专利名称：制备具有逆病毒基因表达能力和翻译后加工能力的质粒的方法和产生的质粒及其表达产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备表达载体的方法和产生的质粒及由该制备方法获得的表达产物，该载体允许同时进行逆病毒基因表达和翻译后加工。更详细地说，本发明涉及一种制备质粒的方法，该方法通过应用重组体DNA技术引起逆病毒gag和pol基因表达，同时通过其中蛋白酶引起上述表达产物本身的加工，和大量产生三种由gag基因编码的核心蛋白质，包括p17、p24和p15，及三种由pol基因编码的酶，包括蛋白酶，逆转录酶和整合酶，各自和独立以成熟或活性蛋白质分子的形式。以及由上述方法获得的质粒及其表达产物。本发明也提供具有nef基因高表达能力的质粒和其表达产物的Nef蛋白质分子。
逆病毒是类属于逆病毒家族的种属名称，其特征在于如同被膜，单链RNA基因组和逆转录酶那样的一般特征。这种病毒为直径80-100nm的球形，其基因组由分子量约3×106的两个线性(+)链RNA分子组成。这两个分子形成转化二聚体。
更详细地说，逆病毒科进一步分成下述三个亚科肿瘤病毒，慢病毒和泡沫病毒(R.E.F.Matthews Edt.“Classification and Nomenclature of Viruses-Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses”，pp124-pp128，S.Karger〔swiss〕，1982)。分类作为肿瘤病毒，也称为RNA肿瘤病毒的已知病毒包括人的T细胞白血病病毒，猫白血病毒鼠类肉瘤病毒、莫洛尼氏鼠类白血病毒、牛白血病毒、猪白血病毒、鸟类白血病病毒、鸟类肉瘤病毒、鸟类成髓细胞瘤病毒和劳氏相关的病毒。归入引起慢性病毒感染的通常称为慢病毒这一类的已知病毒包括1型和2型人的免疫缺乏病毒(下文分别称为“HIV-1”和“HIV-2”)，猿猴免疫缺乏病毒、引起羊脑脊髓炎的维斯纳(Visna)病毒、引起南非羊肺炎的梅迪(meadi)病毒、羊的关节炎脑炎病毒、马感染性贫血病毒和牛淋巴结炎病毒(“Current Topics in AIDS，”Vol.1，pp.95-117，John Wiler & Sons，1987;Advances in Virus Research，Vol.34，P.189-215，1988)。归入泡沫病毒这一类的病毒，使象人、猴、牛和猫这样的哺乳动物感染。由这些宿主分离出的泡沫病毒和合胞体病毒是众所周知的。按照本文使用的术语逆病毒可理解为包括所有病毒，已知的和未知的，也可如上面所述描述成的逆病毒。
不仅从逆病毒在人和其他动物中引起严重的和往往是致命的疾病感染观点来看，逆病毒是重要的，而且对于判断如肉瘤那样的疾病以及对于制备用于研究和遗传工程中物质来说，逆病毒也是有用的。因此，已出版了很多有关这些病毒的文献。众所周知，在1980年以前，作为用于致癌基因机制的模型已研究过逆病毒，并且逆病毒与新的和奇怪的慢病毒感染疾病有连带关系，这种疾病引起不能治愈的继发疾病。自从1981年在美国发现AIDS疾病以来，为了制定治疗疗和预防AIDS的方法，关于各种逆病毒的研究已利用包括流行病学、免疫学、病毒学和分子生物学在内的全部技术领域进行深入细致的研究。已经积累了大量有用的关于AIDS的报告(Advancesin Virus Research，Vol.34，PP.189-215，1988;Annual Review of Immunology，Vol.6，PP.139-159，1988;Microbial Pathogenesis，Vol.5，PP.149-157，1988;“HIV and Other Highly Pathogenic，Viruses”PP.33-41，Academic Press，Inc.，1988;“The control of Human Retrovirus Gene Expression”.PP.79-89，Cold Spring Harbor Laboratory，1988;Cytological Engineering，Vol.7(Suppl.1)，PP.S5-S15，1988)。
在慢病毒中，病毒基因组在病毒微粒核心中形成一种带有逆转录酶、结构蛋白质和引物tRNA的复合体。该病毒基因组含有约10个不同的基因，包括三个碱性主基因，该基因对病毒增殖来说是必不可少的病毒微粒成分进行编码，即对核心蛋白质的前体编码的gag(群特异性抗原)基因，对三种不同酶的前体编码的pol(聚合酶)基因和对被膜糖蛋白的前体编码的env(被膜)基因;这些基因按gag、pol和env顺序从5′端到3′端排列。慢病毒，例如HIV也含有罕见的基因vif，这些基因以gag、pol、vif和env的特殊顺序排列。pol基因的5′端区部分与gag基因的3′端区部分重叠约240个碱基，并具有不同的解读密码;在这种重叠部分翻译过程中发生移码。在分子量为55kd的前体蛋白质翻译之后，从总长度约1.5kb(包括重叠部分)的完整基因区发生切割，即被蛋白酶加工，而这被认为能形成三种蛋白质，即按上述列举的顺序是P17、P24和P15，它们分别用作基质蛋白质、衣壳和核蛋白壳。具有总长度约3kb的完整基因区的表达产生上述酶前体(分子量100kd)，该酶前体以一种能够表示为NH2-蛋白酶-整合酶-COOH的融合蛋白质形式出现，于是，这种融合蛋白质本身在产生的现有蛋白酶的作用下，在相同分子中通过病毒和蛋白酶的作用被切断或被劈开，而这种被称为加工的过程被认为能将融合蛋白质转化成单个的成熟蛋白质(活性蛋白质)，即单独酶，包括蛋白酶(P12)、逆转录酶(P66和P51)和整合酶(P32)(Journal of Virology，Vol.62，No.5，PP.1808-1809，1988)。
上述所有酶在病毒增殖过程中和产生的感染中起重要作用，而且下述功能已被确定或推测蛋白酶参与翻译后加工、核心形成及病毒微粒成熟，而这对于由病毒衍生的病毒是很特异的。已知逆转录酶有三种不同的酶活性。这样，逆转录酶起到依赖于RNA的DNA聚合酶催化基因组RNA逆转录成DNA的作用，这是病毒增殖过程的基本步骤。同时，酶的核糖核酸酶H活性特别消化所形成的RNA-DNA异源双链的RNA链，而依赖于DNA的DNA聚合酶活性产生双链DNA。逆转录酶在遗传重组中一般用作工具。整合酶是一种对DNA链起作用的核酸内切酶，并且识别和催化线性或环形病毒双链DNA部分的切断，这已从整合成宿主染色体DNA的病毒基因组录制到，并因此被认为参与原病毒形成过程(“HIV and Other Highly Pathogenic Viruses”，PP.33-41，Academic Press，Inc.，1988;“The Control of Human Retrovirus Gene Expression，”PP.79-89，Cold spring Harbor Laboratory，1988;Cell Technology(in Japanese)，Vol.7(Suppl.1)，PP.S5-S15，1988;AIDS Journal(in Japanese)，Vol.1，No.3，PP.291-300，1988;Aids，Vol.2(Suppl.1)，PP.S29-40，1988;KAGAKU-TO-SEIBUTSU(in Japanese)，Vol.27，No.4，PP.218-227，1989)。
总长度约0.4kb的nef基因区编码分子量约27kd的负调节因子，而该调节因子被认为能通过对HIV基因组的表达的抑制作用阻止HIV增殖，并因而涉及到潜伏性感染(“Virology”，edited by B.N.Fields，et al.，Vol.2，PP.1534-1535，published by Raven press〔U.S.〕，1990)。
为了发展用于人和动物的疫苗及诊断药物，在世界不同地区已广泛进行大量生产基因产物(下文称为“抗原”)。作为一个典型例子，在下面概述AIDS病毒抗原的大量生产。在大量生产研究中主抗原包括env基因的糖蛋白gp160前体及其加工的产物gp120和gp41(“Forefront of Countermeasures Against AIDS”，edited and authored by Toshiaki Komatsu，Vol.2，pp.477-495，published by CMC，1989)。为了生产gp160，例如已报导使用液泡病毒(vacuolovirus)载体和昆虫细胞(proceedings of National Academy of Sciences“USA”，Vol.84，PP.6924-6928，1987)，重组体牛痘病毒和BSC-40或海拉(Hela)细胞(Nature，Vol.320，PP.537-540，1986;Nature，Vol.330，PP.259-262，1987)和腺病毒载体和A549细胞(“Vaccine 89”，PP.207-217，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。也有用插入的并与gp120基因区和CHO细胞株连接的质粒表达gp120基因区的报导(Science，Vol.233，PP.209-212，1986)，及用大肠杆菌(Escherichia coli)生产gp120的报导(Science，Vol.234，pp.1392-1395，1986)。另外，与这方面有关的已知技术归入一类并简短地列举如下(下文欧洲专利公开No.缩写为〔EP〕，联邦德国专利公开No.缩写为〔DE〕，美国专利申请No.缩写为〔US〕，PCT的国际专利公开No.缩写为〔WO〕法国专利公开No.缩写为〔FR〕)(1)目的在于大量表达基因，如gag、pol和env(下文描述用于每个被使用的宿主)的技术大肠杆菌(EP331961、EP322394、DE3727137、DE3724016、EP293792、US88-168486、US88-218304、US87-110348、EP255190、WO87/07296、DE3711016、EP227169、EP199301、EP219106);
