制备重组人酪氨酸酶的方法
【专利说明】制备重组人酪氨酸酶的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及制备酶促活性的重组人酪氨酸酶的方法。本发明更具体涉及包括克隆 和使用昆虫细胞过表达(重组）人酪氨酸酶的方法。
[0002] 发明背景 酪氨酸酶是已知涉及黑色素形成的酶。在过去已经通过搜寻安全和有效的酪氨酸酶 抑制剂鉴定了很多皮肤美白活性物。在进行体外测定以确定酪氨酸酶抑制和研究酶动力学 中，蘑菇酪氨酸酶已成为最频繁使用的酶，而人和小鼠黑素细胞裂解物的使用程度较小。这 是因为蘑菇酪氨酸酶可大量地获得，相对廉价并且易于使用。然而，蘑菇酪氨酸酶与人酪 氨酸酶非常不同，并且已经认识到在这样的研究中使用蘑菇酪氨酸酶可能导致关于活性物 (如在人中的皮肤美白剂)的潜力的错误信息。因此，优选使用人酪氨酸酶。然而，在供应充 足量的和具有可接受的酶促活性的人酪氨酸酶中存存问题。这已经通过使用来自人黑素细 胞的裂解物在一定程度上克服。
[0003] 人黑素细胞裂解物由于其作为几种蛋白质的混合物而固有的复杂性质和因此当 用于测定中时导致不可预测的表现受到负面评价。酪氨酸酶的纯化由于多步骤的层析方法 导致低产量。因此，存在对制备高产量的、高纯度的和相关酶促活性的人酪氨酸酶的更好方 法的需求。
[0004] 重组人酪氨酸酶的商业来源是可获得的(例如Enzo Life Sciences),但是本发明 人已发现其酶促活性相比于等量的人黑素细胞裂解物是低的。因此，其不能如作为实施皮 肤美白活性物筛选的合适的酶来有效地且可重复地使用。人酪氨酸酶的截短形式或片段可 从其它商业来源获得，但是本发明人已发现它们不适合于酶促测定。这可能是由于它们中 的很多是细菌表达的，并且缺少糖基化，所述糖基化对稳定性和活性是关键的。因此，发现 细菌表达的人酪氨酸酶(其中在文献中存在若干公开）不适合用于酶促测定目的，其必须是 足够地可重复的，以能够有效筛选用于皮肤美白的活性物。
[0005] W090/12869 (Sloan Kettering)公开了组成型表达有生物活性的人酪氨酸酶的 非黑素细胞真核细胞。本发明人已经确定如此表达的酪氨酸酶必须通过破坏成纤维细胞来 制备，并且因此产量和纯度是相当低的。
[0006] Dolinska等人：''Human modified tyrosinase and two temperature-sensitive mutants are soluble active enzymes"， ARVO 2012 Abstract Search & Itinerary Builder, 2012 年 5 月 7 日（2012-05-07)，页 Session No. 231，XP002688743 公开了截 短的人酪氨酸酶(残基19 - 469)的表达，其被工程化为合成的密码子优化的DNA序列并 且克隆至杆状病毒中。
[0007] 本发明人已经开发出制备重组人酪氨酸酶的方法，其中产物更容易纯化并且以强 劲的方式（in a robust manner)展示出生物相关的酶促活性。
[0008] 因此本发明的目标是开发以高产量和纯度制备人酪氨酸酶的方法。
[0009] 本发明的另一个目标是开发以高产量和纯度制备人酪氨酸酶的方法，其易于扩大 规模以大量制备它们用于商品化生产。
[0010] 本发明的还另一个目标是开发制备人酪氨酸酶的方法，从而当用于酶测定时，技 术人员能够获得高度可重复的结果。
[0011] 发明概述 根据本发明，提供了制备重组人酪氨酸酶的方法，其包括步骤 (i) 使用PCR以密码子优化的方式合成制备界定为从对应蛋白质的N-末端延伸至其 473位氨基酸或更高的全长人酪氨酸酶基因； (ii) 克隆所述基因至杆状病毒表达系统中； (iii) 从所述克隆制备杆粒； (iv) 用所述杆粒感染昆虫细胞以制备病毒滴度；和 (V)对期望的人酪氨酸酶的表达筛选优化MOI (感染复数）和时间点。
[0012] 特别优选步骤（V)的细胞培养基包含铜盐。
[0013] 根据本发明的另一个方面，提供了制备重组人酪氨酸酶的方法，其包括步骤 (i) 使用PCR以密码子优化的方式合成制备从对应蛋白质的N-末端延伸至其472位 氨基酸或更低的截短版本的人酪氨酸酶基因； (ii) 克隆所述基因至杆状病毒表达系统中； (iii) 从所述克隆制备杆粒； (iv) 用所述杆粒感染昆虫细胞以制备病毒滴度；和 (V)对期望的人酪氨酸酶的表达筛选优化MOI (感染复数）和时间点； 其中步骤（V)的细胞培养基包含铜盐。
