证实的10种增强子元件中任一种以及与在OCS基因(如Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16中所述)中首先证实的OCS元件50%同源的同感序列和核苷酸序列来举例说明。在本发明中还可予料，显示出与玉米Adh 1基因中首先论述的ARE元件至少同源50%的DNA片段表现出了相当于ARE元件的功能并可用于在重组启动子构建中代替ARE元件。
植物组织包括分化型和未分化型植物组织，它包括但不限于根茎、叶、花粉、种子、瘤组织以及培养细胞的各种形式，如单细胞、原生质体、胚胎和愈创组织。该植物组织可存在于植物中或在器官、组织或细胞培养基中。
在调节元件和一下游启动子控制下表达结构基因的遗传变异植物组织的生产是将本文所作的论述与本领域公知的各种技术和方法相结合来进行的。在大多数情况下，整个过程中每一阶段采用的方法不同。方法的选择取决于变量，诸如用于克隆和引种重组DNA分子所选择质粒载体体系分子、需变异的植物种类、某具体的结构基因、所用的启动子元件和调节元件。本领域技术人员能够选择和采用适当的变换来达到官能度。在培养细胞中用于表达所要求结构基因的培养条件是本领域所公知的。本领域还公知，一些单子叶植物和双子叶植物的物种都是可转化的和再生的，这样，便可获得在本发明启动子分子调节控制下含有和表达所要求基因的全部植物。如本领域技术人员所知，转化植物中的表达可以是组织特异性的和/或特异于特定发育阶段。截短的启动子和结构基因的选择为实现所要求植物表达最佳化的参量，这都是本领域技术人员公知的，也是本文所讲述的。
本发明部分地基于本申请人的发现，即用截短到-45位置的CaMV△35S启动子从-35至+106位置来置换部分的玉米Adh 1启动子时，产生了杂种启动子，当在玉米原生质体中测定时，该杂种启动子保留了亲代基因的厌氧调节。但是，如果使用截短到-90的CaMV△35S启动子替代，则表达就重新组成。在该CaMV△35S启动子中的-90和-45之间区域表现为含有OCS元件(Bouchez et al.(1989)，见上文)还含有最早发现于OCS增强子片段中的含16bp回文的同感序列(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)。所以，来自CaMV△35S启动子或OCS基因片段的OCS元件同玉米Adh1启动子上游区的偶合产生一在玉米细胞中本质表达的构建。
另外还发现，在由Adh1启动子引发的CAT基因的增强表达中，四个衔接重复的OCS元件(4OCS)的排列比单一的OCS元件具有更强的活性。类似地，用6个衔接重复的ARE在玉米Adh1启动子中代替单个ARE，在厌氧条件下，其产生的表达增加十一倍。
在本发明中，制备了一些DNA构建，以使植物细胞中结构基因得以高水平表达。构建一系列的基于截短的玉米Adh1启动子(跨越核苷酸-100至+106，Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)或者截短的35S启动子(跨越核苷酸-90至+3)的启动子(见附图1)。将各种不同的OCS元件与AREs的结合体加入到上游以期制得高表达的启动子。另外，在某些构建中，将含有玉米Adh1启动子的Intron1的片段插入该启动子和结构基因之间。
在一种双子叶植物和四种单子叶植物细胞系的原生质体中，通过对报道基因产生的测定，确定了重组启动子的相对强度，如GUS酶活性，测定方法是通过用电穿孔方法测定将DNA构建引入上述植物原生质体中44～48小时之后报道基因的产生。列于表1的结果通过将p35SGN的值设为1.0而进行了标准化。该标准化降低了在不同的制备原生质体的实验中所产生的观察误差。所示的这些数值为至少5个多至8个使用取自至少三种不同分离法的原生质体的重复实验的平均值。使用p35SGN、p40CS△35SIGN和p6ARE4OCS△ADHIGN产生的GUS的比活性范围列于表2。尽管在多数情况下，重复实验间的GUS比活性值是显著变化的，但在每一植物种的重复实验间，其排列顺序通常是相同的。相对表达水平并不取决于所需结构基因的选择。需强调的是，在本研究中所用的标准条件使用相对低含量的DNA(1.2μg/105原生质体)。已经发现，在不同构建中，DNA的浓度在GUS酶的活性方面产生最明显不同的响应。当DNA浓度增加时，对某些低效的构建可观察到较高的GUS活性。
