专利名称：增强植物外伤耐受性的方法
技术领域：
本发明涉及能增强植物对包括病原体所致感染和创伤在内的外伤的耐受 性的蛋白质。本发明还涉及通过表达编码该蛋白质的基因来增强植物对外伤耐 受性的方法。
背景技术：
已知植物含有识别病原体的相应无毒力蛋白并造成受感染植物细胞改变 以限制病原体扩散的耐受性蛋白，所述改变包括产生活性氧中间体、乙烯和发 病机理相关蛋白，加速木质化以及启动程序性细胞死亡。
许多外伤因素，包括坏死性病原体和创伤(昆虫、风等造成)可诱导针对外 伤的全身反应，所述反应可与以上段落讨论的信号有关，而所述信号由耐受性 蛋白与外来蛋白相互作用以及通过对植物激素信号起反应而产生。
在拟南芥04m6/^/ ^ //za"am )中，有人提出水杨酸(SA)和/或乙烯(ET)可能调节一条全身耐受性途径，另一条全身耐受性途径可能利用茉莉酸(JA)和 乙烯(ET)。两种途径均需要有NPR1蛋白存在。也了解了这些耐受性途径的其 它细节-例如，现已证明SA信号改变NPRl和转录因子TGAl的氧化还原状态。 在它们的还原状态，NPR1和TGA1蛋白均位于核中，相互作用并导致SA诱 导型基因的表达。诱导型全身耐受性(ISR)是一类根瘤杆菌相关耐受性。在ISR 中，NPR1还介导JA/ET途径的信号。
与拟南芥相比，稻(0少m Mm^)(大米)中防御反应的信号转导途径尚不很 清楚。稻中内源性SA水平非常高，而病原体接种并未提高该水平。然而，现 已在稻中发现了NPR1的同源物(NH1)。 NH1的过表达增加稻对水稻黄单孢菌 水稻致病变种(义a"Aowo"w 07zc7 pv. 00^a)(义oo)的耐受性，NH1结合上述转 录因子TGA家族的成员。
本发明人还试图阐明稻中的耐受性系统，现已发现当通过外伤攻击时，稻 的耐受性品系中称为OsGAPl (稻GTP酶活化蛋白-1)的蛋白质增多，该蛋白 质能赋予各种植物对外伤的耐受性。
发明内容
己知植物中编码耐受性蛋白的各种基因，并且已尝试利用经修饰而产生这 些蛋白的各种转基因植物来赋予针对感染或外伤的耐受性。然而，就成功起反 应的植物类型而言，这些耐受性蛋白看来活性谱较窄，并且许多还导致不利的 副作用。本发明提供的材料可用来赋予各种植物针对外伤的耐受性，而没有明 显的不利副作用。本发明提供用来产生称为OsGAPl的蛋白质的重组材料，该 蛋白是赋予广谱植物对外伤耐受性的GTP酶活化蛋白。
在一方面，本发明涉及产生结合G-蛋白并能增强植物对外伤耐受性的 OsGAPl蛋白及其密切相关蛋白的表达系统。用本发明表达系统修饰的转基因 植物耐受病原性生物或创伤所致外伤的能力得到增强。
因此，在另一方面，本发明涉及经修饰而含有产生这种GTP酶活化蛋白 的表达系统的植物细胞或植物。所述植物可以对于OsGAP起源是异源的或是 经修饰而过表达该蛋白的水稻植物。
在还有另一方面，该表达系统产生的蛋白质可用于实施筛选试验以鉴定在植物中调节针对应激或外伤的耐受性的化合物或化合物组合。
本发明还涉及OsGAPl蛋白的免疫特异性抗体。这些抗体可用于检测和纯 化该蛋白。
附图简述
图1A显示0sGAPl的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)和编码它的核苷酸序 歹廿(SEQIDNO:31)。
图1B显示由保藏序列EF584506编码的OsGAPl蛋白的氨基酸序列 (SEQ ID NO:32)与衍生自拟南芥的GTP酶活化蛋白的氨基酸序列 (BAB02719)(SEQIDNO:33)的比较。下划线标出高度同源的C2结构域。
图2A显示.OsYchFl的编码区序列(SEQ ID NO:34-35)。图2B显示 OsYchFl (SEQ IDNO:35)与拟南芥同源物(SEQ ID NO:36)的比对。分别利用 ClustalW程序比对OsYchFl的氨基酸残基与NP—174346。 保守性残 基；":"保守性取代；和"."半保守性取代。下划线标出了在保守性结构 域数据库(Conserved Domain Database) (CDD)中鉴定的OsYchFl中YchF结 构域的推定位置。OsYchFl的理论pI/MW值分别是6.29/44.33 kD。
图3A显示成功产生与HA标签融合的OsGAPl的相互作用G-蛋白伴 侣HA-BAD03576以及成功产生与HA标签融合的无关蛋白质的化学发光试 验结果，它们用于图3B所示蛋白质印迹实验。
图3B显示在OsGAPl和某蛋白质(BAD03576)之间形成复合体的蛋白 质印迹结果，所述蛋白质在酵母2-杂交体试验中显示与OsGAPl相互作用。 BAD03576偶联于血凝素(HA)， HA的抗体用于免疫沉淀该复合体。针对 OsGAPl的抗体用作蛋白质印迹的检测抗体。当HA与无关蛋白质偶联时， 这些抗体检测不到抗体与HA形成的沉淀物。
图4显示作为GST融合蛋白，OsYchFl (OsGAPl的相互作用伴侣， BAD03576)与OsGAPl相互作用导致的GTP酶活性。OsYchFl和OsGAPl 通过细菌表达系统表达为GST融合蛋白。利用200 pM GTP作为起始底物， 通过追踪无机磷酸(Pi)的释放监测GTP酶活性。误差线表明标准误差 (N=3)。 a、 b禾B c代表根据单向ANOVA然后通过图氏后验检验(Tukey，sposthoc test)显示平均值具有统计学差异(pO.01)的各组。
图5显示利用mRNA作为标记，采用实时PCR扩增的(^G^4尸/表达。 检验了耐受性品系CBB14及其亲本敏感性品系SN1033， 二者接种了病原 体或作模拟接种。如图所示，只有CBB14品系显示Os04/V明显表达。
图6A和6B显示创伤对OsGAPl表达的影响。在A图中，测定采用实 时PCR的mRNA产量与时间的函数关系；在B图中，测定对蛋白质表达 的影响。如图所示，CBB14中的表达超过其敏感的亲本。