酵母(DE3804891、EP322394、US88-168486);
(2)为生产用基因，如gag、pol和env插入重组体牛痘病毒的技术日本专利公开No.1-148183、FR2620030、FR2607518、FR2600079、FR2587720、FR2596711、EP256677、WO87/06260、WO87/06262;
(3)由病毒载体产生env基因表达的技术使用多形瘤病毒(日本专利公开No.1-39991)和液泡病毒(EP272858、EP265785);以及(4)为产生AIDS病毒抗原表达，如带有乙型肝炎病毒抗原的融合蛋白质的技术(EP278940)。
除了可用作活疫苗的一种有效成分的重组体病毒的生产技术以外，例如包括大量表达，除宿主外的基因产物的分泌物和翻译后的加工的三部分是十分重要的，以便借助于表达载体在工业生产有用蛋白质中保证低生产成本和高质量，并且必须在构建表达载体中研究这三个部分。正如上所述的现有技术概况所知，许多研究人员研究了大量表达，而分泌生产体系(Nippon Nogeikagaku Kaishi(in Japanese)，Vol.60，No.5，PP.1035-1063，1990)的发展正在广泛地和积极地进行。但是，与翻译后的加工计划相比，尽管它的重要性在于节省基因产物提纯过程中的劳动和改进该产物的纯度，却一点也没有给予注意。因此显然，发展翻译后允许加工的表达体系具有重要意义。由于Nef蛋白质在诊断AIDS和解释危象机制方面以及从其抗原性和功能观点看在治疗方面都是有用的，因此确定大量生产技术是所期望的。
为了克服现有技术中的上述问题，本发明进行了广泛的研究，结果成功地导致由逆病毒gag和pol基因编码的6种蛋白质的大量表达，并导致对其加工。更详细地说，本发明通过完成制备质粒来实现，该质粒允许以高和稳定的产率及低成本大量生产三种病毒核心蛋白质，包括P17、P24和P15的逆病毒gag基因产物及三种酶，它们是pol基因产物，包括蛋白酶、逆转录酶和整合酶，各自和单独地以成熟的和活性的蛋白质分子形式。这种成就通过充分使用重组体DNA技术制备一种与所制备的那种病毒的基因cDNA片段连接的质粒可能达到，以便在诱导大量表达基因内或在基因直接表达载体内通过匹配翻译密码含有作为一种主要成分的逆病毒的蛋白酶基因，产生以高产率表达上述基因产物的质粒，并用已表达的蛋白酶标记该基因产物本身的加工。直接表达意指不使逆病毒基因以带有一种不同蛋白质的融合蛋白质形式间接表达，这种不同蛋白质由在载体中已预先组合的基因产生。此外，发明人已发现，通过插入和连接上述基因cDNA将所构建的质粒引入一个宿主细胞中能够获得一种转化体，而且又能稳定地极大量地产生上述核心蛋白质和由上述cDNA编码的酶，不是作为融合蛋白质而是作为具有特殊活性的各自成熟的蛋白质，在培养产物时，使用如下所述的用于培养上述转化体的两步培养法。另外，发明人发现，这种加工是在蛋白酶的特殊活性作用下形成融合蛋白质部分，该融合蛋白质是上述基因的一种表达产物，即上述加工是逆病毒蛋白酶基因内在现象。此外，发现如此加工的上述蛋白质是易于大量产生和提纯的，具有极好的高纯度和均匀性，而尤其酶活性和抗原性二者的特点在于只有逆病毒才有的高基质特殊性。发明人也完成了大量产生具有一种极特殊抗原性的Nef蛋白质。本发明是在这些研究结果的基础上完成的。
按照本发明，提供一种制备质粒的方法和所产生的质粒及其表达产物，该质粒能够大量表达或大量产生和加工分别由与逆病毒有关的gag、pol和nef基因编码的各类蛋白质。这种质粒和核心蛋白质，包括P17、P24和P15及象蛋白酶、逆转录酶和整合酶这样的酶以及是质粒表达产物的Nef蛋白质，作为用于研究防止和治疗逆病毒感染疾病的物质是十分有用的，以及在象遗传工程、蛋白质工程、分子生物学这样的领域作为试剂，和发展医疗药物及抗逆病毒感染疾病的抗病毒剂，作为用于制备疫苗的抗原，诊断药物及抗体都是十分有用的。
图1是一个曲线图，它图示说明大肠杆菌的原提取我把逆转录酶活性值，该E.coli(大肠杆菌)是用携带HIV pol基因的质粒pPG280进行转化的，和用不具有HIV pol基因的载体pUR290进行转化的;图2是一个图形，它图示说明用从HIV载体获得的人血清进行Western印迹分析的结果，及用携带HIV pol基因的质粒pPG280和用不具有HIV pol基因的载体pUR290转化的E.coli的粗提物的结果;图3是一个曲线图，它图示说明由E.coli衍生的逆转录酶在阴离子交换柱上的洗脱曲线;图4是一个曲线图，它图示说明用Affi-Gel Heparin色谱法提纯逆转录酶。
本发明有下列组成部分(Ⅰ)选择逆病毒基因和制备cDNA片段对于逆病毒基因来说，可以使用象反转座子的gag和pol这样的基因。更准确地说，就HIV来说，例如，使用在编码核心蛋白质P17、P24和PP15的gag区内的基因和在编码蛋白酶、逆转录酶及整合酶的pol区内的基因。这些基因表达需要使用蛋白酶基因，所制备的逆病毒基因cDNA片段，以使至少或最少含从上面列举的逆病毒基因中作为例子的蛋白酶基因区，通过在匹配读码中向一个能够被高度表达的基因链合被使用。在基因表达中，利用重组体DNA技术，其中逆病毒基因组是RNA，这些基因在转化成互补DNA后被使用。这种cDNA可以通过或者克隆一种原病毒基因组或者克隆一种结合病毒的基因DNA来制备。另一方面，必不可少的cDNA也可以从cDNA库得到，这种cDNA库使用传统技术直接从基因组病毒RNA制成。但是，任何依赖于直接使用逆病毒的制备技术都带来连带的感染危险。因此，为了避免直接用病毒处理的危险并为了在上述制备方法中省力，推荐使用已知的和公开可以买到的已克隆逆病毒基因组cDNA。更详细地说，如以前所述，各种逆病毒的克隆，它们的顺序，限制性内切酶图的制备早已被全世界研究人员报导过，而由于安全和方便的因素，它们达到利用可能是有希望的。所得到的克隆例如包括质粒pSRA2(Journal of Virology，Vol.36，pp.50-61，1980)，它具有鸟类肉瘤病毒基因组，HIV-1原病毒基因组克隆，即质粒pNL3-1、pNL3-2和pNL4-3(Journal of Virology，Vol.59，pp.284-291，1986)，HIV-1 pol基因克隆，即E.coli菌株UT481/pNLH402(存放在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute)，入藏号FERM BP-2417)的质粒pNLH402，E.coliJM109/pCV91(存放在在日本发酵研究所，入藏号FERM BP-3195)和E.coli JM109/pNLH122(存放在日本发酵研究所，入藏号FERM BP-3196)。cDNA片段可以利用传统方法由这些质粒制备，例如借助于限制性内切酶消化来自上述质粒克隆的所需区的DNA和通过苯酚提取、氯仿处理或乙醇沉淀提纯所产生的产物来制备。可以参考基因组DNA克隆限制性内切酶图恰当地选择用于切断DNA片段的限制性内切酶。因此，例如为了切断来自上述pNLH402的整个pol基因区的DNA片段，可以使用限制性内切酶HindⅢ(Journal of Virology，Vol.59，pp.284-291，1986)。
