对除草剂具有增强的耐受性的植物的制作方法
【专利说明】对除草剂具有増强的耐受性的植物 发明领域
[0001] 本发明一般涉及赋予植物对除草剂具有农业水平耐受性的方法。特别地，本发明 涉及对PPO抑制性除草剂具有增强的耐受性的植物。更具体地，本发明涉及通过诱变和杂 交育种以及转化而获得对PPO抑制性除草剂增强的耐受性的方法和植物。
[0002] 发明背景
[0003] 自20世纪60年代以来，抑制原卟啉IX生物合成中关键酶原卟啉原氧化酶（在下 文中称为Protox或PPO ;EC: 1. 3. 3. 4)的除草剂己用于选择性杂草控制。PPO催化叶绿素和 血红素生物合成中最后的共同步骤，即将原卟啉原IX氧化成原卟啉IX(Matringe等，1989. Biochem. 1.260:231)。PPO抑制性除草剂包括许多不同结构类别的分子（Duke等，1991. Weed Sci. 39:465 ;Nandihalli 等，1992. Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 ;Matringe 等，1989. FEBS Lett.245:35 ;Yanase和 Andoh，1989. Pesticide Biochem. Physiol. 35:70)〇 这些除草剂化合物包括二苯基醚类（diphenylethers)(例如，乳氟禾草灵（Iactofen)， 5-[2-氯-4-(三氟甲基）苯氧基]-2-硝基苯甲酸（+-)-2-乙氧基-1-甲基-2-氧代乙基 酯；氟锁草醚（a CiflU〇rfen)，5-[2-氯-4-(三氟甲基）-苯氧基]-2-硝基苯甲酸；其甲酯； 或乙氧氟草酿（〇xyfluorfen)，2_氯-1-(3-乙氧基_4_硝基苯氧基）_4_(二氟苯）） 二挫类（oxidiazoles)(例如，^恶草酮（oxidiazon)，3_{2, 4-二氯-5-(1-甲基乙氧基）苯 基}-5-(1，1-二甲基乙基）-1，3,4_巧恶二唑啉-2-(3H)_酮）；环状亚胺类（cyclic imides) (例如，S_23142, N-[4-氯-2-氟-5-块丙氧基苯基]-3, 4, 5, 6-四氢苯邻二甲酰亚胺；氯酿 酰亚胺（^11〇1'〇卩111:11&1;[111)，1^-(4-氯苯基）-3,4,5,6.四氢苯邻二甲酰亚胺）；苯基[1比挫类 (phenyl pyrazoles)(例如，TNPP-乙基，2-{1-(2,3,4_ 三氯苯基）-4-硝基吡唑基-5-氧 基}丙酸乙酯；M&B39279);吡啶衍生物（例如LS 82-556);以及phenopylate及其0-苯 基吡咯烷与哌啶氨基甲酸酯的类似物。这些化合物中的许多竞争性抑制该酶催化的正常反 应，看起来起底物类似物的作用。
[0004] PPO抑制性除草剂的施用导致叶绿体和线粒体中原卟啉原IX的积累，据认为，所 积累的原卟啉原IX泄露到胞液中并在那里被过氧化物酶氧化。当暴露于光下时，原卟啉 IX导致胞液中单线态氧的形成和其它活性氧类的形成，这可以引起脂质过氧化作用和膜破 裂，从而导致细胞迅速死亡（Lee等，1993. Plant Physiol. 102:881) 〇
[0005] 不是所有的PPO酶都对抑制植物PPO酶的除草剂敏感。大肠杆菌（Escherichia coli)和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)PPO 酶（Sasarmen 等，1993. Can. J. Microbiol. 39:1155 ;Dailey 等，1994. J. Biol. Chem. 269:813)对这些除草剂抑制剂具有 抗性。单细胞藻类雷氏衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)对苯基亚胺（phenylimide)除 草剂S-23142具有抗性的突变体已被报道（Kataoka等，1990. J. Pesticide ScL 15:449 ; Shibata 等，1992.于 Research in Photosynthesis 中，卷 III，N. Murata 编辑， Kluwer:Netherlands，第567-70页）。这些突变体中的至少一种看起来具有改变的PPO活 性，其不仅对用于筛选突变体的除草剂抑制剂具有抗性，而且对其它类别的原卟啉原氧化 酶（protox)抑制剂也具有抗性（Oshio 等，1993. Z. Naturforsch. 48c:339 ;Sato 等，1994. 于 ACS Symposium on Porphyric Pesticides 中，S. Duke 编辑，ACS Press:Washington, D. C.)。对抑制剂S-21432具有抗性的突变烟草细胞系也已被报道（Che等，1993. Z. Naturforsch. 48c: 350)。营养缺陷型大肠杆菌突变体已用于确认所克隆的植物PPO抑制 性除草剂的除草剂抗性。