图7A和7B显示了拟南芥中Oj04尸/或防御标记基因的表达。图7A 显示在4种不同转基因拟南芥植物中通过实时PCR测定的mRNA产量。图 7B显示在这些转基因植物中4种防御基因的产量。
图8A-8D显示未转化拟南芥和两种转基因品系中SA处理对4种防御 基因表达的影响。图8A显示尸i /的表达；图8B显示/^ 2的表达；图8C 显示的表达；图8D显示7Ti/Z/的表达。
图9A-9D显示了未转化拟南芥和转基因植物品系中茉莉酸处理对与图 8A-8D所示相同的4种防御基因表达的影响。如图8A-8D所示，不同的图 表示各个基因。
图10A和10B显示了用病原体，丁香假单胞菌番茄致病变种 (尸"w/omomw ^yn7 gae pv. ^maM) DC3000 (尸W DC3000)接种拟南芥的结 果。
图10A是显示3天后植物外观的照片。
图10B显示与野生型(Col-0)和 含空白载体的转基因植物(V7)相比，这些植物品系中病原体滴度的结果。
图1显示了在拟南芥转基因植物和亲本品系中，用尸w DC3000感染 后4种防御标记基因的表达。
图12显示对照和转基因拟南芥中4种防御标记基因的表达，其中亲本 品系是"/^/-3突变株。
图13A和13B显示了用尸W DC3000接种时，各种拟南芥植物品系的 结果。
图13A显示了经修饰含有OsGAPl蛋白的表达系统的^W-J拟南芥 突变植物、未用该表达系统修饰的背景品系和^W阳性的对照品系的照片。
图13B显示了相应的病原体滴度。
图14显示了各种稻品系的PCR筛选结果，所述品系经修饰含有与玉米泛素启动子操作性连接的编码OsGAPl蛋白的核苷酸序列。该转基因品 系中是否存在转基因见泳道1-10,泳道ll是对照。
图15A和15B显示通过实时PCR测得的RNA水平(图示)(15A)，以及 通过蛋白质印迹显示的相应的蛋白质产量(15B)。-
图16A-16C显示在各种转化株中各种防御标记(分别是尸/ /、尸5Z/和 G/ CW尸)的表达。
图17A显示在转基因稻的叶片中OsGAPl基因的表达；
图17B显示与 野生型相比，这些品系中防御标记蛋白尸/ /、 G/ C『尸和尸5Z7的表达水平。
图17C显示用Xoo菌株LN44、Tl和P6攻击时，转基因植物中病损的降低。 收集8周龄转基因稻品系(1496-1和1496-9)和野生型(爱知旭(Aichi Asahi)) 的叶片以制备逆转录所用的总RNA。釆用实时PCR分析C^04尸/(A)和稻 防御标记基因(B)的相对基因表达。敏感亲本(爱知旭)中内源性OyO^尸/和 防御基因的表达用作比较的参照(表达水平设为1)。研究的防御基因包括 /^ /、 G/ C『尸和尸SZ/。 O^c/D基因(肌动蛋白)的表达用于标准化。接种 测试(C)利用3种义oo菌株/品种，LN44、 Tl和P6。通过评估接种叶片上的 病损面积％定量测定疾病症状。各数据点分析10株以上的植物。误差线表 明标准误差。a和b代表根据单向ANOVA然后通过盖-荷二氏后验检验 (Games-Howell posthoc test)显示平均值具有统计学差异(pO.05)的各组。
图18包括用于获得
图17C所示结果的病损的照片。用Ioo菌株LN44、 Tl和P6接种ayGJ尸/转基因品系和未转化亲本(爱知旭)的8周龄幼苗。如 实施例0所述进行接种测试。平均病损面积(％)的统计学分析示于
图17。
本发明的实施方式
称为稻GTP酶活化蛋白-l(OsGAPl)的蛋白质是外伤情况下在稻中过表 达的165个氨基酸的蛋白质。当所述植物经修饰产生这些蛋白质时(通常为 OsGAPl蛋白)，该蛋白质及其变体能赋予各种植物对外伤的不利作用的耐 受性，所述变体在该165-氨基酸序列的全长上有至少90%、优选95%、更 优选98%或99%的序列相同性。本发明提供可用于修饰各种植物(单子叶植 物和双子叶植物)以增强它们的耐受外伤能力的表达系统。以下实施例证实这些表达系统赋予耐受性的总体能力，这些实施例证明源自单子叶植物稻 的该蛋白质能赋予双子叶植物拟南芥这些特性。
本申请所用的"外伤"指病原体或物理创伤或二者造成的切口。实际上， 机械方式造成的创伤有助于这种病原体感染。
目前，构建在植物中可操作的表达载体，修饰植物细胞，使植物细胞 再生成完整的植物以及植物的重组操作等技术是众所周知的。这些技术总
结于，例如美国专利7,109,033，其关于这些技术的内容通过引用纳入本文。 如本专利所示，用于植物表达的启动子可以是组成型、诱导型和/或组 织特异性的。转化技术包括利用土壤杆菌04gro6。c^n'"m)、脂质转染、电穿 孔等。从转化的植物细胞再生植物的技术也是熟知的。
因此， 一旦有编码OsGAPl蛋白质的核苷酸序列可用，本领域普通技 术人员即熟知制备产生这些蛋白质的转基因植物的方法。天然产生该蛋白 质的核苷酸序列以登录号EF584506保藏在GenBank，并且密码子选择有差 异的合成替代物是可能的。然而，由于植物喜爱的密码子已存在于保藏的 序列中，简单地利用合成形式的该核苷酸序列更方便。构建含该长度的核 苷酸序列的DNA的合成方法也为本领域熟知并可商品化购得。
因此，按照本发明，构建在植物中可操作的合适表达系统，其中编码 本发明蛋白质的核苷酸序列与在植物中可操作的合适控制序列操作性相 连。该表达系统用于修饰植物细胞或植物，从而该蛋白质可以在植物组织 中普遍地或专门在植物的所需位置产生，这取决于控制系统和转化方法的 选择。然后得到的植物(无论单子叶植物或双子叶植物)对病原体或创伤诱导 的外伤起反应而产生该蛋白质，从而增强它们抵御这些外伤事件所致损伤 的能力。
此外，以足量产生并分离和纯化至合适程度(以重量计，纯度至少50%、 优选75%、更优选90%或95%)的该蛋白质本身可用作筛选工具。能结合该 蛋白质的化合物或化合物组合是调节植物抵御外伤能力的候选对象。通过 结合该蛋白质而能刺激其活性的化合物或化合物组合会增强能产生该蛋白 质的植物的外伤-抵御能力。可通过评估化合物或化合物组合促进本发明蛋 白质与合适G-蛋白结合来确定化合物刺激该活性的能力。合适G-蛋白包括作为GTP酶的那些蛋白，本领域已知各种这样的蛋白。然而，特别优选在 下文已显示与本发明蛋白质相互作用的源自稻的G-蛋白-即，其编码序列在 GenBank保藏为BAD03576的G-蛋白。因此，增强结合的化合物或化合物 组合可用于进一步增强天然产生OsGAPl蛋白或因修饰而过表达或普遍表 达其编码基因的任何植物的耐受性。