(Ⅱ)逆病毒基因表达质粒的构建和用移入这样构建的质粒制备转化体通过将按照上述所制备的逆病毒基因组cDNA片段插入到一个大量表达的基因或一个用传统方法制备的基因直接表达载体中来构建逆病毒基因表达质粒。在这里所用的术语“质粒”，对本发明来说，用一种简便符号表达广泛的词义，意指一种表达逆病毒基因的复制子。因此，任何下述已知的或可购买的表达载体可用来构建这样的质粒整个细菌科的pSN508系的质粒载体(美国专利No.4703005)，质粒载体pJM105(日本专利公开62-286930)和酵母的pBH103系载体(日本专利公开63-22098)，减毒的水痘病毒载体(日本专利公开53-41202)，减毒的Marek′s病病毒载体(欧洲专利公开No.334530)，Eschrichia coli质粒载体pUR290系(EMBO Journal，Vol.2，PP.1791-1794，1983)，pSN5182(Journal of Bacteriology，Vol.157，PP.909-917，1984)和pT7-7(Proceedings of the National Academy of Sciences〔USA〕，Vol.82，PP.1074-1078，1985)。重要的是，在构建表达载体时将上述基因与一种能被高度表达的基因连接。因此，例如当使用上面提到的质粒pUR290系时，上述基因最好应在质粒的lacz基因下方插入，或者在质粒pSN5182的情况下，上述基因最好应在质粒psts基因下方插入，或者在pT7-7情况下，上述基因最好应在寡肽基因下方插入，该寡肽基因是在T7启动子控制下由pT7-7产生的。需要的是，蛋白酶应当用靶子产物通过或不通过移码来共同表达。例如，在HIV-1和HIV-2情况下，当cDNA与pol基因相适应时，其中蛋白酶在pol基因区被编码的猿免疫缺乏疾病或莫洛尼氏鼠类白血病毒应当被连接，以便与包含在有高度表达能力的质粒内的基因匹配。从另一方面来说，鸟类肉瘤病毒蛋白酶在gag基因区编码，该gag基因区具有来自pol基因的不同读码，而相类似人的T-细胞白血病病毒或牛白血病毒的蛋白酶基因还有不同于pol和gag两种基因的其他读码。在这些情况下，需要小心，以保证逆病毒基因的有效表达。能够通过引入这样构建的表达载体来制备转化体的合适宿主细胞，包括任何能够增殖和表达那种表达载体的细胞，而且同时，从这种宿主细胞中，能够易于引入已构建的表达载体并且为使用应严格选择其可靠的检查。例如当使用上述pSN系质粒作为表达载体时，希望用E.coli C75菌株(Microbiology Research Inst.Registation No.10191)作为宿主细胞，这就允许通过引入这种载体，利用抗药性作为标志来选择转化体。当使用pUR290系或pT7-7时，需要使用E.coli UT481(Journal of Bacteriology，Vol.163，PP.376-384，1985)，或E.coli BL21(DE3)(Journal of Molecular Biology，Vol.189，No.1，PP.113-130，1986)，这就允许通过引入这些载体，利用抗氨苄青霉素作为标志选择转化体。可以用传统方法，例如氯化钙法(Journal of Molecular Biology，Vol.53，PP.154-162，1977)可以完成将表达载体引入这样的宿主细胞。用引入上述gag或pol基因表达质粒而获得转化体是通过利用标志选自阳性菌落。在转化体菌落确定之后，提取表达载体DNA并用限制性内切酶进行消化，将获得的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。然后可以测量插入DNA片段尺寸并确定与逆病毒基因相应的DNA片段存在。例如，当包含来自质粒pNLH402的整个pol基因区的DNA片段插入表达载体pUR290时，有约4kb DNA的EcoRⅠ片段在DNA的限制性消化中可以被发现，该DNA由上述载体转化的细胞获得。
(Ⅲ)确定由转化细胞克隆的逆病毒基因表达和通过培养转化体大量产生逆病毒蛋白质例如，可以通过利用Western印迹技术分析细胞原提取物来完成确定由转化细胞克隆的逆病毒基因表达。例如原提取物可通过在常规培养基中培养和诱发转化体，用低速离心分离收集细胞，用十二烷硫酸钠和2-巯基乙醇处理收集的细胞，对它进行高速离心分离并收集上清液来制备。Western印迹技术可以按照常规方法使用各种购买的材料以下述步骤进行将上述原提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;通过使用转印迹装置将分离的蛋白质转移到硝化纤维素薄膜上;为阻断将该薄膜浸入明胶液中，例如借助于其免疫反应检测表达的蛋白质。因此，例如当薄膜上的样品是一种HIV pol基因产物时，可以通过用从人HIV载体获得的初级血清培育该薄膜来检测，接着洗涤并用含过氧化物酶共轭标记的抗人IgG抗体的次级抗体培育;通过在添加过氧化氢溶液和显色剂时形成一种着色带检测pol基因产物的存在。在被表达的基因源于除HIV之外的逆病毒场合，一种合适的逆病毒抗血清用于代替人HIV载体血清作为初级血清，用抗人或动物IgG抗体作为次级抗体。
在已确定gag或pol基因的表达后，通过培养转化体如下所述实现大量产生各种核心蛋白质和象蛋白酶、逆转录酶及整合酶的这样的酶为了制备大规模培养转化体的菌种，例如，当转化体是E.coli时，该转化体在LB培养基中在30-40℃温度下培养12-35小时，直至细菌浓度达到2×109-8×109细胞/ml，然后，这种菌种接种到所制备的新鲜培养基中，并进行以两个步骤进行的主培养步骤，一个预培养和一个后培养，为了增殖细胞和加大表达载体进行预培养，预培养适合在10-40℃温度下进行1-24小时，或者最好在15-37℃下进行2-12小时。当达到特定的细胞浓度时，停止预培养，例如在E.coli情况下，当培养液达到OD600nm为0.1-2.0时。接着，刚一结束这种预培养步骤，该培养系统就转向第二个或后培养步骤。后培养步骤的条件必须精心选择，以保证正确地转录和翻译基因及正确的翻译后修饰，并可以进行基因加工，以产生独立的和单个的成熟活性蛋白质，并且也为了避免由于宿主蛋白水解酶的作用产生所需要的基因产物的降解和失活。后培养步骤最好应在低于预培养步骤的温度下进行，即在10-40℃温度下培养1-40小时，更好在15-37℃温度下培养3-35小时。根据所用颗粒状表达载体，例如可通过在后培养步骤开始时导致培养基中磷酸盐离子减少或通过向培养基中添加一种诱发物来加速或诱发表达。使用上述两步骤培养能够产生逆病毒核心蛋白质和象蛋白酶、逆转录酶和整合酶的这样的酶，不是以融合蛋白质形式，而是作为独立的活性蛋白质，即作为独立的和单个的成熟蛋白质，通常产率高达1-30mg/升培养基。
(Ⅳ)核心蛋白质和如蛋白酶、逆转录酶及整合酶这样的酶的提纯通过传统方法的任何组合可以完成这种过程。合适的工艺方法包括例如通过使用沉淀和离心过滤提取已合成的蛋白质;利用超声波处理制备粗提取物，高压处理或均化器处理，以分裂细胞;利用在二氧化硅或活性炭上吸附洗脱，盐析或有机溶剂沉淀;及利用超离心法、柱色谱法或电泳进行高级提纯。例如，可借助于密度梯度离心分离法，接着用二氧化硅和活性炭吸附洗脱分馏来提纯合成的蛋白质(日本专利公开63-297)。
由本发明方法获得的表达载体可以封装在安瓶、小瓶或其他小容器中或引入宿主中的形式提供。由本发明的表达载体大量产生的核心蛋白质和如蛋白酶、逆转录酶及整合酶这样的酶可以液体、干粉末或吸附在滤纸或薄膜上，和封装在胶囊、小瓶或其他小容器中的形式提供。当以粉末形式提供时，该蛋白质在使用前通过适当地溶解在蒸馏水中可以所需的量重组。当以吸附在滤纸或薄膜上提供时，应当用按说明规定的溶剂弄湿后使用。
(Ⅴ)nef基因表达质粒的构建、大量产生、确定、提纯及Nef蛋白质的使用这些可以由类似上述(Ⅰ)至(Ⅳ)中列举的那些过程来实现。但是，因为除gag和pol之外，nef基因被固定在HIV基因组中和翻译后产生的Nef蛋白质不需要加工，因此，对于产生这种蛋白质，如一种简单类型的蛋白质，它是更合理的，并有省力的效果。因此，在不考虑大量产生Nef蛋白质中的加工时，它能够导致以一种简单蛋白质的nef基因的大量表达。更准确地说，通过nef基因cDNA片段与一种大量表达基因或一种基因直接表达载体插入连接来制备nef基因表达质粒。nef基因cDNA片段可以由在HIV基因组或nef基因cDNA中具有nef基因区的质粒pNL4-3(Journal of Virology，Vol.59，PP.284-291，1986)或质粒pNLH152(存放在日本发酵研究所，入藏号为FERM BP-3179)制备。
使用本发明的方法可达到如下益处(1)按照本发明，可同时进行逆病毒基因的大量表达和加工，以及在大量产生逆病毒抗原或使用表达载体的酶，在本方法中避免使用很危险的逆病毒本身，从生物危害的观点来看，生产是安全的，并且容易操作。
(2)可达到HIV蛋白质的极高产率，例如1-3mg蛋白质/升细菌培养，包括各种核心蛋白质、酶和Nef蛋白质。
(3)虽然借助本发明的方法逆病毒的各种核心蛋白质、蛋白酶、逆转录酶和整合酶以带有大量基因表达产物的融合蛋白质被表达，它们可不以融合蛋白质状态，而作为已加工的单个的成熟蛋白质产生，但本发明方法比上述基因的简单表达更有效和更实用。此外，考虑到上面(1)和(2)中提到的效果，这样的一种方法也是更经济的，所需要的低成本生产。
(4)由于本发明方法方便地以低成本和大量地产生具有对逆病毒基质的极高特殊性的酶和高纯度逆病毒抗原，因此，能预料到本发明方法不仅会有助于遗传工程的大进展，而且也会有助于对逆病毒感染疾病的基础研究的大进展，这些逆病毒感染疾病，例如AIDS、成人T细胞白血病、鸟类肉瘤或白血病和猫白血病，也会有助于特殊和选择性治疗及预防药物，以及鉴别这些药物的发展，并且也会有助于增进人体保健和保健学及生活原料工业的发展。
(5)本发明制备质粒的方法能够用于发展更有效和更合理的大量产生这些基因产物的技术，所述质粒允许各种逆病毒基因和各种反转座子基因大量表达及翻译后加工。