如表1所示，在所有试验的单子叶植物细胞系中，如玉米、小麦、单粒小麦(Triticum monococcum)毒麦(Lolium multiflorum)和水稻，该CaMV△35S启动子表现为弱表达;该标志的GUS基因表达与对“减少的启动子”(“promoterLess”)构建pGN和pIGN的记录相当。通常，在单子叶植物中，基于截短的Adh1启动子的构建的表达比其基于截短的CaMV△35S启动子更高。在存在玉米Adh1 Intron1时，通过在其中将6个ARE元件联接到玉米Adh1启动子上的构建，在单子叶植物的细胞系中会产生恒定的高水平表达。该p6ARE4OCS△ADHIGN构建，其包括附加的4个OCS元件的拷贝，在所有单子叶植物细胞系中表现出最高的表达。在单子叶植物悬浮细胞原生质体中，这种质粒比CaMV△35S启动子在GUS表达方面增加10至50倍。采用这种构建所得的高表达很可能由几种因素造成。使用取自玉米Adh 1基因的单子叶植物TATA盒无疑会产生正作用。在这种构建中取自玉米Adh1基因的未转译先导区长(106碱基)，这也是很重要的因素，因在很多体系中，源于玉米Adh1基因中超出+80位置的3′末端的先导区缺失将表现为消除表达。通常在单子叶植物细胞系中基于△ADH的构建比基于△35S的更好。相反，在双子叶植物(Nicotiana plumbaginifolia)细胞系中，△35S-基启动子优于△ADH-基启动子。玉米Adh1 Intron1的内含物增加以p6ARE△ADHIGN和p6ARE4OCS△ADHIGN的表达，但在CaMV△35S启动子-基构建中观察到无效的内含子。在“减少的启动子”构建的情况下，可观察到对无DNA存在的电穿孔原生质体来说，pGN没有产生高出基底的可测量的GUS表达。然而，包括玉米Adh 1 Intron 1的pIGN产生一低的可测量的GUS活性。
有助于从p6ARE4OCS△ADHIGN获得的高水平表达的另一重要因素是OCS元件和AREs的多拷贝的存在。该OCS元件是一强型增强子，在双子叶和单子叶植物中都起作用(Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208)，并且在玉米原生质体中测定时，加入另外5个ARE拷贝增加由玉米Adh 1启动子的表达。GUS标志基因可用其它植物可表达结构基因的编码区代替。因此，在培养的单子叶植物细胞中需要高水平基因表达时，该｀6ARE4OCS△ADHI′盒是有用的。该｀6ARE4OCS△ADHI′盒已编码命名为｀Emu′盒，并且相应地，该p6ARE4OCS△ADHIGN构建缩写为pEmu GN。
本发明者已表明，该p6ARE4OCS△ADHIGN质粒在玉米中为可厌氧诱导的。厌氧诱导的细胞比需氧生长的细胞增加十倍的表达。本发明的pEmuGN构建比p6ARE△ADHIGN产生更高水平的表达，如表2所示。这提示，将OCS元件加入启动子构建中，甚至在厌氧条件下可获得相当于厌氧诱导水平的表达水平。这种提示可进一步描述。使用小麦(L1)原生质体测定了pEmuGN、p6ARE△ADHIGN和p6ARE△35SIGN的厌氧诱导能力。将一些试样在25℃于空气中振荡培养(需氧)，而另一些试样(称为“厌氧诱导的”)置于5%O2/95%N2气氛下并于25℃下在其培育期内振荡(44-48小时)。如表3所示，在小麦(L1)原生质体中，p6ARE△ADHIGN厌氧诱导约3倍。另一方面，在厌氧和需氧两种条件下，pEmuGN产生相当的表达水平，并且高于由p6ARE△ADHIGN全部诱导的表达。所以，将4OCS元件加入到p6ARE△ADHIGN中补偿了厌氧诱导的需要。p6ARE△ADHIGN的类似物，将其中的△ADH用△35S代替(p6ARE△35SIGN)不能产生对其厌氧诱导能力有任何意义的足够高水平的表达。
由列于表1的结果表明，在Nicotiana plumbaginifolia原生质体中，将4OCS元件加入到截短的启动子△35SIGN构建中会大大增加其表达。这种构建中的启动子可用于需要高基因表达水平的双子叶植物中。在这种和其它高表达的构建中存在玉米Adh 1 Intron 1，表明在烟草属(Nicotiana)中发生了玉玉米内含子的完好连接。不具有内含子的p4OCS△35SIGN的形式(p4OCS△35SGN)产生相似的高表达水平，这表明对在烟草属(Nicotiana)中的高水平表达并不需要存在内含子。基于截短的Adh 1启动子的构建在烟草属中几乎不产生或根本不产生表达，除非是在含4OCS元件的pEmuGN存在情况下，且它产生的表达水平与由35S启动子所产生的相似。