在另一方面，在该试验中干扰这种结合的化合物是拮抗剂。这种拮抗 剂可以用于降低产生OsGAPl蛋白的植物的耐受性，从而产生人工敏感性。 具有这些人工敏感性的植物是检验能逆转敏感性的方法或化合物的有用底 物。
对所述蛋白质具有特异免疫活性的抗体也可用于纯化本发明蛋白质和 检测它们。术语"抗体"应理解为表示完整的抗体(多克隆或单克隆)，其免 疫特异性片段，例如Fab片段，及其重组产生的形式，例如单链Fv抗体。 因此，术语"抗体"指任何形式的抗体以及保留其免疫特异性特征的任何 部分。这些抗体可用在，例如纯化用的亲和柱上。
在以下实施例中，从稻回收
图1A所示编码OsGAPl蛋白的核苷酸序 列并保藏。采用酵母2-杂交体试验显示编码的蛋白质与稻的G-蛋白(其序列 以BAD03576保藏于GenBank)相互作用，这可釆用蛋白质印迹在体外证实， 其中用HA的抗体处理后，HA标记的BAD03576与OsGAPl共沉淀，用 OsGAPl产生的抗体可检测该沉淀复合体。此外，证明了可以在对病原体 起反应和对创伤起反应而表现出耐受性的稻品系中在mRNA水平和蛋白质 水平诱导OsGAPl表达。
利用OsGAPl蛋白的表达构建物获得转基因拟南芥植物，这些转基因 植物显示在空白条件下和加入水杨酸时，4种防御标记基因的表达均增强。 OsGAPl转基因拟南芥还显示OsGAPl-编码DNA的组成型表达，当用假单 胞菌(he wow w)攻击时，会因这种表达而得到保护。类似地，稻中该DN A 过表达导致几种防御标记基因的表达。
提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。
实施例1OsGAPl-编码cDNA的鉴定和克隆 在义aW基因座存在下，仅仅病原体接种和创伤均诱导cDNA克隆 (C^04尸/)以赋予含有该基因座的稻以耐受性(但在其敏感亲本中不诱导)。
将抑制消减杂交法(SSH)应用于接触义oo的一对近等同基因(near-isogenic) 稻品系的RNA样品- 一种含有耐受性蛋白编码基因尤"W(CBB14)，另一种 是敏感性回归亲本(SN1033)。义"W赋予一些菌株对稻病原体,oo的耐受性。 在CBB14品系中差异表达的部分克隆涵盖开放读框的3'区。釆用5'-cDNA 末端快速扩增(5，-RACE)技术，然后利用特异性引物进行PCR扩增，得到 包含编码OsGAPl蛋白的165个氨基酸残基的完整开放读框的起始和终止 密码子的cDNA。该DNA序列信息保藏在GenBank公共数据库(登录号 EF584506)。编码-OsGAPl蛋白的核苷酸序列和推导的氨基酸序列见
图1A。 更详细地说，用Xoo菌株LN44接种6-8周龄的稻植物。接种4天后收集 叶片组织用于制备总RNA。利用克隆技术公司的PCR-选择cDNA消减试剂盒 (Clontech 637401)进行抑制消减杂交法(SSH)以获得候选克隆。利用市售试剂 盒(Clontech K1811-l)对含有OsGAPl的部分编码序列的候选克隆实施 5'cDNA末端快速扩增(5'RACE)。 5'RACE反应中利用基因特异性引物 HMOL2068 (5， ACATATTGTACAACTTTGCTCTGCCC 3，) (SEQ ID NO:l)、 HMOL2069 (5， CCTCAAGGACAGTAAA AGAATCTC 3，) (SEQ ID NO:2)、 MOL2070 (5， TTGTCCACTGATAAACTTAGAGTTG 3，) (SEQ ID NO:3)禾口 顧OL2071 (5， AGCTATGCAAGACTGTAAGCAATAGG 3，) (SEQ ID NO:4)。为扩增全长编码'区，禾U用弓l物对 HMOL2273 (5， ATGTTGGGGCATCTGGTTGG 3，) (SEQ ID NO:5)禾B 顧OL2071 (5， AGCTATGCAAGACTGTAAGC AATAGG 3，) (SEQ ID NO:4)进行PCR。所 有克隆保存在质粒载体pBluescHpt KSII(+)中，在大肠杆菌(K co/0菌株 DH5a中增殖。
DNA EF584506开放读框序列与作为cDNA序列直接保藏的稻cDNA 克隆(登录号NMJ)01053244)有99%相同。稻基因组中的相应基因可能是 位于2号染色体上的单拷贝基因。BlastP程序显示我们的克隆EF584506的 编码蛋白质与稻基因组序列标注的含有钙结合基序(C2-结构域)的蛋白质样克隆(登录号BADI5699)相同。
含C2-结构域的蛋白质通常参与信号转导过程， 一些成员可结合G-蛋白。 我们的克隆EF584506编码的蛋白质的预测氨基酸序列显示与拟南芥中标注 为也含有C2-结构域的GTP酶活化蛋白的克隆有59%相同。EF584506也称为 Oj04尸/以暗示其对G-蛋白的推定结合能力。
图1B显示C^04尸/和 BAB02719编码的氨基酸残基的比对。突出显示推导的C2-结构域的位置， 星号表明高度保守性氨基酸残基。
生物信息学工具提示OsGAPl蛋白不具有信号肽、导向信号或跨膜结构 域，因此估计其存在于可溶性蛋白质部分。如下所示，生物信息学工具提示了 这点。
表1. OsGAPl的亚细胞定位预测的结果
分析工具亚细胞定位预测万维网上的位置
PSORT细胞质(确定性0.45)psort.org/
MITOPROT革巴向线粒体的概率0.1269ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html