现在参照下列非限制性实施例更详细地描述本发明的方法。
在下述实施例中以如下方法测定逆转录酶活性将反应混合物配制成含50mmol tris-Hcl(pH8.3)、50mmol氯化钾、10mmol氯化镁、3mmol二硫苏糖醇、0.1W/V%NONIDET p-40(由美国Shell Oil制造)、20μg/ml(rA)n(dT)12-18(Pharmacia〔瑞典〕)、0.5mmol dTTP(脱氧胸苷三磷酸)和1Ci〔3H〕dTTP(脱氧胸苷三磷酸)。将5μl样品加入总体积为50μl的反应混合物中，并在37℃培育10分钟。然后该混合物立即在冰上冷却，并经过滤纸DE81(由英国Wattman制造)过滤。用5%磷酸钠溶液充分洗涤过滤物，用水漂洗，然后用乙醇漂洗并干燥。
借助于液态闪烁计数器测定放射性。
实施例1携带慢病毒pol基因的表达载体的构建将5μg携带HIV原病毒基因组DNA的质粒pNL4-3DNA(Journal of Virology，59(2)284-291，1986)加到5μl HindⅢ和20μl5×RM(50mmol tris-HCl〔pH7.5〕、35mmol MgCl2、300mmol NaCl)中，用蒸馏水稀释至总体积为100μl并在37℃培育1小时。然后用TE(10mmol tris-HCl〔pH7.5〕、1mmol EDTA)饱和的苯酚提取溶液。在乙醇沉淀之前，用氯仿处理水层。将沉淀物溶解在10μl TE中，并将1μl这种溶液加到0.1μg(1μl)被HindⅢ劈开的质粒pHSG398DNA中，并用碱性磷酸酶处理。再添加2μl的10×络合形成的缓冲剂(660mmol tris-HCl〔pH7.6〕、66mmol MgCl2、100mmol DTT和1mmol ATP)和1μl T4DNA连接酶，并用蒸馏水将总体积增加到20μl。将混合物在15℃培育12小时。用这种反应液按照氯化钙法转化E.coli菌株JM103(Journal of Molecular Biology，53154，1970)，并在含20μg氯霉素/ml LB培养基平皿(1W/V%Bacto-胰胨、0.5W/V%Bacto-酵母提取物、1W/V%NaCl和1.5W/V%琼脂)上选择抗氯霉素菌落。通过传统方法从抗氯霉素克隆提取质粒DNA，而通过选择含约4.0kb片段的克隆得到克隆pNLH 402，该片段源于通Hind Ⅲ切断的质粒pNL4-3 DNA。
将5μl量的Hind Ⅲ和10μl量的5×RM加到5μl(5μg)质粒pNLH402 DNA中，该混合物用蒸馏水稀释至总体积为50μl。混合物在37℃培育1小时，并在苯酚提取和氯仿处理之后，混合物进行乙醇沉淀。将产生的沉淀物加到10μl 5XRM和5μl Bgl Ⅱ中，并用蒸馏水稀释至总体积50μl，借此沉淀物完全溶解。混合物再在37℃培育1小时，在苯酚提取和氯仿处理之后，将产生的产物进行乙醇沉淀。将这样获得的DNA溶解在10μl TE中。
同时，将5μl Hind Ⅲ和10μl5×RM加到5μg表达载体pUR290DNA(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中。混合物用蒸馏水稀释至50μl，在37℃培育1小时，在苯酚提取、氯仿处理和乙醇沉淀之后，加入10μl5×RM(Nacl浓度500mmol)和5μl BamHⅠ。再加入35μl蒸馏水，以使沉淀物完全溶解，然后溶液在37℃培育1小时。在苯酚提取和氯仿处理之后，将用乙醇沉淀出的DNA溶入10μl TE中。
用Hind Ⅲ和BamHⅠ消化的pUR 290 DNA(1μl)与用Hind Ⅲ Ⅰ和Bgl Ⅱ消化的pNLH 402 DNA(1μl)混合，添加2μl 10x络合形成的缓冲剂和1μl T4DNA连接酶。用蒸馏水将总体积增加至20μl，并在15℃反应12小时。按照上述氯化钙法，用该反应液转化E.coli菌株UT481(Journal of Bacteriology，163376-387，1985)。在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基平皿上选择抗氨苄青霉素菌落，通过测量由EcoRⅠ卵裂的插入片段尺寸选择含源于pNL4-3的约3.8kb的片段的克隆。这样获得克隆UT481/pPG280。更详细地说，在这种克隆中，约3.8kbHIV pol基因区被认为是绑在质粒pUR290的lacZ基因的3′端上，而lacZ和pol基因产物的融合蛋白质(约230kd)起始表达，加工后产生各种分离酶。
实施例2通过培养转化细胞产生慢病毒蛋白酶，逆转录酶和整合酶转化体克隆UT481/pPG280于37℃在含20μg氨苄青霉素/ml(1W/V%Bacto-胰胨、0.5W/V%Bacto-酵母提取物和1W/V% NaCl)的LB培养基中培育18小时，将所产的细胞加入含20μg氨苄青霉素/ml以1∶100稀释的新鲜LB培养基中并进行预培养。当培养基的OD 600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，出自Sigma〔U.S.A〕)，并在25℃培养18小时。用离心分离(5000rpm，5分钟)收集细菌并悬浮在1/25体积的40mmol tris-HCl(pH8.0)(0.1mmol EDTA，5mmol mgCl2，0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巯基乙醇)中。在超生波处理(5个30秒脉冲;19.5KHZ，300W)之后，通过离心分离(19000rpm，60分钟)分离上清液。为了确定在这种粗提取液中HIV pol基因产物的存在，测量该原提取液中逆转录酶活性。结果示于图1。如预料，观察到有特殊意义的逆转录酶活性。也进行了Western印迹技术分析将4W/V%十二烷基硫酸钠(SDS)和1W/V% 2-巯基乙醇加到收集的细菌细胞，在煮沸5分钟并离心分离(10000rpm，5分钟)后，将上清液在0.1W/V% SDS-10W/V%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在借助于转印迹装置(由美国BioRad制造)将印迹弄到硝化纤维素薄膜上之后，按照传统阻断方法将薄膜浸入了W/V%明胶液中。然后，作为初级反应用由HIV载体获得的人血清培育薄膜，在洗涤之后，作为次级反应用过氧化物酶标记结合的抗人IgG血清(由BioRad制造)培育薄膜。最后，在洗涤后将薄膜浸入显色液中，以引起颜色形成。在室温保持15分钟，然后用蒸馏水洗涤，所述显色液是通过将0.41ml DAB(3，3′-二氨基联苯胺四氢氯化物)和5μl的30W/V%过氧化氢溶液加到50ml TBS(20mmol tris-HCl〔pH7.4〕500mmol NaCl)中制备。结果示于图2。虽然在用不携带HIV pol基因(E.coli菌株UT481/pUR290，以载体pUR290为基)的载体转化的细胞的原提取液中未观察到与人HIV载体血清反应的特殊带，但在菌株UT481/pPG280的转化细胞的提取液中却观察到分子量为66kd和51kd的逆转录酶，32kd的整合酶和12kd的蛋白酶的带，即HIV pol基因产物。用离子交换MonoQ(由瑞典Pharmacia制造)的柱色谱表明，逆转录酶已分离，即如图3所示示，逆转录酶从β-半乳糖苷酶断开，因为在由β-半乳糖苷酶活性完全分离部分中能发现逆转录酶活性。这就表示尽尽管HIV pol基因产物以带有β-半乳糖苷酶、蛋白酶、逆转录酶和整合酶区的融合蛋白质产生，但这种融合蛋白质特别通过蛋白酶的作用被分离，该蛋白酶本身是pol基因产物并积累在细胞中。
实施例3一种能产生大量慢病毒蛋白酶的载体的构建将1μl Hind Ⅲ和10μl5×RM加到5μg实施例1中制备的pol基因表达质粒pPG280的DNA中，并用蒸馏水将混合物稀释到总体积为100μl。混合物在37℃培育1小时，在苯酚提取和氯仿处理后，混合物进行乙醇沉淀。将所得到的沉淀物加到5μl5×RM(-NaCl)和5μl BalⅠ中，并用蒸馏水稀释到总体积为50μl，借此使沉淀物溶解。混合物在37℃再培育1小时，在苯酚提取和氯仿处理后，所得到的产物进行乙醇沉淀。将所得到的沉淀物加到5μl10×聚合酶缓冲剂(670mmol Tris HCl〔pH8.8〕、67mmol MgCl2、166mmol(NH4)2SO4、100mmol2-巯基乙醇和67mmol EDTA)、5μl10×dNTP溶液(dATP、dGTP、dTTP和dCTP各为3.3mmol)和1μl T4DNA聚合酶中，并用蒸馏水稀释到总体积为50μl，借此使沉淀物溶解。混合物在37℃培育15分钟，在苯酚提取和氯仿处理后，所得到的产物进行乙醇沉淀。向通过将所得到的沉淀物溶入10μl TE和2μl10×络合形成的缓冲剂中所制备的溶液的混合物再加入1μl T4DNA连接酶，并用蒸馏水使总体积达到20μl。混合物在37℃进一步培育12小时。按照上述氯化钙方法用该反应液转化E.coli菌株UT481。在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基平皿上选择抗近苄青霉素菌落，通过利用EcoRⅠ消化作用测量插入的片段尺寸来选择含由pNL4-3产生的0.55kb片段的克隆。这样就获得克隆UT481/pLB550-3。