[0006] 现有3种主要策略可用于使植物耐受除草剂，即（1)使用可以将除草剂或其 活性代谢物转化成无毒产物的酶（例如，赋予对溴苯腈（bromoxynil)或basta的耐受 性的酶（EP242236、EP337899))，将除草剂脱毒；（2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代 谢物敏感性较低的功能性酶，例如耐受草甘膦（glyphosate)的酶（EP293356、Padgette S. R.等，J. Biol. Chem.，266, 33, 1991);或（3)过表达敏感性酶，使得鉴于此酶的动力学 常数，在植物中生产相对于除草剂足够的靶酶量，以致尽管存在其抑制剂，但仍有足够的 功能性酶可用。第三种策略用于成功获得对PPO抑制剂具有耐受性的植物已有描述（见 例如，US5, 767, 373 或 US5, 939, 602,及其专利族成员）。此外，US 2010/0100988 和 WO 2007/024739公开了编码具有酶促活性的氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列对 PPO抑制剂除草剂具有抗性，特别是对3-苯基尿嘧啶抑制剂特异的PPO突变体。
[0007] 迄今为止，现有技术尚未描述过含有至少一个根据本发明的野生型或突变的PPO 核酸的PPO抑制性除草剂耐受性植物。现有技术亦尚未描述过在PPO基因来源的基因组以 外的基因组上含有突变的PPO抑制性除草剂耐受性作物植物。因此，本领域需要鉴定来自 其它基因组及物种的PPO抑制性除草剂耐受基因。本领域亦需要对除草剂（例如PPO抑制 性除草剂）具有增强的耐受性、以及含有至少一个野生型和/或突变的PPO核酸的作物。亦 需要控制作物附近的杂草生长的方法。当向具有作物的区域或向作物施用除草剂时，这些 组合物及方法将允许使用喷药技术。 发明概要
[0008] 通过本发明解决技术问题，本发明涉及在植物栽培场所控制非期望植物的方法， 所述方法包括以下步骤：
[0009] a)在该场所提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含编码野生型原卟啉原氧 化酶（PPO)或突变原卟啉原氧化酶（mut-PPO)的核苷酸序列，所述植物对PPO抑制性除草 剂具有抗性或耐受性，
[0010] b)向该场所施用有效量的所述除草剂。
[0011] 此外，本发明涉及通过使用由如下核酸编码的本发明的野生型或mut-PPO鉴定 PPO抑制性除草剂的方法，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17, 1 9, 21，23, 25, 27, 29, 31，33, 35, 37, 39, 41，43 或 45 或其变体。
[0012] 所述方法包括以下步骤：
[0013] a)产生包含编码本发明的mut-PPO的核酸的转基因细胞或植物，其中表达本发明 的 mut-PPO ;
[0014] b)向a)的转基因细胞或植物及相同品种的对照细胞或植物施用PPO抑制性除草 剂；
[0015] c)在施用所述测试化合物之后，测定转基因细胞或植物及对照细胞或植物的生长 或生存力，以及
[0016] d)选择使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低的测试化合 物。
[0017] 另一目的涉及鉴别编码对PPO抑制性除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的核苷 酸序列的方法，该方法包括：
[0018] a)生成mut-PPO编码核酸的文库，
[0019] b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸并用PPO抑制性除草剂处理所述细胞 或植物，筛选所得的mut-PPO编码核酸群体，
[0020] C)比较由所述mut-PPO编码核酸群体提供的PPO抑制性除草剂耐受性水平与由对 照PPO编码核酸提供的PPO抑制性除草剂耐受性水平，
[0021] d)选择至少一种mut-PPO编码核酸，所述核酸较之对照PPO编码核酸提供对PPO 抑制性除草剂显著增加的耐受性水平。
[0022] 在优选的实施方案中，较之由对照PPO编码核酸提供的对PPO抑制性的耐受性，步 骤d)中选出的mut-PPO编码核酸提供至少2倍的对PPO抑制性除草剂的耐受性。
[0023] 抗性或耐受性可通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并且比较 所述转基因植物与对照植物，加以测定。
[0024] 另一目的涉及鉴别含有编码对PPO抑制性除草剂具有抗性或耐受性的mut-PPO的 核酸的植物或藻类之方法，该方法包括：
[0025] a)在植物细胞或绿藻的培养物中鉴定有效量的PPO抑制性除草剂，
[0026] b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，
[0027] c)使所述经诱变处理的细胞群体与a)中鉴定的有效量的PPO抑制性除草剂接触，
[0028] d)选择在这些测试条件下存活的至少一个细胞，
[0029] e)对来自