在不同的细胞系中观察到特定构建的相对性能间的差异。在小麦、单粒小麦和水稻中，构建pEmuGN比p6ARE△ADHIGN的表达增加2倍，但在玉米中这一比例为5倍，而在毒麦(Lolium multiflorum)中为16倍，这一数值与在Nicotiana plumbaginifolia中所得到的很相近(17倍)。也已发现在Nicotiana中产生最高表达的构建(p4OCS△35SIGN)在Lolium中也具有相对高的表达(用pEmuGN获得表达的44%)，然而对于小麦其相应值低于1%。这些差别大概反映出在不同的细胞系中其转录因子的补体不同。在这一方面，毒麦(Lolium)细胞系可能位于小麦和烟草属(Nicotiana)细胞系之间的某处。
在叶组织中，例如在大麦(Hordeum vulgare)叶肉原生质体中，还试验了不同启动子构建的相对强度。如表2所示，大麦叶肉原生质体与其它细胞系相比需要稍不同的电穿孔条件。为此原因，尽管这一点是很清楚的，即由不同的启动子产生的相对表达水平显著不同于在确立细胞系中所观察的，也不将由大麦获得的绝对值与由其它细胞系获得的绝对值进行严格的比较。构建pEmuGN不产生表达。能产生显著高于背底的表达水平的唯一构建是p4OCS△35SIGN。该构建在大麦叶肉原生质体中产生的高表达水平可与在悬浮细胞原生质体中用pEmuGN所观察到的相比较。这种结果示意，在单子叶植物叶肉组织中pEmuGN将不会有高的表达。在玉米中，在其叶组织中Adh 1基因未表达，示意其叶子不含有所必需的转录因子。
借助本领域技术人员已知的各种方法，可以将调节元件在调节控制下携带所需结构基因的重组DNA分子引种到植物组织中。用于产生植物物种或植物组织的特异类型的技术依赖于已知的成功的技术。将重组DNA引种到植物组织中的方法包括，但不限于，转化(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.32717-2722)、电穿孔(Fromm et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA825824-5828)或DNA的显微注射(Crossway et al.(1986)Mol.Gen.Genet.202179-185)或从土壤杆菌属(Agrobacterium)将间型的T-DNA(T-DNA-mediated)移植到植物组织中。典型的T-DNA载体体系在如下参考文献中有公开An et al.(1985)EMBO J.4277-284;Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303209-213;Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.2987-995;Herrera-Estrella et al.1985 in Plant Genetic Engineering，Cambridge University Press，New York，PP.63-93。一但引种到植物组织中，则可在过渡表达体系中测定结构基因的表达，或者也可在植物基因组中选定稳定整合后测量。在体外培育植物组织的技术是已知的，在一些情况下，再生成完整植物的技术也是已知的。将引种基因从原始转化的植物中移植到商用栽培品种中的方法是现有技术中已知的。
除非另有说明，对于克隆、DNA分离、扩增和纯化，对于酶的反应包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶及其类似物的标准技术;PRC技术以及各种分离技术都是本技术领域内已知的和常用的现有技术。一些标准技术公开在如下文献中Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning，Cold，Spring Earbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York;Wu(ed.)(1979)Meth.Enzymol.68;Wu et al.1983 Meth.Enzymol.100 and 101;Grossman and Moldave(eds.)(1980)Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York;Old and Primrose(1981)Principles of Gene Manipulation.University of California Press，Berkeley;Schleif and Wensink(1982)Practical Method in Molecular Biology;Glover(ed.)(1985)DNA Cloning Vol Ⅰ and Ⅱ，IRL Press，Oxford，UK;Hames and Higgins(edS.)(1985)Nucleic Acid Hybridisation，IRL Press，Oxford，UK;Setlow and Hollaender(1979)Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York。文中所用的缩写及命文法也是本专业领域中标准的和专业文献(如文中所引用的)中常用的。