用BglⅡ和KpnⅠ切断大量产生HIV-1(慢病毒)pNLH402(实施例1)的蛋白酶的载体的结构，将所得到的约1.7kb DNA片段用NlaⅣ进一步切断。将这样制备的约1.2kb DNA片段插入克隆载体pCU19的HinCⅡ部分，以获得pUN40。将这样获得的pUN40用BamHⅠ和PstⅠ切断，将所得到的1.2kb DNA片段插入用BamHⅠ和PstⅠ切开的表达载体pUR291(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)和pT7-7(Proc.Natl.Acid.Sci.，USA，821074-1078，1985)中，以分别构成pPG401和pTP440。然后用BalⅠ和PstⅠ切断pPG401，在T4DNA聚合酶处理后，引起自链合而获得pPG421。另一方面，用BalⅠ和PstⅠ切断pTG440，在T4DNA聚合酶处理后，引起自链合而获得pTP442。这些pPG401、pPG421、pTP440和pTP442表达蛋白酶HIV-1。对于pPG401和pPG421，菌株UT481和JM103用作表达宿主。对于pTP440和pTP442，用菌株BL21(DE3)作为表达宿主。
实施例4由转化细胞大量产生慢病毒蛋白酶在LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中，于37℃将转化体克隆UT481/pLB550-3培养18小时，将所得到的细胞加到以1∶100稀释的新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中，并在37℃进行预培养。当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，Sigma〔U.S.A〕)，并在37℃继续培养6小时。用离心分离(5000rpm，5分钟)收集细菌，并添加4W/V%十二烷基硫酸钠(SDS)和1W/V%2-巯基乙醇。在煮沸5分钟并离心分离(10000rpm，5分钟)后，将上清液在0.1W/V%SDS-15W/V%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。随后，借助于实施例2中所述的Westrn印迹技术分析收集的细菌。虽然在UT481/pUR290的原提取物中没有观察到与人HIV载体血清反应的特殊带，但在UT481/pLB550-3的提取液中观察到12kb蛋白酶的带。特别是以适量蛋白酶产生的pLB550-3是pPG280的数倍。在这个克隆中，0.55kb HIV pol基因被认为是绑扎在质粒pUR290的lacZ基因的3′端上，而lacZ-pol基因产物被认为以分子量约140kb的融合蛋白质形式产生，加工后产生约12kb的蛋白酶。
实施例5一种携带致癌病毒蛋白酶和pol基因的表达载体的构建将5μg携带劳氏肉瘤病毒cDNA的质粒pSRA2DNA(Journal of Virology，36，PP.50-61，1980)加到5μl BamHI和20μl5×RM中，并用蒸馏水稀释到总体积为100μl，然后将其在37℃培育1小时。在这个反应后，混合物在1W/V%低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳，并消化含1.8kb DNA片段的凝胶部分。然后，在苯酚提取和氯仿处理后，将所得到的产物进行乙醇沉淀。将沉淀物溶入10μl TE中，并将1μl这种溶液加到0.1μg(1μl)用BamHⅠ切开并用碱性磷酸酶处理的质粒pUR291DNA中。进一步添加2μl10×络合形成的缓冲剂和1μl T4DNA连接酶，并用蒸馏水使总体积增加到20μl。然后反应混合物在15℃培育12小时。接着，按照氯化钙方法用该反应混合物转化Escherichia coli UT481菌株，并在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基平皿上选择抗氨苄青霉素菌落。使用普通方法从抗氨苄青霉素克隆中提取质粒DNA，并且通过选择含由质粒pSRA2产生的1.8kb片段并产生lacZ-gag融合蛋白质的克隆获得克隆pSR281。
将5μg质粒pSRA2 DNA加到5μl pstⅠ和20μl 5×RM(750mmol NaCl)中，并用蒸馏水稀释到总体积为100μl，然后将其在37℃培育1小时。在反应后，该混合物在1W/V%低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳，消化1.8kb DNA片段。然后，在苯酚提取和氯仿处理后，将所得到的产物进行乙醇沉淀并溶解到10μl TE中。类似地，用PstⅠ切开M13mP18的双链噬菌体DNA并用碱性磷酸酶处理。将1μl(0.1μg)这种DNA加到1μl上述3.1kb DNA片段、2μl 10×络合形成的缓冲剂和1μl T4DNA连接酶中，并用蒸馏水稀释到总体积为100μl，然后将其在15℃培育12小时。接着，按照氯化钙方法使用重组子噬菌体DNA转染E.coli菌株TG1，在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷，Sigma〔U.S.A〕)的2YT培养基平皿(1.6W/V%Bacto-胰胨、1W/V%Bacto-酵母提取物、0.5W/V%NaCl和1.5W/V%Bacto-琼脂)上形成噬菌斑。
转染TG1菌株在2YT培养基(1.6W/V%Bacto-胰胨、1W/V%Bacto-酵母提取物和0.5W/V%NaCl)中繁殖，直到培养基的OD600nm达到0.3，将一些所得的噬菌斑的非染色质克隆接种。继续培育几小时，然后按照普通方法制备单链和双链DNA。通过用PstⅠ和BamHⅠ消化所获得的双链DNA选择含由pSRA2产生的3.1kb片段的克隆M13sr31。由pSRA2产生的3.1kb片段编码gag基因3′端、终止密码子TAG和pol基因。在终止密码子前插入一个碱基形成具有匹配翻译码组的gag-pol融合基因的表达。这样，通过使用一个体外诱变用具(Amersham〔英国〕制造)获得克隆M13sr32，在M13sr31上的终止密码子TAG前通过插入一个碱基获得含有顺序ATAG。
将5μg M13sr32的双链DNA加到5μl pstⅠ和20μl 5×RM中，并用蒸馏水稀释到总体积为100μl，然后将其在37℃培育1小时。在反应后，混合物在1W/V%低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳，消化含3.1kb DNA片段的凝胶。在苯酚提取和氯仿处理后，所得到的产物进行乙醇沉淀。将沉淀物溶入10μl TE中，并将1μl这种溶液加到1μl(0.1μg)通过pstⅠ消化并用碱性磷酸酶处理的质粒pSR281DNA(见前文)中。再添加2μl 10×络合形成的缓冲剂和1μl T4DNA连接酶，并用蒸馏水使总体积增加到20μl。然后混合物在15℃培育12小时。接着，按照氯化钙方法用这种反应混合物转化E.coli UT481菌株，并在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基平皿上选择抗氨苄青霉素菌落。用普通方法从抗氨苄青霉素菌落中提取质粒DNA，通过使用pstⅠ和BamHⅠ消化质粒确定由M13sr32产生的3.1kb片段的存在和方位，然后获得被认为是表达蛋白酶和pol基因产物的克隆UT 481/pSR271。
当用pstⅠ切开pSR281时，在由pSRA2产生的并包含在质粒pSR281内的1.8kb区中除去与由M13sr32产生的3.1kb片段重叠的1.3kb区。