PTS1预测器未耙向过氧化物酶体mendel.imp.ac.at/mendeljsp/ sat/pts 1 /PTS1 predictor .j sp
SignalP非分泌型蛋白质cbs.dtu.dk/services/SignalP/
TMpred无跨膜区ch.embnet.org/software/TMP RED form.html
如下所示采用分部分离方法分离膜-结合和可溶性蛋白质组分以及蛋白质 印迹来证实。
通过Jiang, L.等，CW/肠/. (1998) 143:1 183-1 199的改进分部分离方 法分离膜-结合和可溶性蛋白质。对于蛋白质印迹检测，通过商业服务(英杰公 司，定制抗体(Invitrogen, Custom antibody))将合成肽('N，-CRVIKKTTNPE WNDE-'C，) (SEQ ID NO:30)注射入家兔来产生靶向OsGAPl蛋白的第一抗体 (多克隆)。使用前利用亲和柱纯化抗体。利用偶联于碱性磷酸酶的抗-家兔第二 抗体(在Western BreezeTM免疫检测试剂盒中提供，英杰公司WB7106)识别 该第一抗体。
对于蛋白质印迹分析，先用聚丙烯酰胺凝胶(堆积率4%;分辨率10%) 电泳分离蛋白质，再利用Trans-Blot SD半-干电泳转移元件(Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell)转移至活化的(在无水甲醇中预处理20分钟，然
12后在蛋白质转移缓冲液中处理15分钟)PVDF膜。转移、封闭(利用Western BreezeTM封闭溶液)和检湖」(利用Western BreezeTM免疫检测试剂盒)步骤按照 生产商的手册进行。结果显示OsGAPl蛋白包含在可溶性组分中。
实施例2
证明OsGAPl蛋白与推定的G-蛋白相互作用 进行酵母-2-杂交体实验以找寻与OsGAPl.相互作用的蛋白质。利用商品 化试剂盒BD Matchmaker 文库构建和筛选试剂盒(Clontech K1615-l)。利 用以下引物对从pBluescript KSII(+)载体中的克隆扩增OsGAP/: HMOL2610 (5， CCGAATTCATGTTGGGGCATCTGGTTG 3，) (SEQ ID NO:6)禾口 HMOL2611 (5' CGCTGCAGGTCATACACCCTTAGAACC 3，) (SEQ ID NO:7)。亚克隆入载体pGBKT7(在BD Matchmaker 文库构建和筛选试剂 盒中提供)与GAL4的DNA结合结构域和c-Myc表位标签形成框内融合后， 将重组构建物转移至酵母菌株Y187。利用抗-c-Myc抗体(商业购得)通过蛋 白质印迹分析证实酵母细胞中成功产生OsGAPl蛋白。
利用酵母表达载体pGADT7-Rec产生cDNA文库。从已接种了相应的 不相容病原体的几种稻品系(各自含有Xa或尸/耐受性基因)的逆转录RNA 样品获得的合并cDNA与GAL4的活化结构域融合，将重组构建物转化入 酵母菌株AH109。
通过在pGBKT7-C^O^尸/转化的Y187与AH109酵母文库之间配对开 始文库筛选。用不含Trp、 Leu和His的80培养基(80/-3)选择酵母配对产 物。只有生长至大小最多为2-3 mm直径的菌落进一步接种到不含Trp、Leu、 His和Ade的SD培养基(SDZ-4)上。随后进行菌落转移过滤试验(colony-lift filter assay)来检验/flcZ报道基因活性。
根据选择性培养基上的生长情况和菌落转移试验中阳性蓝色的产生情况， 我们鉴定了编码蛋白质的部分cDNA克隆。回收该部分cDNA克隆并用于和 pGBKT7-0yO4尸7共同转化AH109。观察到阳性代谢选择和菌落转移试验结 果一致(数据未显示)。
在公共基因组数据库中采用BlastX检索得到以上回收的相互作用蛋白质伴侣的身份。发现保藏于GenBank的标注蛋白质BAD03576。 BAD03576是 含有在原核生物的GTP-依赖性翻译因子中发现的YchF结构域的推定G-蛋 白。在稻基因组数据库中发现位于8号染色体上编码与BAD03576相同的 蛋白质的基因组克隆(登录号AP005416)，提示BAD03576可能是核编码的 蛋白质。OsGAPI蛋白和BAD03576之间的相互作用支持将OsGAPl鉴定 为GTP酶活化蛋白。
编码BAD03576的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列见图2A。BAD03576 的预测氨基酸序列显示与拟南芥中也标注为G-蛋白的克隆(登录号 NP—174346)有85°/。相同。比对BAD03576和NP—174346编码的氨基酸残基(图 2B)。在两种蛋白质中均发现YchF结构域，提示OsGAPl的相互作用伴侣是 YchF-型非常规G-蛋白。该稻G-蛋白克隆称为OFyc/zF/。 Osrc/^/的基因组 克隆位于8号染色体上。利用公共数据库的进一步检索未揭示稻基因组中有该 基因的另一拷贝。
为验证酵母-2-杂交体实验的结果，进行了共-免疫沉淀试验。将编码完整 BAD03576蛋白的cDNA插入pGADT7-Rec以产生含框内HA标签的融合蛋 白(BAD03576-HA)。利用Ribomix大规模RNA产生系统-T7 (普罗麦加 (Promega)P1300)体外转录线形化的重组质粒。成功转录得到验证之后，联 用胚芽提取物(普罗麦加L4330)和Transcend 生物素-赖氨酰-tRNA系统 (普罗麦加L5061)体外翻译mRNA。通过Transcend 化学发光翻译检测系 统(普罗麦加5080)证实成功产生体外翻译产物。结果见图3A。
从过表达0^O4尸7的稻品系获得蛋白质提取物。混合约100 pg蛋白质样 品与40 |al体外翻译的BAD03576-HA融合蛋白。利用BD Matchmaker Co-IP试剂盒(Clontech 630449)，利用抗-HA表位标签抗体使含有 BAD03576-HA及其相互作用蛋白质伴侣的蛋白复合体沉淀。