在本技术领域中，对于并不损坏改进的基因表达的增强活性而作出的文中所公开的重组启动子分子的结构排列特异增强子以及启动子元件的各种改变都是可以理解的。例如，可以理解在植物可表达的增强子和启动子元件的选择中进行替代而对本发明的重组启动子分子的功能没有明显影响，进一步可预料的是，可以便利地使用与文中所用的活性增强子元件同源的核苷酸序列，或者替代或者加入到重组启动子构建中以改进植物细胞中基因表达。
本申请已经表明在植物种(包括单子叶和双子叶植物)中，使用多种增强子元件与截短的启动子结合可获得高水平的基因表达。利用本文所公开的技术，例如本文表中提供的指示，在任一特定的物种中选择适于最佳表达的元件是本专业的常规技术。还应理解，由不同增强子元件以及彼此相关的，且与TATA盒位置相关的某一元件的多拷贝的排列，取向和间隔也可造成最佳的基因表达。这点对于那些使用本文公开的技术的本领域普通技术人员来说是很显然的。
使用本文公开的方法和技术的公知的变换的、修改的或等同的方法和技术，而不用进行过多的实验即可获得本发明的目的，这对于本领域的普通技术人员来说是可以理解的。不同于具体公开的其它替代方法在本领域内可用于获得文中所公开的重组启动子分子的功能特性，以及如何使用这些替代方法以获得本发明的重组启动子的等同功能，这些对于普通技术人员也是可理解的。本发明包括由普通技术人员所理解的那些变换、修改、替代和等同形式，并由本发明公开的精神和范围所包括。
下面的实施例仅用于理解本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 含有杂种启动子的质粒构建依照Maniatis et al.(1982)Molecular Cloninga Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，使用标准的分子生物技术。本领域普通技术人员通过使用本领域里易得到的原料依照本说明书的方法而不需做过多的实验即可制备本发明所使用的所有质粒。
(a)p35SGN、p35SIGN、pGN和pIGN构建通过将来自含有CaMV△35S启动子的pBI121的800bp Hin dIII/EcoR1片段连接到pUC118中而衍生得到质粒p35SGN(Vieira and Messing(1987)Methods Enzymol.1533-11)，该CaMV△35S启动子驱动连接到NOS3′-末端信号的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因(Jefferson et al.(1987)EMBO J.63901-3907)。为构建p35SIGN，用大肠杆菌(Escherichia coli)DNA聚合酶的Klenow片段将557bp的片段末端充填并克隆至pBI121中的Sma1位点，该557bp的片段源于跨越核苷酸119(Bcl1)至672(Bal 31-缺失)的玉米Adh1基因的Intron1。p35SIGN中的CaMV△35S启动子、Intron1、GUS基因和nos3′-末端信号作为单个的HindIII-EcoR1片段亚克隆至pUC118中。
为制备减少型启动子控制的质粒pIGN，将p35SIGN(Bam H1-Eco R1)中的内含子1-GUS-NOS-片段克隆至pUC118。通过用来自p35SGN的BamH1/SacI｀GUS′片段置换含有玉米Adh1内含子1和GUS的BamH1/SacI片段，由pIGN衍生得到质粒pGN。
(b)p△35SGN和p△35SIGN构建通过加入来自p△35S(-90)的Sal1/BamH1｀△35S′片段，由pGN和pIGN衍生得到质粒p△35SGN和p△35SIGN。亲代质粒p35SCN和p35ICN全部公开在Walker et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.846624-6628中。将Sal1接点插入p35SCN中的CaMV△35S启动子的位于-90位置的EcoR1位点(核苷酸7665);随后将含有截短的35S启动子片段、CAT基因和3′-末端信号的SalI至HindIII片段克隆至pUC19中以产生p△35S(-90)。该截短的启动子的确定应使其具有距35S启动子的帽位点45bp的上游终点(Odell et al.(1985)见上文)且保留了其TATA盒但缺失了35SCN表达所需的上游序列。