实施例6致癌病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶的产生转化体克隆UT481/pSR271在LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中、在37℃培育18小时，将所得到的细胞加到以1∶100稀释的新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中，并进行预培养。当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG，并在25℃继续培养18小时。用离心分离(5000rpm，5分钟)收集细菌，并悬浮在1/25体积的40mmol tris-HCl(pH8.0)(0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V%Triton X-100和10mmol 2-巯基乙醇)中。在超声波处理(5个30秒脉冲，19.5kHz、300W)后，用离心分离(19000rpm，60分钟)分离上清液。为了确定RSV基因产物在这种原提取液中的存在，测量原提取液中的逆转录酶活性。如所预料，观察到显著的逆转录酶活性。也进行Western印迹技术分析将4W/V%十二烷基硫酸钠(SDS)和1W/V%2-巯基乙醇加到收集的细菌中。在煮沸5分钟并离心分离(10000rpm，5分钟)后，上清液在0.1W/V%SDS-15W/V%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在使用转移印迹装置(BioRad〔U.S.A〕制造)将印迹弄到硝化纤维素膜(S&S〔西德〕制造)上后，按照普通印迹方法将该膜浸入3W/V%明胶溶液中。然后，作为初级反应，用抗RSV兔血清培育该膜，洗涤后作为次级反应，用结合抗兔IgG血清的过氧化物酶标志(BioRad制造)培育。最后，在洗涤后将膜浸入通过将0.4ml DAB(3，3′-二氨基联苯胺四氢氯化物)和15μl 30W/V%过氧化氢溶液加到50ml TBS(20mmol tris-HCl〔pH7.4〕、500mmol NaCl)中制备的产色液中，以引起颜色形成，在室温保持15分钟，然后用蒸馏水洗涤。虽然在转化细胞UT481/pUR290(以不具有RSV基因的载体pUR290为基)的原提取液中没有观察到与抗RSV兔血清反应的特殊带，但在UT481/pSR271提取液中观察到RSV逆转录酶带。尽管RSV蛋白酶和pol基因产物以带半乳糖苷酶、蛋白酶和逆转录酶区的融合蛋白质形式产生，但这种融合蛋白酶特别通过蛋白酶的作用被切开，蛋白酶自身是gag基因产物，并认为积累在细胞中。在克隆UT481/pSR271中，3.6kb劳氏肉瘤病毒gag和pol基因区被认为是绑扎到质粒pUR291的lacZ基因的3′端，建议将lacZ、gag和pol基因产物以融合蛋白质(约230kb)形式表达，然后将其加工，以释放出酶，例如蛋白酶(P15)、逆转录酶(P92、P65)和整合酶(P32)。
实施例7逆转录酶的提取如在实施例2中所述，于25℃在91LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中培养转化的E.coli克隆UT481/pPG280，当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG。继续培养24小时，收集后将细胞悬浮于120ml的40mmol tris-HCl(pH8.0)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巯基乙醇)缓冲剂中。用超声波处理分裂细菌细胞并进行离心分离(19000rpm，60分钟)，分离出上清液作为原提取液。
实施例8逆转录酶的提纯将Polymine P(BRL〔U.S.A〕制造)以0.1W/V%的合适量加到原提取液中，然后在4℃搅拌30分钟并离心分离(16000rpm，20分钟)。
将硫酸铵加到上清液中。用离心分离(16000rpm，20分钟)除去由这种40%饱和溶液中产生的沉淀物，获得137ml上清液。再将硫酸铵加到80%饱和溶液中，将这样产生的沉淀物溶于50ml上述的40mmol tris-HCl缓冲剂中，然后逆着含50mmol NaCl的相同缓冲剂进行渗析。
实施例9逆转录酶的高级提纯使用DEAE Bio-Gel A(BioRad〔U.S.A〕)和Affi-Gel Heparin柱色谱(BioRad)进行高级提纯。将实施例8的渗析样品施加到用40mmol tris-HCl(pH8.0)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V%Triton X-100、10mmol 2-巯基乙醇和50mmol NaCl)平衡的30ml DEAE Bio-Gel A柱上。然后将洗脱的样品施加到用上述缓冲剂平衡的30ml Affi-Gel Heparin柱上，并用150ml含梯度为50mmol-400mmol的氯化钠的缓冲剂洗脱。结果示于图4。将含逆转录酶活性的馏分29至38汇集。将汇集的馏分逆着20mmol磷酸钠缓冲剂(pH6.8)(含0.1mmol EDTA、5mmol MgCl2、0.1W/V% Triton X-100和10mmol 2-巯基乙醇)渗析，并进一步用HPLC在羟磷灰石柱(KB柱，Koken〔日本〕)上提纯。特别是在样品吸附在柱上后，用线梯度20-400mmol的磷酸钠进行洗脱，汇集含逆转录酶活性的馏分。于是获得提纯的逆转录酶。通过使用SDS-PAGE确定这样获得的逆转录酶纯度超过95%。相对于原提取液产率为31%。提纯的逆转录酶由具有基本相同摩尔比的P64和P51组成，确定两个亚单位N末端氨基酸顺序为Pro-Ile-Ser-Pro-Ile-Glu-Thr-Val-Pro-Val-Lys-Leu-Lys-Pro-Gly……，因此，与由核苷酸顺序预测的氨基酸顺序一致。
实施例10高度表达AIDS病毒核心蛋白质的载体的构建用PvuⅡ切断携带HIV-1原病毒基因组DNA的质粒pNL4-3(Journal of Virology，59(2)284-291，1986)的DNA，收集所产生的约2.1kb DNA片段。将该片段插入质粒pUC9的HinCⅡ部分。这样引入的其5′端与BamHⅠ部分侧面连接的片段称为pCV91。
在用BamHⅠ和BalⅠ切断pCV91后，收集所产生的约1.5kb DNA片段，并插入用SalⅠ、T4DNA聚合酶和BamHⅠ顺序处理的表达载体pUR292(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中，以制备pPG912。此外，用BglⅡ切断pPG912，并在T4DNA聚合酶处理后，引起自链合，使pPG912转化成pPG922，其中四个碱基引到BglⅡ部分上。
在pPG912和pPG922中，完全含从HIV-1gag基因区的P24区到pol基因的蛋白酶区整个范围的DNA片段在码组中连接到lacZ基因的3′端。HIV-1的基因产物以带半乳糖苷酶的融合蛋白质形式表达，而然后，进行一种基于所表达的蛋白酶的加工，对于pPG912借助于从gag到pol的移码，或对于pPG922不移位，产生核心蛋白质P24。在pPG912中也产生P15。
在用BamHⅠ和ClaⅠ切断上述表达质粒pPG912和pPG922后，收集所产生的约1.5kb DNA片段，并引入用BamHⅠ和ClaⅠ切开的表达载体pT7-7(Proc.Natl.Acid.Sci.，USA，821074-1078，1985)中，以制备pTG11和pTG12。然后，用BamHⅠ切开pTG11和pTG12，用T4DNA聚合酶处理，就引起自链合，以制备pTG110和pTG120。这表明HIV蛋白质区与以带有寡肽的融合蛋白质形式的pPG912和pPG922源完全相同，这种寡肽是在T7启动子控制下由pT7-7产生的。使用蛋白酶加工融合蛋白质，导致产生p24和p15。
使用E.coli菌株JM103(Nucleic Acid Research，9(2)309-321，1981)作为构建质粒的宿主;使用E.coli菌株UT481(Journal of Bacteriology，163376-384，1985)作为pPG912和pPG922蛋白质表达的宿主;使用E.coli菌株BL21(DE3)(Journal of Molecular Biology，189(1)113-130，1986)作为pTG100和pTG120蛋白质表达的宿主。每升E.coli培养液提纯的P24和P15的各自产率示于表1。
实施例11AIDS病毒的高度表达核蛋白质载体的构建用HindⅢ切断实施例10制备的表达质粒pPG912的gag-pol基因，以再产生约0.9kb DNA片段。然后通过该片段以所希望的方位引入表达载体pUR290(The EMBO JOurnal，2(2)1791-1794，1983)的HindⅢ部分制备质粒pPG930。在pPG930中，完全含从HIV-1gag区的P15区到pol基因的蛋白酶区的所有范围的DNA片段在码组中连接到pUR290上的IacZ基因的3′端。HIV基因产物以带β-半乳糖苷酶的融合蛋白质形式表达。这种融合蛋白质借助于移码进行一种基于蛋白酶的加工，导致产生P15核蛋白。
通过上述0.9kb HindⅢ片段以所希望的方位引入表达载体pT7-7的HindⅢ部分制备另外的质粒pTG21。此外，用SalⅠ切断pTG21，并在T4DNA聚合酶处理后，引起自链合而获得pTG210，这表明，相同的HIV蛋白质区象pPG930的HIV蛋白质区一样，是以带有在T7启动子控制下由pT7-7产生的寡肽的融合蛋白质形式。这种融合蛋白质通过移码进行一种基于蛋白酶表达的加工，于是产生P15。
使用菌株JM103作为构建质粒的宿主;使用菌株UT481作为pPG930蛋白质表达的宿主;使用菌株BL21(DE3)作为pTG210蛋白质表达的宿主。每升E.coli培养液提纯的P15的相应产率示于表1。
