专利名称：人SP－A1在pichia pastoris中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA的重组技术，特别是涉及人肺表面活性物质相关蛋白人SP-A1在Pichia pastoris中的表达。
肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)是肺II型细胞合成、分泌的一种脂蛋白复合物，其主要功能是降低肺泡表面张力，保持肺泡扩张，防止肺萎陷，维持正常呼吸生理活动，该复合物由磷脂和蛋白质组成，其中90％为磷脂，以二棕榈酰卵磷脂(DPPC)和磷脂酰甘油(PG)为主，8～10％为肺表面活性物质相关蛋白(surfactant-associated protein，SP)，分为SP-A、SP-B、SP-C和SP-D等，以SP-A含量最为丰富，约占总蛋白量的50％。SP-A是一种多功能糖蛋白，在调节肺表面活性物质的代谢、SP基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有十分重要的作用。
SP-A是一种亲水糖蛋白，单体分子量大约为32Ku，可因其糖基化数目不同，波动在28～36Ku之间，等电点pH4～5。单体SP-A分为4个不连续的区域短的氨基端球状结构区、富含羟基脯氨酸的胶原样区(CLR)、与磷脂结合的疏水区和羧基凝集素糖识别区(CRD)。人类SP-A基因位于第10号染色体长臂中部，SP-A基因全长约5kb，含有7个外显子，其中4个外显子的部分或全部为编码序列。SP-A基因包含着一个基因家族—SP-AI、II和伪基因，与两个功能基因相对应的cDNA为6A和1A，两者在核酸水平有94％的同源性，在氨基酸水平有96％的同源性，非常相似。每一个功能基因都编码一种SP-A蛋白前体，分子量约为200～250Ku，需经一系列翻译后修饰得到唾液酸糖蛋白。成熟的人SP-A肽链有2型(SP-AI、SP-AII)，两者同源性达96％，仅有6个氨基酸残基不同。SP-AI与SP-AII以2∶1的比例缠绕成一个亚基，6个三螺旋结构亚基又通过共价键和非共价键连接在一起，形成一个分子量约为700Ku的具有生物活性的大分子。在肺泡内表面，SP-A多以18聚体的形式存在，呈一束花状，主茎由胶原样区构成，花叶则是植物凝集素样区。
临床所使用的SP-A均为动物肺组织或人羊水提取物，由于提取工艺的不完善，水溶性SP-A大量丢失，制约了PS的功能及SP-A的应用。另一方面，由于蛋白质的免疫原性，SP-A药品不能象PS磷脂组分一样由动物肺组织提取，由人肺组织和羊水提取也在数量和伦理上明显受限。
迄今为止，所有在原核细胞表达系统表达活性SP-A的努力均告失败，在哺乳动物细胞表达系统表达非人SP-A的研究虽有成功的报导，但尚无人SP-A的基因工程产品报道。
本发明的目的是利用真核表达系统Pichia pastoris生产大量、高活性的人SP-A1。
本发明中的人SP-A1基因是根据论文“肺表面活性物质结合蛋白AcDNA克隆及序列分析”中所记载的内容克隆得到的，该文献源自《中华儿科》杂志2000，38(3)，P153。
本发明中的表达载体为pPIC9K，也可以是相应酵母胞内及分泌表达载体。
本发明中的宿主细胞为Pichia pastoris。
本发明首先将人SP-A1基因克隆至表达载体中，通过电击转化技术转入P.pastoris，并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子，用高表达的甲醇氧化酶1基因(AOX1)启动子、可利用甲醇作为唯一碳源诱导对重组P.pastoris进行表达。其具体步骤为1.人SP-A1基因克隆。
2.通过转化、质粒抽提、酶切等方法筛选重组的阳性克隆，并进行序列分析。
3.表达载体的构建及序列测定，以保证翻译读框的正确。
4.基因整合的鉴定。
5.表达产物的鉴定。
6.表达产物的活性测定。
由于本发明采用甲醇营养型酵母表达系统，因此，具有如下优点(1)应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控；(2)表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；(3)表达产物分拣进入过氧化物酶体等有利于纯化；(4)能进行翻译时/后的修饰。