(c)p6ARE△ADHGN和p6ARE△ADHIGN亲代载体，pADHCAT和pADHCAT-140的构建由Walker等人(1987)(见上文)已经描述。将含有Adh1启动子的BamHI片段(从位置-1094至位置+106)克隆到pIGN中的Adh1内含子1序列的上游以产生pADHIGN。将跨越位置-140至位置+106的截短的Adh1启动子片段亚克隆至来自pADHCAT-140的pGN和pIGN中以产生p△ADHGN和p△ADHIGN。
在玉米Adh1启动子的位置-140和-99之间发现-厌氧调节元件(ARE)。该ARE由两个序列元件组成跨越位置-133至-124的RegionI和跨越位置-113至-99的RegionII。将ARE分离出作为Pst1片段(Walker et al.(1987)见上文)并克隆p△ADHIGN中的截短的Adh1启动子的上游以产生pARE△ADHIGN。为逆转ARE的取向，将pARE△ADHIGN中的从聚接头(上游位置-140)至位置-99的Sal1片段克隆至p△ADHIGN中唯一的Sal1位点，以产生pARE(-)△ADHIGN。含有多个ARE序列的克隆体(例如，p2ARE△ADHIGN、p4ARE△ADHIGN或p6ARE△ADHIGN)按如下进行克隆用HinCII消化pARE△ADHIGN并加入Pst1接点。然后分离从位置-140至-99的含ARE的Pst1片段，并反克隆至pARE△ADHIGN，Pst1位点(位置-140)的上游。重复ARE序列的数量及其取向由核苷酸序列分析所确定。
通过用来自p35SGN的BamH1/Sac1｀GUS′片段置换含有玉米Adh1 Intron1和GUS的BamH1/Sac1片段而由p6ARE△ADHIGN衍生得到质粒p6ARE△ADHGN。
(d)p4OCS△35SIGN、p6ARE4OCS△ADHIGN和p6ARE4OCS△35SIGN构建将OCS元件分离，作为含有OCS上游启动子区的HpaII(-292)至BamHI(-116)部分的EcoRI-BamHI片段(DeGene et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-510)，如Ellis et al.(1987)EMBO J.611-16和(1987)EMBO J.63203-3208中所述。依照Ellis et al.(1987)EMBO J.63203-3208中的方法制备含有来自OCS基因的OCS一元件的四个衔接拷贝的质粒p4OCSADHCAT。制备4OCS元件作为来自p4OCSX的Sal1/Xho1片段，该p4OCSX为p4OCSADHCAT衍生物，而p4OCSADHCAT通过平端连接并将Xho1接点连接至Sam1位点而制得。将4OCS元件加至p△35SIGN中的Sal1位点以产生p4OCS△35SIGN，将4OCS元件加至p6ARE△ADHIGN中的Sal1位点以产生p6ARE4OCS△ADHIGN，两者都具有相同的4OCS排列取向，如图1e所示。通过用p△35SIGN的Sal1/EcoRI片段代替含有△ADHIGN的Sal1/EcoRI片段，由p6ARE4OCS△ADHIGN衍生得到质粒p6ARE4OCS△35SIGN。
(e)p6ARE△35SIGN和p6ARE△35SGN构建通过用来自△35SIGN的Sal1/Eco R1片段替代含有｀△ADHGN′的Sal1/Eco R1片段，由p6ARE△ADHGN衍生得到质粒p6ARE△35SIGN。通过用来自p△35S(-90)的Sal1/BamH1片段来代替Sal1/BamH1｀△ADH′，由p6ARE△ADHGN衍生得到质粒p6ARE△35SGN。
(f)质粒DNA的纯化上述构建的质粒DNA由大肠杆菌JM109制备(Yanisch-Perron et al.(1985)Gene 33103-109)并且通过在CsCl梯度中的两次离心法分离而纯化。将最后制剂以1mg/ml重悬浮于10mM Tris-HCl(PH8.0)、1mM Na3EDTA中，通过使用Pharmacia T7仪器的DNA序列分析以及通过在用HindIII/SalI/BamHI的三重消化中和在用PvuII/SmaI的二重消化中对限制性片段的定量来检测等分试样，以保证不发生序列的重排。只有那些在凝胶电泳中不出现伪带的制剂才用于后续的电穿孔。