表1每升培养液提纯的蛋白质的产率表达质粒 宿主 P24(mg) P15(mg)pPG912 UT481 5 0.7pPG922 UT481 5 -pPG930 UT481 - 1pTG110 BL21(DE3) 19 3pTG120 BL21(DE3) 10 -pTG210 BL21(DE3) - 5测定提纯的P24和P15的N末端氨基酸顺序为Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Leu-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His-Gln-Ala-Ile-……(对于P24)，Ile-Gln-Lys-Gly-Asn-Phe-Arg-Asn-Gln-Arg-Lys-Thr-Val……(对于P15)，因此，与由各自核苷酸顺序预测的氨基酸顺序一致。
实施例12通过培养转化体提取AIDS病毒核心蛋白质P24转化体克隆UT481/pPG922于37℃、在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基(1W/V%Bacto胰胨、0.5W/V%Bacto酵母提取物和1W/V%NaCl)中培养18小时，然后将1/100体积加到新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中，并在37℃温度下预培养。当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG(异丙基-硫代半乳糖苷Sigma〔美国〕制造)，并在37℃温度下继续培养8小时。通过离心分离(5000rpm，10分钟)收集细菌细胞，并悬浮在50mmol磷酸钠(pH7.0)中，在超声波处理(5个3分钟脉冲，19.5kHz，300W)后，用离心分离(19000rpm，60分钟)分离上清液。
P24的粗提纯将硫酸铵加到原提取液中，以便达到35%的饱和，然后在搅拌后，将通过离心分离(16000rpm，20分钟)获得的沉淀物溶入30ml20mmol丙二酸钠(pH5.3)并在所形成的液体中渗析。
P24的提纯使渗析的样品通过用20mmol丙二酸钠(pH5.3)平衡的MonoS柱(Pharmacia〔瑞典〕制造)，并用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱。汇集含P24的馏分并逆着20mmol tris-HCl缓冲剂(pH8.4)渗析。在渗析后，将该液施加到用上述缓冲剂平衡的MonoQ柱(Pharmacia〔瑞典〕制造)上，并用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱，以获得提纯的P24。
实施例13提取P15转化体克隆BL21(DE3)/pTG210于37℃、在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基中培养18小时，然后将1/100体积加到新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中，并在37℃培养。当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG，在37℃继续培养5小时。收集细菌细胞并悬浮在1/50体积的20mmol磷酸钠(pH7.0)中，并在超声波处理(6个30秒脉冲，19.5kHz，300W)后，用离心分离(19000rpm，60分钟)分离上清液，作为原提取液。
P15的粗提纯将硫酸铵加到原提取液中，以便达到60%的饱和，在搅拌后，该混合物进行离心分离(16000rpm，20分钟)。将所得到的沉淀物溶解到20mmol磷酸钠缓冲剂(pH7.0)中，然后逆着相同的缓冲剂渗析。
P15的提纯将渗析的样品施加到用20mmol磷酸钠(pH7.8)平衡的磷酸纤维素柱(Wattman〔英国〕制造)上，然后用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱。汇集含P15的馏分并逆着20mmol磷酸钠缓冲剂(pH7.0)渗析。将渗析的样品施加到羟磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.制造)上，并用梯度为20-70mmol的磷酸钠洗脱。将含P15的馏分汇集并逆着20mmol磷酸钠缓冲剂(pH7.0)渗析。然后将这种样品施加到MonoS柱上，用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱。汇集含P15的馏分，以获得提纯的P15。
实施例14携带AIDS病毒gag-pol基因的表达质粒的构建用HindⅢ切断HIV-1原病毒DNA克隆pNL4-3，并将得到的约1.2kb DNA片段插入克隆载体pHSG398(Takara Shuzo〔日本〕制造)的HindⅢ部分，以制备pNLH122。用BglⅡ和HindⅢ切断这个pNLH122，并将所得到的约1.03kb DNA片段插入用BamHⅠ和HindⅢ切开的M13mp19(Takara Shuzo制造)中，以制备Gag19·(Bg-H)。序顺GAG在紧接Gag19·(Bg-H)上的gag基因的起动密码子之前借助于寡核苷酸定向体外诱变系统Version 2(Amersham〔英国〕制造)转变成CAT，并将制备的Gag19·(Nde)重新引入其NdeⅠ位置。用NdeⅠ和PstⅠ切断Gag19·(Nde)，并将所得到的0.63kb DNA片段插入用NdeⅠ和PstⅠ切开的PT7-7中，以制备pTG541。此外，将实施例10中制备的pPG912和pPG922用PstⅠ切断，将所得到的约1.2kb DNA片段分别插入pTG541的PstⅠ部分并以所希望的方位与PstⅠ连接，这样构建的质粒分别称为pTG591和pTG592。在pTG591和pTG592中，完全含从T7启动子控制下的gag基因的起动密码子到pol基因的蛋白酶区的整个范围的DNA片段被连接。在pTG591中，所表达的HIV蛋白质通过移码进行一种基于共同表达的蛋白酶加工，于是产生大量的P17、P24和P15。在pTG592中，所表达的HIV蛋白质不通过移码进行一种基于共同表达的蛋白酶加工，产生大量P17和P24。
菌株JM103用作构建质粒的宿主，而菌株BL21(DE3)用作蛋白质表达的宿主。
实施例15高度表达AIDS病毒的基质蛋白质的载体的构建首先，将实施例14中制备的pTG591用NsiⅠ和ApaⅠ切断，在用S1核酸酶处理后，引起自链合。当gag基因的Nsi部分的N-末端和Apa部分的C-末端在码组中被融合时，表达缺少从P24中间部分到P15中间部分的Gag蛋白质和Gag-pol蛋白质，并被认为是进行基于含在Gag-Pol蛋白质中的蛋白酶加工，于是产生P17。从上述操作获得的克隆中，选择表达加工P55Gag蛋白质活性和产生大量P17活性的克隆，并命名为pTG691。
用BglⅡ切断后，用T4DNA聚合酶处理pTG591，然后进一步用PstⅠ切断。收集产生的约0.52kb DNA片段。另一方面，用NsiⅠ、S1核酸酶和PstⅠ顺序处理pTG591，并收集产生的约2.9kb DNA片段。从通过连接这两种DNA获得的许多克隆中，选择表达加工P55Gag蛋白质和产生大量P17活性的克隆，并命名为pTG681。
用SphⅠ和ApaⅠ切断pTG591，在用T4DNA聚合酶处理后，引起自链合，以制备pTG171。
用SphⅠ和ApaⅠ切断pTG592，在用T4DNA聚合酶处理后，引起自链合，以制备pTG172。
用EcoRⅠ和PstⅠ切断实施例14制备的Gag19·(Nde)，并将所得到的0.76kb DNA片段插入用EcoRⅠ和PstⅠ切开的M13mp18中，以制备Gag18·(Bg-P)。将Gag18·(Bg-P)上的gag基因的第133密码子CCT用体外诱变转变成TAA，以制备具有在编码P17区后立即插入的终止密码子的Gag18·TAA。用NdeⅠ和PstⅠ切断Gag18.TAA，并将所得到的0.63kb DNA片段插入用NdeⅠ和PstⅠ切开的pT7-7中，以制备pTG52。
通过在pTG691和pTG671中移码及通过在pTG681和pTG172中不移码蛋白酶表达，对缺陷Gag蛋白质和Gap-pol蛋白质进行加工，于是产生大量P17，另外，pTG681翻译后不需要加工而直接产生大量P17。
实施例16提取P17转化体克隆BL21(DE3)/pTG171于37℃、在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基中培养18小时，然后将1/100体积加到新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中并在37℃培养。当培养基的OD600nm达到0.5时，添加1mmol IPTG，并在37℃继续培养5小时。通过离心分离(5000rpm，10分钟)收集细菌细胞，并悬浮在1/50体积的15mmol磷酸钠(pH6.7)中，在超声波处理(6个30秒脉冲，19.5kHz，300W)后，将通过离心分离(19000rpm，60分钟)所获得的上清液分离，作为原提取液。
P17的粗提纯将硫酸铵加到原提取液中，以便达到40%的饱和，搅拌后将混合物离心分离(16000rpm，20分钟)。将硫酸铵加到这样获得的上清液中，以便达到80%的饱和，搅拌后离心分离(16000rpm，20分钟)混合物。将所得到的沉淀物溶入15mmol磷酸钠缓冲剂(pH6.7)中，并逆着相同缓冲剂渗析。