将体外翻译产物与包含OsGAPl蛋白的稻蛋白质提取物温育，利用抗-HA 表位标签抗体(商业购得)使该蛋白复合体(含有BAD03576-HA及其相互作用 蛋白质)沉淀(pull down)。将约20 pi体积的100吗稻总蛋白提取物与40 pl 体外翻译的HA-标记产物混合。利用针对OsGAPl蛋白的抗体对得到的蛋 白质复合体进行蛋白质印迹分析证实BAD03576和OsGAPl蛋白之间的相互作用。利用与HA融合的无关蛋白质的阴性对照未导致OsGAPl的共沉 淀。这些结果示于图3B。
通过检测G-蛋白的GTP酶活性得到进一步证实。制备了纯化的OsYchFl 和OsGAPl GST融合蛋白。Os;Kc;z尸/或OjG^P7的全长编码区框内融合， 位于pGEX-4T-l载体中GST的下游。GTP用作底物，在利用GST-OsYchFl 融合蛋白的体外试验中检测Pi的释放量。结果示于图4。单用GST-OsYchF 的Pi释放量明显高于单用GST或GST-OsGAOl得到的背景信号。混合 GST-OsGAPl禾b GST-OsYchFl融合蛋白可进一步增强Pi释放。当用GST 蛋白替代GST-OsGAPl时，未观察到该现象。
实施例3
在Xfl/4稻品系(CBB14)中(^04尸/是创伤诱导的 评估了 在细菌枯萎病耐受性NIL CBB14 (携带义fl/4基因座)及
其敏感性回归亲本(SN1033)中的表达。通过Zhang, Q.等，Jcto」gr (1996) 22:135-141所述的剪切方法，用水稻黄单孢菌水稻致病变种菌株LN44 或水(模拟)接种8周龄的植物。收集接种前第0天的叶片样品。接种后第2、 4 和6天收集离接种部位约6-8 mm的叶片组织。10天后，在SN1033中明显观 察到疾病症状，而CBB14具有耐受性(数据未显示)。从收集的叶片组织制备总 RNA样品，逆转录和进行实时PCR。利用稻肌动蛋白基因表达作标准化，通 过2-AACT方法(Livak， K. J.等，M"/zo^ (2001) 25:402-408)计算相对基因表达。 通过检测相应mRNA以及检测蛋白质来证实OsGAPl的表达。
在以下几个实施例以及本实施例中，对于mRNA检测，利用逆转录的RNA 样品进行实时PCR分析。利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的ABI PRISM 7700序列检测系统在有圆盖(dome cap)的96-孔PCR平板中进行 cDNA的实时PCR扩增。在含10 SYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统 公司4309155)以及0.3 pM各正向和反向引物的20 (il反应体系中进行反应。 通过应用生物系统公司的引物快车(Primer Express)程序设计实时PCR的引物。 所有反应至少独立进行4次，其中至少3组一致的数据用于分析。
作为标准化标准品的稻OWc/D的表达水平(稻肌动蛋白，Wasaki, J.等，7Vew P/^o/. (2003) 158:239-248)利用以下引物组HMOL2723 (5， CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA 3，) (SEQ ID N0:8)和画OL2724 (5， GACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA 3，) (SEQ ID NO:9)。
用于检测OsGAPl-编码RNA的引物是HMOL2703 (5， TCCGGAGTGG AACGATGAAC 3，) (SEQ ID NO:10)和HMOL2704 (5， GATGTCCAGCTCC GCATTG 3，) (SEQ ID NO:l 1)。
当用不相容的Zoo菌株，LN44接种CBB14植物时，观察到Os04尸/表 达的诱导，在剪切叶片但不接种病原体的模拟接种实验中也发现类似诱导。这 提示C^C^/^的表达可能是创伤可诱导的。在另一方面，敏感性回归亲本 SN1033未显示asCL4尸/的这种诱导。结果示于图5，各实验中Oy04尸/表达 的改变倍数与第0天的表达作比较。在图5中，实心菱形CBB14-病原体接 种；空心菱形CBB14-模拟接种；实心三角形SN1033-病原体接种；空 心三角形SN1033-模拟接种。
为进一步研究CBB14中创伤对6^G」尸/表达的作用，收集接种前第0天 和创伤后第2、 4和6天的RNA和蛋白质样品。在CBB14中观察到0^04尸/ 转录物(通过逆转录RNA样品的实时PCR;图6A)和OsGAPl蛋白(通过蛋 白质印迹分析；图6B)稳态水平的平行诱导，但在SN1033中未观察到，证 实存在耐受性基因座Xa/4对于C^04尸7的创伤诱导至关重要。
利用抗-OsGAPl抗体进行蛋白质印迹分析，显示OyG」尸7的基因表达与 其基因产物产生之间有平行变化。图6B还标出了 21 kDa和15.7 kDa分子量标 记的位置。空心菱形CBB14;空心三角形SN1033。
实施例4 转基因拟南芥品系的产生 将OsGAPl编码序列插入花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的二元载 体(Brears, T.等，尸/a^尸/2"Zo/. (1993) 103:1285-1290)。采用土壤杆菌介导的 真空侵入辅助方法(Bechtold, N.等，M"/zo^s Mo/.肠/. (1998) 82:259-266)进 行转化。通过后代表现出的卡那霉素耐受性(由二元载体的选择标记基因编 码)表型的统计学(卡方检验)分析检验单插入事件。Tl代中3:1(耐受性:敏感性)的比例提示有单插入事件。