[0014] 发明详述 通过阅读以下详述和所附的权利要求，这些和其它的方面、特征和优点对本领域普通 技术人员而言将是显而易见的。为避免疑义，本发明的一个方面的任何特征可以用于本发 明的任何其它方面。词语"包含（comprising)"旨在意为"包含（including)"但不必然为 "由…组成（consisting of)"或"由…构成（composed of)"。换言之，列举的步骤或选项不 需要是穷尽的。应注意在下文描述中给出的实施例旨在阐明本发明并且不旨在限制本发明 至那些实施例本身。类似地，所有百分比是重量/重量百分比，除非另有说明。除了在操作 和比较实施例中，或其中另有明确说明，该描述中表示材料的量或反应条件、材料的物理特 性和/或使用的全部数字均应理解为通过词语"约"修饰。以"从X至y"形式表示的数字 范围应理解为包括X和y。当对于特定特征多个优选的范围以"从X至y"形式描述时，应 理解为组合不同端点的所有范围也被考虑。如本文可见的本发明的公开应考虑为覆盖彼此 为多项从属的权利要求中可见的全部实施方案，而与可能发现权利要求没有多项从属或冗 余（redundancy)的事实无关。
[0015] 本发明涉及使用昆虫细胞制备重组人酪氨酸酶。该方法具有这样的优点，即这样 制备的酪氨酸酶具有极好的和显而易见的酶促活性。公开的制备人酪氨酸酶的方法具有 以下有用的应用。所述方法可用于直接大量生产人酪氨酸酶。进一步，该材料具有在用于 暗化（darken)皮肤和毛发和用于缓解色素减退病况例如白癜风、不规则色素沉着(减退） (patchy (hypo)pigmentation)、色素减退斑以及帮助实现均匀皮肤颜色的制剂中包括酪 氨酸酶的领域中的应用。其同样设想用于免晒美黑（sunless tanning)领域。通过本发明 的方法生产的人酪氨酸酶可以用于开发鉴定皮肤美白活性物的商业规模测定。此外，所述 方法可以扩展至黑色素及其变体的体外生产。本发明的还另一个有利的优点在于例如在诊 断和疫苗开发的领域中的分子试剂盒的设计。
[0016] 在开发本发明中所实施的用于制备重组人酪氨酸酶的详细步骤如下： (i )使用PCR以密码子优化的方式合成制备全长人酪氨酸酶基因或制备从N-末端延伸 至472位氨基酸或更低的截短版本的人酪氨酸酶基因。按照本发明的全长人酪氨酸酶基因 界定为其对应蛋白质从N-末端延伸至473位氨基酸或更高的人酪氨酸酶基因。截短版本 界定为其对应蛋白质从N-末端延伸至472位氨基酸或更低的基因。可以通过本发明使用 全长人酪氨酸酶基因或截短版本，其中N-末端信号序列源自人序列以外的可选来源。当制 备截短版本时，当相比于全长版本时，所述制备产生缺乏锚定跨膜区以及缺少小C-末端胞 质尾区的版本。截短版本的C-末端将以….Leu-Glu-Gln-Ala-Ser结束。优选在方法中 制备相比于全长人酪氨酸酶用于进一步使用的截短版本。这是因为当截短版本在昆虫细胞 中表达时，其被分泌至生长培养基中并且提供更易于纯化、节省时间、努力和成本的途径。
[0017] 在全长酪氨酸酶中存在跨膜结构域使其成为跨膜蛋白质。这类的表达模式、溶解 性和其它生物化学参数非常不同于可溶蛋白质，例如在上文引用的Dolinska等人中使用 的截短的人酪氨酸酶hTyrCtr残基19至469。因此，这持续成为以全长人酪氨酸酶基因开 始生产期望的以酶促活性形式的酪氨酸酶的挑战。这一挑战性问题已经通过本发明得到克 服。
[0018] (ii)将因此制备的可以是全长或截短版本的基因随后克隆至真核的杆状病毒表 达载体系统中。真核载体优选地为pFastbac?载体。将基因优选地克隆至pFastbac?载 体中的EcoRI和HindIII位点之间。克隆的基因通过常规DNA测序进行确认/验证。
[0019] (iii)随后从克隆制备杆粒。
[0020] (iv)随后使用杆粒感染昆虫细胞以制备病毒滴度。优选的昆虫细胞是Sf9或High Five。优选将所获的Pl病毒滴度经杆粒进一步传代以获得进一步的滴度，例如P2和P3滴 度。优选的方面提供待用于感染HighFive?和Sf9细胞的P3病毒以表达重组人酪氨酸酶 (其可以是全长或截短的，这取决于初始基因）。
[0021] 随后通过蛋白质印迹将经感染的昆虫细胞用感染复数的上述方法和在多个时间 点对期望的人酪氨酸酶的表达筛选进行优化。
[0022] 当使用全长人酪氨酸酶基因时，优选在步骤（V)的细胞培养基中包含铜盐。优选 的铜盐是氯化铜或硫酸铜。进一步优选的方面包含不同铜盐的混合物。当包含时，所述铜 盐以每升细胞培养基〇. 1至25微摩尔范围内的浓度存在。
[0023] 在实际操作中，实施以下步骤以评估本发明方法的效力。
[0024] 使用标准的蛋白质印迹步骤检查酪氨酸酶蛋白质表达的程度并确定收集细胞的 最优时间点。对于扩大生产，决定进一步使用HighFive?细胞。实施100 ml规模的"经感 染的"HighFive?细胞的生长并收集用过的培养基以及细胞沉淀两者。将后者通过常规超 声处理方法裂解并且多个样品的酪氨酸酶活性使用典型的DOPA氧化和D0PA+MBTH偶联测 定进行测试。
[0025] 在优选的方面中，当使用全长人酪氨酸酶基因时，方法包括裂解昆虫细胞以制备 人酪氨酸酶的步骤。
[0026] 在可选的优选的方面中，当使用截短版本的人酪氨酸酶基因时，方法包括裂解昆