实施例2 植物细胞的培养和原生质体的分离从下列细胞系中分离原生质体。TM一种单粒小麦(Triticum monococcum)的确立细胞系(Koa et al.(1970)Can.J.Genet.Cytol.12297-301);来自Zea mays(Black Mexican Sweet的变种)的BMS(Chourey and Zurawski(1981)Theor.and Appl，Genet.59341-344);L1，在六倍体小麦栽培品种Vilmorin 27中的二体加系，该Vilmorin 27除含有42个小麦染色体以外还含有自Thinopyrum intermedium的两组7个染色体，并且该二体加系通过将小麦和Thinopyrum intermedium之间的部分双倍体杂种回交至小麦(即Vilmorin27)中而产生;LM，由Lolium multiflorum胚乳衍生的系(Smith and Stone(1973)Aust.J.Biol.Sci.26123-133);由Nicotianaplumbaginifolia的叶原生质体培养体衍生的NpTs;以及ER，一种Oryza Sativa(Taipei 309的变种)的胚胎的培养体，它起始于未成熟的胚胎并保持在液体悬浮培养体中四个月。用于细胞悬浮液的维持液、用于分离原生质体的酶，以及用于原生质体培养的培养基的制备如表4所示。
实施例3 原生质体的电穿孔在完全消化后，通过328、110和5μm目筛子筛选原生质体(对L1和TM细胞系用50μm筛子筛两次)。然后用慢速离心法(每分钟80g)沉淀，将原生质体悬浮在发现特别适合于该特定细胞类型的洗涤溶液中(见表1)。将大麦叶肉原生质体在0.375M甘露醇、10mM MES、PH5.8、205mM NaCl、3.5mM KCl、9.4mM MgSO4、8.4mM MgCl23.4CaCl2和0.875mM NaHCO3中洗涤。
将原生质体再次沉淀、洗涤、沉淀并以2×106原生质体/ml的浓度悬浮于TBS9缓冲液(Tris3.63g/l、CaCl2·2H2O 876mg/l、NaCl8.78mg/l、甘露醇50g/l，PH9.0)中(Taylor and Larkin(1988)Austr.J.Biotech.152-55)。
在电穿孔之前，马上将200μl的原生质体悬浮液(如是大麦叶肉则用100μl)加入到含有溶于5μl的10mM Tris HCl，PH8.0，1mM Na2EDTA中的5μl质粒DNA的试管中。将混合物转至电穿孔室中(电极间距为2mm)并由24μF电容器在电极间加3个275V(1375V/cm)的脉冲，其脉冲宽度为5ms，延迟100ms(对于大麦叶肉原生质体用200V)。在使原生质体回收5秒钟后，将原生质体悬浮液吸回到微驱动管中，并向其中加入600μl的洗涤溶液。缓慢地旋转该管(＜100g)5分钟，去除上清液并将原生质体再悬浮于1ml的培养基中。将原生质体悬浮液转移到用石蜡膜密封的35mm的培养皿中，并在25℃于黑暗中培养以使GUS基因表达。
实施例4 在电穿孔原生质体中测定GUS基因的表达培养44-48小时之后，将400μl的洗涤溶液加入至每个培养皿中，并将每个原生质体样品小心地吸到微驱动管中，以100g重量将试管离心分离8分钟并去除上清液。原生质体的片状沉淀物或者储存于-80℃直至需用或马上使用。借助涡旋混合器，每一片状沉淀物均在250μl萃取缓冲液中再悬浮(Jefferson et al.(1987)见上文)。使用装有显微顶端探针的设置于55W的Labsonic 1510型近距离声波定位器在冰上给样品近距离声波定位5秒钟。通过在微驱动管中离心分离1分钟将碎片片状沉淀，并依照制造商的推荐使用Bio-Rad仪器测定该透明上清液的全蛋白质。对于每组构建，都在含有溶于100μl溶胞缓冲液的在5至50μg范围内某一特定含量的全蛋白质的上清液的等分试样上进行GUS荧光测定(Jefferson et al.(1987)见上文)再加入含有2mM 4-甲基-伞形基-β-D-葡糖苷酸(MUG)的100μl萃取缓冲液，将该混合物稍微旋转一下并在37℃下培育20-160分钟范围内的某一特定时间。通过加入1000μl0.2M Na2CO3将反应停止，并用设置于365nm兴奋波长的Perkin-Elmer荧光分光计来测量于455nm的荧光。