通过土壤杆菌介导的转化将重组构建物转移入拟南芥生态型Col-O。筛 选阳性转化体后，只繁殖含有单插入基因座的那些以获得纯合品系用于进 一步实验。如实施例3所述，为验证转基因的表达，对4个独立纯合转化
体的逆转录RNA样品进行实时PCR(图7A)。用于标准化结果的/"W的引 物对应于拟南芥(3-微管蛋白4 (登录号M21415)，其为HMOL2530 (5' GAAGGTGCT GAGTTGATTG 3，) (SEQ ID NO:12)和画OL2531 (5， GGACT丁GACGT丁GTTTGG3，)(SEQIDNO:13)。来自B-6-7品系的信号最 低，将其设置为1以便比较基因表达水平。延长PCR扩增未获得Col-O的 信号。
具体地说，收集含有Oy04尸/的6周龄拟南芥品系(B-6-7;C-9-4;D-2-9; 和J-7-5)和未转化Col-0的叶片组织以制备总RNA，然后进行逆转录。利用 用于标准化的P-微管蛋白基因的表达水平，通过2—^eT方法计算相对基因 表达。扩增40轮后在未转化Col-0中测不到(^O4尸/的表达。将转基因品 系B-6-7(转基因表达最低的品系)的C^GJ尸/表达设置为1作为参比，以比 较不同转基因品系中的C^G」尸/表达。
实施例5
转基因拟南芥中OsGAPl的表达增强防御标记基因的表达 测试了 4种防御标记基因的表达。
尸/ /通常由水杨酸(SA)途径诱导，由茉莉酸/乙烯(JA/ET)途径抑制。
尸7 2通常也由SA途径诱导，但该基因还受多种因素调节。
尸DF人2由茉莉酸/乙烯(JA/ET)途径诱导，由SA途径抑制。
77h'2 /由JA途径诱导，由SA和ET途径抑制。
如实施例3所述，利用以下引物通过实时PCR测定表达
尸/ /: HMOL2265 (5， TCAAGATAGCCCACAAGATTATC 3，) (SEQ ID
NO:14)禾卩画OL2266 (5， CTTCTCGTTCACATAATTCCCAC 3，) (SEQ ID
NO:15);
尸/ 2: HMOL2257 (5， ACCACCACTGATACGTCTCCTC 3，) (SEQ ID
17N0:16)和HMOL2258 (5， AACTTCATACTTAGACTGTCGATC 3，) (SEQ ID NO:17);
mF/.2:画OL2911 (5， CCTTATCTTCGCTGCTCTTGT 3，) (SEQ ID NO:18)禾口固OL2912 (5， CCCTGACCATGTCCCACTTG 3，) (SEQ ID NO:19);
77 7./:腹OL2909 (5' AGCACTGCAAGTTAGGGTGTGA 3，) (SEQ ID NO:20)禾卩HMOL2910 (5， ACATTGTTCCGACGCTCCAT 3，) (SEQ ID NO:21)。
在常规生长条件下的6周龄幼苗中，所有4种防御标记基因显示与野生型 Col-0相比表达增强(图7B)。将各转基因品系中尸W (实心)、尸/ 2 (空心)、 尸D尸人2 (阴影线)和77z/2./ (划点的)的表达与Col-0的表达(表达水平设置为 1)作比较。属于两种不同信号传导途径的/^7和尸DF/.2的诱导倍数尤其高。 这些结果表明OsGAPl蛋白可能参与多种信号传导途径。防御标记基因表
达的增加程度与Oy04尸7表达水平正相关。例如，显示a^c^尸/表达水平
较高的转基因品系C-9-4和J-7-5也较大程度地诱导4种防御标记基因的表 达(比较图7A和7B)。
为进一步阐明OsGJ/5/与SA和JA途径之间的关系，对显示C^O^尸/高 表达的转基因品系C-9-4和J-7-5进行SA和JA处理。这种激素处理不会改变 由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的C^04尸7表达(数据未显示)。另一方面， 防御标记基因的表达模式受到影响。
将含有OsG力尸/的6周龄拟南芥转基因品系(C-9-4和J-7-5)和未转化 的Col-0浸入(Pieterse， C. M. J.等，尸/a"Z Ce〃 (1998) 10:1571-1580; Ton, J. 等，Mo/.尸/aw/'Mcr。6e /"詢c,. (2002) 15:27-34)含有0.01% (v/v) Silwet L-77，含(实心柱)或不含(空心柱)5mMSA的1/2 MS培养基(pH 6.0)中10 秒(如图8所示)。经处理的植物进一步生长2天。如上所述进行样品制备和 实时PCR实验。模拟处理的Col-O用作比较的参比品(表达水平设置为1)。
加入SA时，在Col-0中发现强烈诱导尸i /和尸/ 2基因表达(图8A和8B)。 尽管在Col-0中有这种诱导，但C^(^4尸/转基因品系中尸i /和尸A2转录物的 水平仍比野生型高数倍。相同处理条件下，观察到尸/^7.2和T7z/2./基因表达受抑制(图8C和8D)，特别是在转基因品系中。
如上文SA所述，测试了补加100)LiMJA的影响，其与SA的结果截然不 同。在图9中，实心柱表明有JA存在，空心柱表明没有JA存在。即使在转基 因品系中，JA亦强烈抑制表达(图9A)。 JA对/^2基因表达的作用不明 显(图9B)。该结果与以前发现单个因素可能不能抑制尸i 2表达相一致。虽然 JA在Col-0中略微诱导尸DF/.2和77 2 /表达，但JA不能进一步增强6^a4/V 转基因品系中这些基因的表达(略微高于未加JA的Col-0)(图9C和9D)。
实施例6
C^CL4尸/克隆在转基因拟南芥中的表达增强对细菌病原体丁香假单胞 菌番茄致病变种DC3000 (PWDC3000)的耐受性
尸WDC3000是可用于测试拟南芥中防御反应的常规病原体。