通过对表达产物的鉴定可知，人SP-A1在P.Pastoris中成功地获得表达，而且表达的目的蛋白质能对巨噬细胞杀伤病原体发挥调理作用。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的限制性酶切图。
图2是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的PCR。
图3是克隆至T载体用T7和SP6引物测序图。
图4是SP-A1在Saccharomyces cerevisiae S-78及Pichia pastoris GS115中的表达12％SDS-PAGE。
图5是SP-A1经HPLC纯化的目的峰。
图6是SP-A1的Western杂交检测。
图7是SP-A调理肺巨噬细胞对大肠杆菌J5的杀伤率。
实施例本实施例中所涉及的质粒pPIC9K、酵母菌株Pichia postoris GS115、KM71、SMD1168、GS115 Albumin、GS115 β-Gal均购自Invitrogen公司。
本实施例中所涉及的用于扩增目的基因SP-A和鉴定转化子的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。
本实施例中所涉及的主要酶类及试剂包括DNA限制内切酶、T4DNA连接酶、Taq酶购自大连宝生物工程有限公司和华美生物有限公司，酵母裂解酶、G418、玻璃珠购自Sigma公司。
本实施例的操作步骤如下1.培养基YPD、MGY、MGYH、RD、RDH、RDB、RDHB、MD、MDH、MM、MMH、BMG、BMM、BMGY、BMMY所需试剂均为市售，其浓度按说明配制。
2.SP-A1基因表达载体的构建 设计扩增引物(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’用重组质粒pUC19/SP-A1作为模板扩增人SP-A1基因，PCR产物用SnaB I和EcoR I酶切后纯化目的片段与相同酶切的pPIC9K连接，构建pPIC9K/SP-A1。
3.E.coli JM109感受态的制作及转化在平板挑取E.coli JM109或TOP10F’单菌落于2ml的LB中，37℃，250rpm振荡培养10～12小时，取0.5ml种子液接种于50ml的LB中，37℃，250rpm培养至A600为0.6，约需1.5～2.0h；置培养物于冰上10min，移入50ml离心管中，4℃，4000rpm离心5min；弃上清，加入15ml浓度为0.1mol/L的预冷(4℃)CaCl2悬浮细胞，冰浴30min；4000rpm，4℃离心10min回收细胞，弃上清，加入2ml预冷CaCl2悬浮细胞，冰浴备用；取100μl感受态细胞，加入10μl连接液，混匀，冰浴30min；42℃热休克90秒，迅速放回冰中2min，加入500μl LB培养液37℃培养1h；取150μl培养液涂布于含氨苄青霉素50～100μg/ml的LB平板，37℃倒置培养12小时。筛选目的重组子，其中含重组质粒pPIC9K/SP-A1。
4.重组质粒的鉴定在含氨苄青霉素100μg/ml的LB平板挑取单菌落置于含氨苄青霉素50-100μg/ml的LB中，振荡培养10～12小时；按常规碱裂解方法或纯化试剂盒提取质粒；用限制性内切酶SnaB I和EcoR I进行酶切鉴定；酶切正确的质粒用α因子引物(+)5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC3’(-)5’CAAATGGCATTCTGACATCC3’扩增，进行序列分析，确保读框及序列正确。
5.质粒的准备将正确构建的重组质粒pPIC9K/SP-A1及亲本质粒pPIC9K在大肠杆菌JM109或TOP10F’中扩增，用质粒抽提试剂盒提取所需的质粒，然后用Sal I进行限制性酶切，使之完全线性化，0.8％琼脂糖电泳后用胶回收试剂盒回收线性化质粒溶于1×TE中。
6.酵母菌株的转化分别挑取P.pastoris GS115、SMD1168和KM71单菌落，接种于5ml的YPD置于50ml三角瓶中，30℃培养10小时，取50～100μl接种于50mlYPD中，振荡培养16小时至A600＝1.3～1.5；4℃离心1500g×5min，沉淀用50ml预冷的灭菌ddH2O重悬；同前离心，沉淀用25ml预冷的灭菌ddH2O重悬；同前离心，沉淀用5ml预冷的1M山梨醇重悬；同前离心，沉淀用1.5ml预冷的1M山梨醇重悬备用；将酵母感受态细胞分装为80μl/份；5～20μg的线性化DNA加入感受态酵母菌株中，转移至0.2cm的电极杯，置冰上5分钟；用Bio-Rad GenePulser进行电击转化，其参数为1500V、25μF、400Ω，立即加入预冷的1M山梨醇1ml，200～600μl/份涂MD和RDB选择平板，置28℃培养48h至转化子出现。