实施例5 溶液及培养基的制备培养基CM1是Scoworoft和Adamson(1976，Plant Sci.Lett.739-42)所述的CS5培养基，并将其PH调至5.8。CM2含有Murashige和Skoog无机盐(1962，Physiol.Plant.15473-497).170mg/l L-天冬酰胺、0.77mg/l甘氨酸、0.13mg/l烟酸、0.025mg/l泛酸钙、0.025mg/l盐酸硫胺素、0.025mg/l盐酸吡哆素、4mg/12，4-滴(2，4-d)、20g/l蔗糖，PH5.8。CM3是WtMl(Young et al.，1989，J.Gen，Virol.702245-2251)。CM4含有主要的White的无机盐(1963，in The cultivation of animal and plant cells，2nd ed.，Ronald Press，New York)、次要的Murashige和Skoog的盐和维生素(1962，见上文)、100mg/l肌醇、5g/l醇母萃、10mg/l柠檬酸铁、1mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、40g/l蔗糖、PH5.5。CM5含有R2培养基的主要和次要无机元素(Ohira et al.，1973，Plant Cell Physiol.141113-1121)以及9mg/l FeCl3、11.2mg/l Na2EDTA、1mg/l盐酸硫胺素、2mg/12，4-D、20g/l蔗糖、PH5.9。
原生质体洗涤溶液PW1含有0.3M甘露醇、156mM NaCl.3.5mM KCl、9.4mM MgSO4、8.4mM MgCl2、3.4mM CaCl2、0.9mM NaHCO3、PH6.0。PW2含有B5培养基的主要和次要无机盐(Gamborg et al.(1968)Exp.Cell Res.50151-158)、27mM甘露醇、109mM KCl、105mM MgCl2、33mM CaCl2、3mM2-(N-吗啉代)乙烷磺基酸(MES)、PH5.7。PW3含有0.568M甘露醇、80mM CaCl20.2%MES，PH5.8。PW4是将甘露醇浓度增至49mM后的PW2。
酶消化混合物ED1在PH调至5.8的洗涤溶液PW1中含有1%(W/V)Cellulysin(Calbiochem)、1%(W/V)Driselase、1%(W/V)Macerozyme(Onozuka R-10)。ED2含有1%(W/V)Cellulysin(Calbiochem)、0.5%(W/V)Hemicellulase(Sigma)、0.02%Pectolyase Y-23(Seishin Pharmaceutical)、50mM CaCl2、10mM乙酸钠、0.2M甘露醇，PH5.8。ED3含有1%(W/V)Cellulase RS(Yakult Honsha)、0.1%(W/V)Driselase、0.06%(W/V)Pectolyase Y-23、0.2%(W/V)Hemicellulase、0.2%(W/V)Macerozyme R-10、0.495M甘露醇、0.189M葡萄糖、2mM维生素C、14mM CaCl2、3mM MES，PH5.8。ED4为0.5%(W/V)Cellulase RS、0.68%(W/V)Driselase、0.05%Pectolyase Y-23、6.5mM MES、0.325M甘露醇、40mM CaCl2、向其中加入0.5%(W/V)的活性炭。在缓慢搅拌30分钟后，通过以10，000g离心分离去除活性炭，然后将该溶液的PH调至5.9并通过过滤而灭菌。ED5为1%(W/V)Cellulase RS、0.1%(W/V)Driselase、0.1%(W/V)Pectolyase Y-23、0.35M甘露醇、3mM MES、PH5.9。
该原生质体培养基在使用前都需通过过滤而杀菌。原生质体培养基PC1含有Kao和Michayluk(1975)(Planta126105-110)的培养基，而不含有游离的氨基酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、维生素B2和维生素B12，正如Vasil和Vasil(1980)Theor.Appl.Gen.5697-99所建议的，但含有0.4M葡萄糖、0.1M蔗糖、1mg/12，4-D、0.2mg/l玉米素，PH调至5.6。在过滤灭菌之前通过Amicon YM10膜将该培养基超过滤(Davies et al.(1980)Plant Sci.60237-244)。PC2含有Murashige和Skoog的无机元素(1962，见上文)，7.7mg/l甘氨酸、1.3mg/l烟酸、0.25mg/l盐酸硫胺素、0.25mg/l盐酸吡哆素、0.25mg/l泛酸钙、167mg/l L-天冬酰胺、1g/l L-谷氨酰胺、66g/l甘露醇、20g/l蔗糖、1.67g/l葡萄糖、2%(V/V)椰子水(Gibco)、4mg/l 2，4-D以及0.1mg/l 6-苄氨基嘌呤，PH5.8。