P17的提纯将渗析的样品施加到用15mmol磷酸钠(pH6.7)平衡的S-琼脂糖(Pharmacia〔瑞典〕制造)上。然后用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱样品。汇集含P17的馏分并用15mmol磷酸钠稀释到2倍。将馏分施加到用相同缓冲剂平衡的MonoS柱(Pharmacia制造)上，然后用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱，汇集含P17的馏分，用20mmol磷酸钠(pH7.0)和10mmol 2-巯基乙醇稀释到5倍。将所得到的稀释样品施加到羟磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.〔日本〕制造)上，并用梯度为15-700mmol的磷酸钠洗脱。每升转化体培养液提纯的P17的产率是约4mg。从其中除去N末端上的甲硫氨酸残基的提纯的P17不进行肉豆蔻基化，并具有一种N末端氨基酸顺序Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp……，因此，与由核苷酸顺序预测的氨基酸顺序一致。
实施例17携带HIV-1的nef基因表达质粒的构建用HindⅢ切断HIV-1原病毒DNA克隆pNL4-3，并将所得的约1.5kb DNA片段插入克隆载体pHSG398的HindⅢ部分，以制备pNLH152。用HindⅢ和XhoⅠ切断这个pNLH152。将所得到的约0.72kb XhoⅠ-HindⅢ片段插入用SalⅠ和HindⅢ切开的表达载体pUR292(The EMBO Journal，2(2)1791-1794，1983)中，以制备pNF102。用BamHⅠ和HindⅢ切断这个pNF102，并将所得到的约0.72kb BamHⅠ-HindⅢ片段插入用BamHⅠ和HindⅢ切开的表达载体pT7-7中，以制备pTF103。然后用BamHⅠ切开这个pTF103，在用T4DNA聚合酶处理后，引起自链合，以制备pTN104。上述pNF102高表达嵌合体蛋白质含β-半乳糖苷酶和HIV-1Nef蛋白质的氨基酸的35-206(C末端)的区。上述pTN104高表达嵌合体蛋白质被加到Nef蛋白质的氨基酸的35-206覆盖区的N末端，在该嵌合体蛋白质中肽由pT7-7的多克隆部位衍生的11种氨基酸组成。这些嵌合体蛋白质特别在Western印迹中与来自HIV-1载体的血清反应。在pNF102中使用菌株JM103和菌株UT481，而在pTF104中使用菌株BL(DE3)作为表达宿主。
实施例18高度表达HIV-1Nef蛋白质的载体的构建首先，用HindⅢ和HinCⅡ切断pNLH152，并将所得到的约0.96kb HinCⅡ-HindⅢ片段插入用HinCⅡ和HindⅢ切开的M13m19中，以制备Nef19·(Hc-H)。顺序AAG紧接在Nef19·(Hc-H)上的nef基因的起动密码子之前借助于体外诱变转变成CAT，以制备Nde重新引入其中的Nef19·(Nde)。用NdeⅠ和HindⅢ切断Nef19·(Nde)，并将所得到的约0.82kb NdeⅠ-HindⅢ片段插入用NdeⅠ和HindⅢ切开的表达载体pT7-7中，以制备pT7-Nef。通过pT-Nef引入菌株BL21(DE3)中表达和积累占大于整个细菌蛋白质10%的Nef蛋白质。
实施例19Nef蛋白质的提取和提纯转化体克隆BL21(DE3)/pT7-Nef于37℃、在含20μg氨苄青霉素/ml的LB培养基中培养18小时，然后将1/100体积加到新鲜LB培养基(含20μg氨苄青霉素/ml)中并在37℃培养该混合物。当培养基的OD600nm达到1.0时，添加1mmol IPTG，并继续培养5小时。通过离心分离(5000rpm，10分钟)收集细菌细胞，并悬浮在1/50体积的20mmol磷酸钠中，在超声波处理(6个30秒脉冲，19.5kHz，300W)后，分离由离心分离(19000rpm，60分钟)得到的上清液，作为原提取液。
Nef蛋白质的粗提纯将硫酸铵加入原提取液中，以便达到35%的饱和，在搅拌后，将混合物离心分离(16000rpm，20分钟)。将所得到的沉淀物溶入20mmol磷酸钠缓冲剂中，然后逆着相同的缓冲剂渗析。
Nef蛋白质的提纯将渗析的样品施加到用20mmol磷酸钠(pH7.0)平衡的S-琼脂糖(Pharmacia〔瑞典〕制造)上。然后用梯度为0-1mol的氯化钠洗脱样品，汇集含Nef蛋白质的馏分，然后逆着20mmol磷酸钠(pH7.0)渗析。然后将样品施加到羟磷灰石柱(KB柱，Koken，Ltd.制造)上，并用梯度为20-700mmol磷酸钠洗脱。汇集含Nef蛋白质的馏分并逆着20mmol tris-HCl(pH8.3)和5mmol 2-巯基乙醇渗析。将该样品施加到MonoQ柱上，并用梯度为0-1mol氯化钠洗脱。汇集含Nef蛋白质的馏分，由此制备出提纯的Nef蛋白质。每升转化体培养液提纯的Nef蛋白质的产率是约7mg。
用E.coli大量产生的并从其中去除N末端甲硫氨酸残基而提纯的Nef蛋白质不进行肉豆蔻基化，并呈现出一种N末端氨基酸顺序Gly-Gly-Lys-Trp-Ser-Lys-Ser-Ser-Val-Ile-Gly-Trp-Pro-Ala-Val……，因此，与由核苷酸顺序预测的氨基酸顺序一致。
实施例20用提纯的Nef蛋白质诊断HIV-1感染将实施例19制备的提纯Nef蛋白质按照实施例2所述的方法在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并在硝化纤维膜上进行印迹。为了封闭，将膜浸入3W/V%明胶溶液中。接着，用Weseern印迹技术研究在人HIV-1载体(7个对象)血清中抗HIV-1Nef蛋白质抗体的存在。类似地研究健康成年人(9个对象)。结果示于表2。
7个HIV-1载体中的6个血清同Nef蛋白质阳性反应。这就提出，通过使用由Escherichia chli制备的提纯HIV-1蛋白质能够有效地检查和诊断HIV-1感染的存在。
表2使用提纯的Nef蛋白质通过Western印迹诊断HIV-1感染对象反应性＊HIV-1载体的人血清 1 +＊＊2 +3 +4 +5 +6 +7 ±健康成年人的人血清 1 +2 ±3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -
＊对提纯Nef蛋白质的特殊免疫反应。
＊＊通过Western印迹技术测定反应性。显示阳性(+)反应和阴性(-)反应。
本发明应用于基于遗传工程的医用品和诊断剂的生产领域，以及作为象分子生物学、病毒学、医学、药理学、兽医学和免疫学这样的领域的研究用试剂。
权利要求
1.一种制备具有逆病毒基因表达能力和翻译后具有加工能力的质粒的方法，它包括的步骤是通过将所制备的以致至少含蛋白酶基因区的逆病毒基因CDNA片段插入DNA，以链合方式形成，所述DNA选自由高度表达基因和基因直接表达载体构成的组。
2.一种如权利要求1所述的制备质粒的方法，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
3.一种具有逆病毒基因表达能力和翻译后具有加工能力的质粒，它包括通过将所制备的以致至少含蛋白酶基因区的逆病毒基因CDNA片段插入DNA，以链合方式形成，所述DNA选自高度表达基因和基因直接表达载体构成的组。
4.一种如权利要求3所述的质粒，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
5.具有逆病毒基因表达能力和翻译后具有加工能力的质粒表达产物，它包括通过将所制备的以致至少含蛋白酶基因区的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以链合方式形成，所述DNA选自由高度表达基因和基因直接表达载体构成的组。
6.如权利要求5所述的质粒表达产物，其中上述逆病毒是AIDS病毒。
7.如权利要求5或6所述的质粒表达产物，其中上述表达产物至少是一种选自由用gag和pol基因编码的核心蛋白质和酶构成的组。
8.一种通过将所制备的以致至少含HIV nef基因区的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以链合方式形成的质粒，所述DNA选自由高度表达基因和基因直接表达载体构成的组。
9.一种质粒表达产物，该质粒通过将所制备的以致至少含HIV nef基因区的逆病毒基因cDNA片段插入DNA，以链合方式形成，所述DNA选自由高度表达基因和基因直接表达载体构成的组。
全文摘要
本发明提供一种制备具有逆病毒基因表达能力和翻译后加工能力的质粒的方法和产生的质粒及其表达产物。
文档编号C12N15/69GK1058044SQ9110456
公开日1992年1月22日 申请日期1991年5月28日 优先权日1990年5月28日
发明者斉藤敦, 品川日出夫, 中田笃男 申请人:阪大微生物病研究会