7.多拷贝整合事件的筛选(1)采用无菌操作技术在96孔培养板的每孔加入200μl YPD，每孔接种一个转化子，并使菌体悬浮于YPD培养基中，置于30℃培养2天；(2)分别取种子液10μl接种于另一96孔培养板各含有200μl YPD相应的培养孔，30℃培养1天；(3)重复步骤(2)一次；(4)取10μl接种于含G418终浓度分别为0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0mg/ml的YPD或MD固体培养板，待液体完全吸附后，置30℃培养，于接种后2，3，4，5天观察生长菌落，抗性越高，整合的拷贝数越多。
8.筛选GS115His+Mut+/His+Muts表型用Sal I线性化质粒转化GS115或SMD1168菌株，产生的重组菌株可以存在两种表型His+Mut+/His+Muts表型，用GS115 Albumin和GS115β-Gal分别作为His+Muts、His+Mut+的对照，而KM71仅有His+Muts表型。
(1)挑取在MD或RDB平板上的单菌落分别依次接种在MM和MD平板上，以GS115/β-Gal和GS115/Albumin作为对照。30℃培养36～48小时。
(2)根据菌落在MM和MD生长的速度不同判断其表型，MM和MD平板生长良好为His+Mut+表型，MD平板生长良好而MM平板生长缓慢或不生长为His+Muts表型。
9.酵母总DNA的提取将培养16小时的培养液(重组菌和亲本GS115、KM71、SMD1168)1.5ml移至Eppendorf管，离心30秒，弃上清；沉淀中加入45μl裂解酶缓冲液重悬，加入5μl酵母裂解酶，振荡后于37℃孵化1h，不时进行振荡；加入10μl蛋白酶K，振荡数秒，55℃孵化15min，不时振荡；加入5μl RNase A，常温下放置15min；加入500μl抽提液，振荡，常温下放置10min，不时振荡；离心，12000～16000r/min×2min，沉淀细胞脆片，将上清移入GFX柱中，5000g×1min倒掉收集管中液体，重新将吸附柱放至收集管中，加入500μl抽提液，8000r/min×1min倒掉收集管中液体，加入500μl洗涤溶液，12000～16000r/min×3min；移去收集管，将吸附柱放至无菌Eppendorf管中，加入200μl的洗脱缓冲液或灭菌ddH2O，室温放置1min；8000r/min×1min，收集纯化的DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
10.酵母整合的PCR分析设计如下反应体系10×PCR buffer 5μlGenomic DNA(～1μg)5μl100mM dNTP(25mM each) 1μl5’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μl3’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μlTaq Polymerase(5U/μl) 0.25μlddH2O加至总体积为50μl重组质粒作为阳性对照，相应的空质粒作为另一个对照，其热循环参数如表1所示。
表1 热循环参数步骤温度时间循环数Hot Start 94℃2min 1Denaturation 94℃1minAnnealing 55℃1min25Extension 72℃1minFinal Extension72℃7min 1取10μl样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
11.重组P.pastoris的表达挑取His+Mut+单菌落，置于盛有25ml的BMG的250ml摇瓶中，28℃、250r/min培养至A600＝2～6(约16～18h)，常温下1500～3000g×5min离心沉淀菌体，去上清，用BMMY重悬菌体至A600＝1.0(约200ml)，置于1000ml的摇瓶中96h，分别于0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样1ml，离心取上清储存-80℃待进一步电泳分析。每24h加100％甲醇至培养基中使终浓度为0.5％，维持诱导表达。