拟南芥在生长室中生长(温度22-24°C;RH 70-80%;光照强度80-120 |liE， 16小时白天-8小时黑夜周期)。如以前所述(由Falk, A.等，尸,'oc.淑/. Jcat/. Sc/. "&4 (1999) 96:3292-3297; Kim, H. S.等，尸/aW Ce〃 (2002) 14:1469-1482; Uknes， S.等，尸/cm, Ce〃 (1992) 4:645-656改进)进行丁香假单胞菌番茄致病 变种DC3000 (尸W DC3000)培养液的制备、接种(通过浸渍方法)和随后的滴 度测定。对于植物激素处理相关的实验也采用浸渍方法(由Pieterse, C. M. J. 等，同上(1998); Ton, J.等，同上(2002)改进)。
利用含有C^04尸/或空白载体(V7)的6周龄拟南芥转基因品系(B-6-7; C-9-4; D-2-9;和J-7-5)以及未转化的Col-O。通过浸渍方法将补加了 0.02% (v/v) Silwet L-77的10 mM MgS04配制的浓度为108菌落形成单位/毫升的 尸W DC3000接种入叶片组织。再培养3天后，记录整株植物的表型，收集 莲座丛(rosette)叶片(不是在感染的部位)，如上所述估计其中病原体的滴度 (每克新鲜重量的菌落形成单位)。
当尸w DC3000接种入Col-0或用空白载体转化的拟南芥时，疾病症状 (发黄和坏死)逐渐显现。测试的所有转基因品系中，这些疾病症状均得到减 轻。红色箭头标出具有疾病症状的叶片(图IOA)。还估计了莲座丛叶片内的 细菌滴度(图IOB)。所有转基因品系显示的菌落计数低于野生型Col-O或用空白载体转化的拟南芥。此外，显示C^04尸/表达较高的转基因品系C-9-4 和J-7-5(图7A)还得到较低的细菌滴度(图IOB)。
还检测了实施例5的4种防御标记基因的表达。接种尸WDC3000后， Col-0中尸i /和尸7 2转录物的水平增加(数据未显示)，而该转基因品系中这 些基因的表达水平甚至更高(
图11)。该观察结果提示OsGAPl诱导信号可 增加病原体接种引发的信号。虽然病原体接种未明显改变Col-0中T7n2J 的水平(数据未显示)，但转基因品系中该基因的表达进一步增强(
图11)。相 比之下，病原体接种后在Col-0中观察到尸DF/.2的强烈抑制(数据未显示)， C^04尸/的表达不能逆转这种抑制(
图11)。该结果提示尸DF人2在转基因品 系显示对尸WDC3000的耐受性增强中不起明显作用(
图10)。
实施例7
转基因拟南芥中OsGAPl的保护功能由NPR1介导 在拟南芥中，NPR1蛋白质是防御反应信号传导途径的关键成员。在稻中 已见NPR1同源物(NH1)的报道，但可用信息极少。NPR1的功能可能涉及SA 和JA/ET途径。利用拟南芥中丰富的突变株集合，我们测试了 OsGAPl与NPR1 相关的作用。
将含有OsGAPl基因的病毒载体转化入缺失NPR1的n/7W-3突变株。收 集在"; W-3 (NPRl-缺乏的)背景中含有0sO4尸7的8周龄拟南芥转基因品系 (D-l、 F-l、 F-2、 F-5、 F-6、 F-10和G-5)、未转化的"/ W-3突变株和野生 型Col-0的叶片组织。Col-O用作比较的参比物(表达水平设置为1)。选择含单 个插入基因座的阳性转化株用于进一步实验。
验证与Col-O遗传背景的转基因表达相当的转基因拟南芥中的转基因表达 之后(数据未显示)，研究4种防御标记基因的表达水平。在Col-0背景中观察 到转基因C^04尸/对和尸Z)尸A2表达的诱导作用(图7B)未在突变 株(
图12)中观察到。事实上，与^W-3亲本相比，在转基因品系中观察到4 种防御标记基因中任一种的水平没有显著增加(
图12)。
随后，转基因品系连同^ W-3突变株和野生型Col-0经受尸WDC3000攻 击。利用在npW-J背景中含有OyCL4尸/的8周龄拟南芥转基因品系(D-1 、 F-l 、F-2、 F-5、 F-6、 F-10和G-5)、未转化的^ W-3突变株和野生型Col-O。图 13A中仅显示F-2品系、未转化的^W-3突变株和Col-0的表型。所有转基 因品系显示的表型类似于未转化的^W-J突变株(数据未显示)。在 突变株中表达(9" 」尸7克隆未赋予明显的保护作用(比较图IOA和13A)。 还估计了接种植物的莲座丛叶片中细菌病原体的滴度(
图13B)。与表型相一 致，未观察到Os04尸7的保护作用。事实上，与Col-0相比，";^7-3背景(含 或不含C^G^P/)的所有植株累积更多病原体。
一 实施例8
构建Oy(X4尸/转基因稻 将编码本发明蛋白质的p^04尸/(
图1A)亚克隆入双T-DNA 二元载体 pSBI30，并置于玉米泛素启动子的控制下。载体pSB130携带两个T-DNA， 其中一个含有潮霉素耐受性基因作为可选择标记，另一个在玉米泛素启动子的 下游具有多克隆位点。然后将该构建物转化入根瘤土壤杆菌(力^o6ac^W"m ^^e/"c/ew)菌株f/W/05以供随后转化入稻。
图14显示利用基于玉米泛素启 动子(正向引物)，HMOL1333: 5，CTGATGCATATACATGATGG3， (SEQ ID NO:22)和ayGJ尸/ (反向引物)，HMOL2069: 5' CCTCAAGGACAGTAAAAG AATCTC3， (SEQ ID NO:23)设计的引物对，通过PCR筛选T2转基因稻品系 的结果。获得了总共10种C^04尸/转基因稻品系。泳道1-11分别代表Al、 A4、 A6、 A7、 A9、 A14、 A15、 A16、 A17、 A19、 A25转基因品系和野生 型(爱知旭)。
实施例9
'稻中OyG^尸/的过表达和增强的稻防御标记基因表达 釆用实时PCR研究转基因和稻防御标记基因的表达。从含单插入基因座 的8周龄T3转基因稻品系和它们相同发育阶段的野生型植株(爱知旭)提取 RNA。
图15显示C^04尸/过表达，因而转基因品系中OsGAPl蛋白累积增加。 收集8周龄稻品系和野生型(爱知旭)的叶片组织以供RNA和蛋白质提取。 在