PC3含有Kao和Michayluk的主要和次要无机物(1975，见上文)、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆素、1mg/l盐酸硫胺素、1mg/l泛酸钙、0.4mg/l叶酸、0.02mg/l对氨基苯甲酸、0.01mg/l维生素H、400mg/l m-肌醇、2%(V/V)椰子水、750mg/l酪蛋白水解物、200mg/l L-谷氨酰胺、150mg/l L-天冬氨酸、10g/l蔗糖、108g/l葡萄糖、1mg/l 2，4-D、0.2mg/l1-萘乙酸、0.2mg/l玉米素、PH5.6。PC4为加73g/l山梨醇的CM4.PC5具有CM5的无机组分，再加有B5培养基(Gamborg et al，1968，见上文)的维生素、糖和Kao的有机酸(1977，Mol Gen Genet.150225-230)、137g/l蔗糖、2mg/l2，4-D和0.1mg/l激动素，PH5.7。
跟随p35SGN、p6ARE4OCS△ADHIGN和p4OCS△35SIGN的过渡表达的在原生质体萃取物中的β-葡糖苷酸酶的比活性。该大麦叶肉原生质体需要稍微不同的电穿孔条件，如实施例3中所述。
表3构建 平均比活性(微微摩尔的4MU/mg蛋白质/min)需氧 厌氧诱导的p6ARE△ADHIGN 1.4 〔0.73〕＊4.3 〔1.3〕p6ARE△35SIGN 0 0.21 〔0.04〕p6ARE4OCS△ADHIGN 29.3 〔6.7〕 28.7 〔4.5〕在需氧和厌氧条件下使用三种不同构建获得的表达。
＊ 标准误差示于括号内。
权利要求
1.一种用于在单子叶植物细胞中增强植物可表达结构基因的表达的重组启动子分子，该重组启动子分子含有(a)选自ARE和OCS元件所组成物组的多个增强子元件，(b)一种截短的植物可表达启动子，该启动子提供了位于3′至所述多个增强子元件的起始转录所必需的TATA盒区；以及(c)一种作为在植物可表达基因中位于转录起始位点和转译起始位点之间的内含子而天然发现的核苷酸序列；其中位于3′至所述的重组启动子分子的植物可表达结构基因在所述的重组启动子分子的调节控制下于所述的单子叶植物细胞中表达。
2.权利要求1的重组启动子分子，其中截短的启动子选自截短的玉米Adh1启动子和截短的CaMV35S启动子所构成的物组。
3.权利要求1的重组启动子分子，其中所述的截短的启动子是截短的玉米Adh1启动子。
4.权利要求1的重组启动子分子，其中所述的截短的启动子是截短的CaMV35S启动子。
5.权利要求1的重组启动子分子具有结构40CS△35SI，其中40CS指四个OCS的衔接重复拷贝，△35S是截短的CaMV35S启动子，以及I是作为在植物可表达基因中位于转录起始位点和转译起始位点之间的内含子而天然发现的核苷酸序列。
6.权利要求1的重组启动子分子具有结构6ARE△ADHI，其中6ARE指六个ARE的衔接重复拷贝，△ADH是截短的Adh启动子，以及I是作为在植物可表达基因中位于转录起始位点和转译起始位点之间的内含子而天然发现的核苷酸序列。
7.权利要求1的重组启动子分子具有结构6ARE40CS△ADH，其中的6ARE指六个ARE的衔接重复拷贝，4OCS指四个OCS的衔接重复拷贝，△ADH是截短的Adh启动子，以及I是作为在植物可表达基因中位于转录起始位点和转译起始位点之间的内含子而天然发现的核苷酸序列。
8.一种含有权利要求1所述的重组启动子分子的载体。
9.一种包含含有权利要求1所述重组启动子分子的载体的细菌细胞。
10.一种可转变、可再生的单子叶植物，该单子叶植物转变为含有权利要求1的重组启动子分子并在所述的重组启动子分子的控制下表达结构基因。
11.一种权利要求10的玉米植物。
12.一种权利要求10的小麦植物。
13.一种权利要求10的大麦植物。
14.一种权利要求10的水稻植物。
全文摘要
本发明提供了一种用于增强植物可表达结构基因在单子叶植物细胞中表达的重组启动子分子，该重组启动子分子含有选自由ARE和OCS元件构成物组中的多个增强子元件、截短的植物可表达启动子以及内含子。
文档编号C12N15/82GK1063506SQ9110484
公开日1992年8月12日 申请日期1991年5月17日 优先权日1990年5月18日
发明者戴维I·拉斯特, 理查德I·S·布雷特尔, 道格拉斯A·张伯伦, 菲利普J·拉金, 埃伦L·马什, 詹姆斯W·皮科克, 伊丽莎白S·丹尼斯, 马克R·奥利夫, 杰弗里G·埃利斯 申请人:卢布里绍尔遗传学股份有限公司, 联邦科学与工业研究组织