12.SDS-PAGE分析取各个时间点的样品融化并置于冰上，旋转蒸发或超滤浓缩样品至原体积的1/5～1/10，等体积加入电泳上样缓冲液，煮沸10min，上样进行12％SDS-PAGE电泳。余样品置于-20℃备用，上清置于-80℃留待进一步分析。
13.SP-A1在P.pastoris中的表达及产物纯化上述表达获得的上清经旋转蒸发(冷冻干燥SentryTMVirTis公司)浓缩至1/5～1/10，以固体Tris调pH至6.5离心除去沉淀的杂蛋白后，经Sephadex G-25层析柱分批脱盐，收集蛋白洗脱液(约25ml)，经Sepharose 4B和Sephadex G-75层析。
14.高效液相色谱(HPLC)纯化产物经C-8柱纯化，用乙晴和水洗脱，于20min处得到蛋白峰。
15.Western杂交接常规方法处理蛋白质样品并进行SDS-PAGE；电泳完成后，拆卸凝胶夹层，去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30min.；准备硝酸纤维素膜(NC膜)，按凝胶大小但比凝胶大约1mm，成45°角慢慢将凝胶放入蒸馏水中，水将会渗入膜中并湿润整个表面。然后在转移缓冲液中平衡10～15min；在塑料转移盒的底边，依次将下面物品组装转印夹层海绵、数张剪切得如凝胶大小的滤纸，并预先以转移缓冲液湿润凝胶、NC膜、数张已湿润的滤纸、海绵，组装过程注意排除所有气泡；往转移槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中，连接电源；在冷却条件下100V电转移30～60min，拆卸转印装置，取出NC膜，并在膜上剪一小角作为标记；凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转移效率；将膜放入可热密封的塑料袋，加5ml封闭液，密封塑料袋，在旋转摇床或摆动平台中摇动30～60min；用封闭液稀释鼠抗人SP-A(1∶3000)；倾去封阻液，加入稀释的第一抗体，4℃过夜；带着手套从塑料袋中取出NC膜，放在塑料盒中摇动，用20ml PBST洗涤4次，每次10～15min；用PBS稀释HRP标记羊抗鼠IgG(1∶5000)；将NC膜放进新的塑料袋子，37℃ 1h，取出NC膜，室温下以PBS洗膜15min去除过量的磷酸盐和Tween20；将膜放入发色底物显色液，条带在10～30min内出现；用蒸馏水洗膜，终止反应，晾干后拍照或直接拍照。
16.SP-A1的调理作用(1)鼠巨噬细胞的分离肺巨噬细胞按文献Journal of Infectiousdiseases 1995；172(2)P481中报道的方法由无特殊病原体的雄性大鼠中分离，重悬在A缓冲液，该缓冲液的组成为140mM NaCl、5mM KCl、2.5mMNa2PO4、10mM HEPES、2mM MgSO4、6mM葡萄糖、2mM CaCl2、0.1％明胶(wt/vol)，pH为7.4。悬液中肺巨噬细胞终浓度为107细胞/ml。
(2)SP-A的准备天然猪SP-A和重组的SP-A1(酿酒酵母P1和P.pastoris P2)溶解于5mM HEPES，pH为7.4，分成若干份保存于-70℃备用。
(3)细菌培养E.coli J5分别培养于LB培养基中，37℃振荡培养过夜，常温下离心，3000g×2min收集细菌，用A缓冲液洗涤3次，离心，2500g×10min，A缓冲液重悬，荧光分光光度计测定使其终浓度为5×108cfu/ml。
(4)细菌杀伤实验在有或无SP-A和/或肺巨噬细胞存在时，实验其吞噬杀伤活性。采用细菌/巨噬细胞比为1∶1，保证细菌被有效地摄取，不同剂量SP-A加入至混合液中，终体积为200μl，轻度晃动，37℃孵化30min，加入预冷的ddH2O中止吞噬和杀伤作用，用等体积的LB稀释后涂琼脂平板，37℃培养过夜，计数克隆。三、结果1.pPIC9K/SP-A1重组表达载体的鉴定用SnaB I和EcoR I限制性酶切分析发现可切出目的片段，如
图1所示，
图1中的1为DNAMarkers，2、3为pPIC9K，4、5为pPIC9K/SP-A1。重组质粒及亲本质粒经α因子引物扩增分别得到936bp和188bp的片段，如图2所示，图2中的1～3为pPIC9K/SP-A1，4为Markers，5～6为pPIC9K。克隆至T载体用T7和SP6引物测序结果，序列及读框完全正确，如图3所示，由此说明已成功构建pPIC9K/SP-A1表达载体。