图15a中，野生型(爱知旭)的内源性OjG」P/表达用作比较的参照品(表达水平设置为1)。在
图15B中，利用抗-OsGAPl抗体的蛋白质印迹分析显示了 C^G」尸7基因表达及其基因产物产生之间的平行改变。
还釆用实时PCR研究了 3种稻防御标记基因(尸/ /、 G/ C『尸和尸5Z/)的 表达，结果示于
图16A-16C。 PR1是熟知的PR蛋白，而富含甘氨酸的细胞壁 蛋白(G/ C『尸编码)是帮助增强细胞壁以阻止病原体攻击的结构蛋白。/^Z/是 因噻菌灵(probenazole) (PBZ)的诱导作用而鉴定的克隆。该基因也可由N-氰 基甲基-2-氯-异烟酰胺(已知诱导疾病耐受性的另一组化合物)和接种稻瘟菌 (MgW^a)诱导。在不相容的稻中，稻瘟菌诱导/^Z/更'决。此外，防御信 号转导基因的过表达诱导和尸SZ/。对于实时PCR，引物如下所
示
殺(BF889437)实时 PCR 正向弓l物；HMOL5364 : 5'CGGACAGAGGCCTTACTAAGTTATTT3' (SEQ ID NO:24);
稻尸W7 (BF889437)实时 PCR 反向引物；HMOL5365 : 5,GACCTGTTTACATTTTCACGTCTTTATT3， (SEQ ID NO:25);
稻富含甘氨酸的细胞壁蛋白(BF889438)实时PCR正向引物； 画OL5376: 5'GAGGCAACGGACACCACTAAG3，' (SEG ID NO:26);
稻富含甘氨酸的细胞壁蛋白(BF889438)实时PCR反向引物； HMOL5377: 5,TGTAAAGCAGAGAGAGAGGCTCATT3" (SEQ IDNO:27);
稻尸5Z/ (D38170)实时 PCR 正向引物；HMOL5409 : 5'AAGCTCAAGTCACACTCGAC3" (SEQ ID NO:28);
稻尸SZ/ (D38170)实时 PCR 反向弓l物；HMOL5410 : 5'GATGTCCTTCTCCTTCTCC3'， (SEQ ID NO:29)。
总之，这三种防御标记基因的诱导程度与C^CL4尸/表达水平正相关。例 如，显示OjG力尸/表达水平最高的转基因品系A7也最大程度地诱导3种防御 标记基因的表达(比较
图15和16A-16C)。
实施例10
证实稻中OsGAPl增强的防御标记并增强的防御作用 在类似于实施例9的另一组转化株中，测试了 OsGAP表达对防御标记基因表达和通过减轻病损而赋予的实际防御作用的影响。 .
如实施例9所述，将玉米泛素启动子控制下的OsGAPl表达构建物转化入 对义oo不显示耐受性的稻栽培品种爱知旭。筛选T4代的各植株中是否存在该 转基因。C^04P7转录物水平的增加表明该转基因成功表达(
图17A)。还检测 了参与不同信号传导途径的防御标记基因的表达，包括，(i)编码发病机理相 关1蛋白的尸/ /; (ii)编码富含甘氨酸细胞壁蛋白的G/ C『尸，禾口(iii)噻菌 灵和N-氰基甲基-2-氯-异烟酰胺(已知诱导疾病耐受性的另一组化合物)以 及真菌枯萎病病原体(fungal blast pathogen)稻瘟菌(Mag"a/ oW/ze gr/wa)诱导 的尸5Z/。在未接种任何病原体的转基因品系中选择的所有3种防御标记基 因的表达升高(
图17B)。用Zoo菌株LN44、 Tl和P6攻击T2植物。通过检 测平均病损区域％作为定量参数，转基因品系(T4代)显示明显的保护作用 (
图17C和18)。
权利要求
1.一种重组表达系统，该系统包含的核苷酸序列编码具有
图1A所示OsGAP的氨基酸序列的蛋白质或其与所述氨基酸序列有至少95％相同并特异性结合鸟苷核苷酸活化蛋白(G-蛋白)的变体，所述核苷酸序列操作性连接于在植物细胞中实现表达的控制系统。
2. 如权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述蛋白质具有
图1A所 示的氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述G-蛋白是OsYchFl 或NP一174346。
4. 一种经修饰'含有权利要求1所述表达系统的植物或植物细胞。
5. —种增强植物耐受外伤能力的方法，该方法包括修饰所述植物使之含 有权利要求1所述表达系统。
6. —种制备具有
图1A所示OsGAP的氨基酸序列的蛋白质或其与所述氨 基酸序列有至少95。/。相同并特异性结合鸟苷核苷酸活化蛋白(G-蛋白)的变体的 方法，该方法包括在产生所述蛋白质的条件下培养含权利要求1所述表达系统 的细胞以及从所述培养物中回收所述蛋白质。
7. —种通过权利要求6所述方法制备的蛋白质。
8. —种鉴定调节植物耐受外伤的能力的化合物或化合物的组合的方法， 该方法包括将权利要求7所述的蛋白质作为测试蛋白与候选化合物或候选化合物的 组合接触，和测定所述化合物或化合物的组合结合所述蛋白质的能力，结合所述蛋白质 的化合物或化合物的组合是调节植物耐受外伤能力的候选对象。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括将G-蛋白连同所述测 试蛋白包括在内并测定所述化合物或化合物的组合干扰所述测试蛋白质与所 述G-蛋白结合的能力，其中化合物或化合物的组合抑制所述结合的能力将所 述化合物鉴定为有效降低植物对外伤的耐受性，增强所述结合的能力则将所述 化合物鉴定为有效增强植物耐受外伤的能力。
10.与权利要求7所述蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。
全文摘要
利用能在植物中产生GTP酶活化蛋白的表达系统修饰植物以增强它们耐受外伤的能力。
文档编号A01H5/00GK101686642SQ200880021080
公开日2010年3月31日 申请日期2008年6月19日 优先权日2007年6月22日
发明者S·S·M·孙, 林汉明 申请人:香港中文大学