专利名称：一种植物酪氨酸酶的染色方法
技术领域：
本发明涉及一种植物酪氨酸酶的染色方法，属于生物化学技术领域。
背景技术：
酪氨酸酶是植物中甜菜素合成和动物体内黑色素合成的关键酶，具有羟化和氧化 双重活性。目前，对酪氨酸酶活性测定的研究很多，但对其活性染色的报道不多。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物酪氨酸酶的活性染色方法，该种方法程序简单，对 仪器设备要求不高，染色专一性强，结果准确可靠。本发明采用的技术方案是植物酪氨酸酶的染色方法，包括如下步骤(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶按照料液比1 5 10 (w/v)加入60mmol Γ1磷酸缓冲液(pH 5. 7)于冰浴研磨，缓冲液包含0. 5mol L^1NaCl, IOmmol L-1抗坏血酸， 10 μ Iiioir1CuCl2和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以8000 IOOOOg于4°C离心15 30分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于-70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样20 30μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并 且不用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6. 8))中平衡10 20分钟。然后转移到IOOml染色反应液中染色30 60 分钟，染色液成分是磷酸缓冲液(pH6.8)包含5mmol L4L-多巴，4mmol 甲基-2-苯并 噻唑啉酮腙，50 μ gmL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。凝胶板棕色反应带清晰出 现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。本方法的有益效果程序简单，对仪器设备要求不高，染色专一性强，而且可以确定 酪氨酸酶的大致分子量，结果准确可靠。
图1盐地碱蓬酪氨酸酶电泳后的凝胶板染色30分钟出现的棕色带(椭圆内)图2盐地碱蓬酪氨酸酶电泳后的凝胶板染色60分钟出现的棕色带(椭圆内)
具体实施例方式实施例1(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶2克，加入IOmL 60mmol L—1磷酸缓冲液 (pH 5.7)于冰浴研磨，缓冲液包含 0. 5mol L^1NaCl, IOmmol Γ1 抗坏血酸，10 μ mol [1CuCl2 和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以SOOOg于4°C离心15分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于-70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样20 μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不 用沸水煮以保持蛋白质活性。
(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6. 8))中平衡10分钟。然后转移到IOOml染色反应液中染色30分钟，染色 液成分是磷酸缓冲液(PH6. 8)包含5mmol IZ1L-多巴，4mmol Ll-甲基-2-苯并噻唑啉酮 腙，50 μ g mL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。用清水冲洗凝胶板终止显色反应， 如图1所示凝胶板上出现的清晰棕色条带即为酪氨酸酶反应带。实施例2(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶2克，加入20mL 60mmol L—1磷酸缓冲液 (pH 5.7)于冰浴研磨，缓冲液包含 0. 5mol L^1NaCl, IOmmol Γ1 抗坏血酸，10 μ mol [1CuCl2 和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以IOOOOg于4°C离心30分钟，上清液即为酪氨酸酶 提取液，于_70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样30 μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不 用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6.8))中平衡20分钟。然后转移到100ml染色反应液中染色60分钟，染色 液成分是磷酸缓冲液(PH6. 8)包含5mmol IZ1L-多巴，4mmol Ll-甲基-2-苯并噻唑啉酮 腙，50 μ g mL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。用清水冲洗凝胶板终止显色反应， 如图2所示凝胶板上出现清晰的棕色条带即为酪氨酸酶反应带。
权利要求
植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是包括如下步骤(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶按照料液比1∶5～10(w/v)加入60mmol L 1磷酸缓冲液(pH 5.7)于冰浴研磨，研磨液以8000～10000g于4℃离心15～30分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于 70℃保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，每个泳道加样20～30μL酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L 1磷酸缓冲液(pH6.8))中平衡10～20分钟。然后转移到100ml染色反应液中染色30～60分钟，染色液成分是磷酸缓冲液(pH6.8)包含5mmol L 1L 多巴，4mmol L 13 甲基 2 苯并噻唑啉酮腙，50μg mL 1过氧化氢酶，2％N，N′ 二甲基甲酰胺。凝胶板棕色反应带清晰出现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。
2.按照权利要求1所述的植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是，步骤(1)所述缓冲液包 含 0.5mol I^1NaCl, likimol Γ1 抗坏血酸，10 μ mo 1 I^1CuCl2 和 2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。
3.按照权利要求1所述的植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是，步骤(2)所述电泳用浓 缩胶浓度4 %，分离胶浓度12 %。
4.按照权利要求1所述的植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是，步骤(3)所述染色液 成分是磷酸缓冲液(PH6.8)包含5mmol IZ1L-多巴，4mmol 甲基_2_苯并噻唑啉酮腙， SOyg mL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。
全文摘要
本发明涉及一种植物酪氨酸酶的染色方法，该方法是先提取植物的酪氨酸酶后进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，电泳后的凝胶板放入含有L-多巴、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙、过氧化氢酶和二甲基甲酰胺的染色液中染色，直到凝胶板棕色反应带清晰出现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。该种方法程序简单，对仪器设备要求不高，染色专一性强，而且可以确定酪氨酸酶的大致分子量，结果准确可靠。
文档编号G01N1/30GK101968411SQ201010269518
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者王长泉 申请人:山东理工大学