2.酵母转化结果用Sal I线性化质粒转化的GS115，其表型为HIS4Mut+有167个菌落，表型为HIS4+Muts有28个菌落，二者之比约6∶1，可见所获得的转化子绝大部分是利用AOX1启动子的快速生长型。转化SMD1168获得类似的结果。G418浓度为3.0mg/ml时宿主为GS115、SMD1168和KM71的转化子分别有23、18、21个。
3.SP-A1在P.pastoris中的诱导表达重组菌株在甲醇浓度为0.1～1.0％(g/ml)时表达，甲醇浓度0.5％时诱导表达效果最佳，培养72h，蛋白质达到最大表达量，即150mg/L，不同菌株其表达量范围为0mg/L～150mg/L。SP-A1在Saccharomyces cerevisiaeS-78及Pichia postoris GS115中的表达12％SDS-PAGE如图4所示，其中，1为Protein Markers，2为SP-A1(S-78)，3为SP-A1(GS115)。
4.产物的纯化表达产物经Sephadex G-25、Sepharose 4B和SephadexG-75得到大小约为32kD的目的蛋白质。
5.HPLC纯化后得到目的峰如图5所示。
6.用抗SP-A的抗体进行Western杂交检测利用ELISA方法分别检测天然SP-A及基因表达产物的免疫原性，可见两反应曲线的特征相似，都是典型的S型曲线，表明SP-A1的抗原特性与天然SP-A的相同，图6所示为表达在Pichia pastoris中的SP-A1的Western杂交，其中，1为pPIC9K/GS115，2为pPIC9K-SP-A1/GS115。
7.SP-A的调理作用37℃孵化30min，观察在有或无肺巨噬细胞和SP-A存在时细菌成活率，肺巨噬细胞单独杀伤率为5.6％±2％，当加入SP-A时杀伤效率明显增加，而SP-A本身对细菌无影响，SP-A调理肺巨噬细胞对大肠杆菌J5的杀伤率如图7所示。
权利要求
1.人SP-A1在Pichia pastoris中的表达，其特征是将人SP-A1基因克隆至表达载体中，通过电击转化技术转入P.pastoris，并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子，用高表达的甲醇氧化酶1基因(AOX1)启动子、利用甲醇作为唯一碳源诱导对重组P.pastoris进行表达。
2.根据权利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表达，其特征是在所述的人SP-A1基因表达载体的构建中，所设计的扩增引物为(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’。
3.根据权利要求1或2所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表达，其特征是所述的电击转化参数为1500V、25μF、400Ω。
4.根据权利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表达，其特征是所述的甲醇浓度为0.1～1.0％(g/ml)。
5.根据权利要求4所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表达，其特征是所述的甲醇浓度最佳值为0.5％(g/ml)，培养时间为72h。
全文摘要
本发明公开了人SP－Al在Pichia.pastoris中的表达,该方法将人SP－Al基因克隆至表达载体中,通过电击转化技术转入Pichia.pastoris,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子,用高表达的甲醇氧化酶1基因(AOXl)启动子、利用甲醇作为唯一碳源诱导对重组P.pastoris进行表达;在所述的诱导表达中,甲醇浓度为0.1～1.0%(g/ml)。本发明能生产大量、高活性的人SP－Al,其最大表达量可达150mg/L,而且所表达的目的蛋白质能对巨噬细胞杀伤病原体发挥调理作用。
文档编号C12N15/12GK1372001SQ01107600
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者封志纯, 兰和魁 申请人:珠江医院