新型单子叶植物基因及其用途的制作方法

专利名称：新型单子叶植物基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中的广谱病害抗性、包括系统获得性抗性(SAR)的现象。更具体地说，本发明涉及与可导致植物中系统获得性抗性(SAR)的信号转导级联相关的NIM1基因单子叶同源物的鉴定、分离和表征。
植物经常受到包括病毒、细菌、真菌和线虫在内的各种致病生物体的攻击。农作物植物特别脆弱，因为它们通常生长成遗传上一致的单种栽培物；当病害发作时，损失可能是严重的。然而，大部分植物具有其抵抗致病生物体的先天机制。植物培育者和病理学家已经鉴定了对植物病原体具有抗性的天然变化形式并将其培育成许多农作物植物。这些天然病害抗性基因通常提供了抵抗病原体的高水平抗性或免疫性。
系统获得性抗性(SAR)是一种用于自身抵抗病原体的复合系统植物的组成部分(Hunt和Ryals，1996；Ryals等，1996)。另外参见美国专利号5,614,395。SAR是植物病原体反应的一个特别重要的方面，因为它是病原体诱导的对包括病毒、细菌和真菌在内的广谱感染性病原体的系统抗性。当SAR信号转导途径被阻断时，植物变得对通常导致病害的病原体更为敏感，且它们对不经常导致病害的某些感染性病原体也变得敏感(Gaffney等，1997；Delaney等，1994；Delaney等，1997；Bi等，1995；Mauch-Mani和Slusarenko，1996)。这些观察结果表明SAR信号转导途径对维持植物健康是关键的。
在理论上，SAR反应可以被分成两个阶段。在初始阶段中，识别病原体感染且释放通过韧皮部传输到远端组织的信号。这种系统性信号被因SAR基因和病害抗性的表达而起反应的靶细胞觉察。SAR的维持期是指从数周到植物的整个生命期的时间期限，在此过程中该植物是准稳态的且病害抗性得到控制(Ryals等，1996)。
水杨酸(SA)的累积看起来是SAR信号转导所需的。不能因用特异性抑制剂处理，即，苯丙氨酸解氨酶的后生阻抑或特异性降解SA的水杨酸羟化酶的转基因表达而累积SA的植物也不能诱导SAR基因表达或病害抗性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusaerenko，1996；Maher等，1994；Pallas等，1996)。尽管已经建议SA可以用作系统性信号，但是目前这是有争议的；且迄今为止，确切已知所有情况是如果SA不能累积，那么SAR信号转导将被阻断(Pallas等1996；Shulaev，1995；Vernooij等，1994)。
近来，拟南芥属(Arabidopsis)已经表现出可作为研究SAR的模型系统(Uknes等，1992；Uknes等，1993；Cameron等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1994；Dempsey和Klessig，1995)。已经证实拟南芥属中的SAR可以被病原体和诸如SA、2，6-二氯异烟酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)这样的化学药品所激活(Uknes等，1992；Vernooij等，1995；Lawton等，1996)。在用INA或BTH进行处理或病原体感染后，至少三种与病理相关的(PR)蛋白质基因即PR-1、PR-2和PR-5同时被诱导且伴随抗性发作(Uknes等，1992，1993)。在烟草中，用病原体或免疫化合物处理的最佳特征化物种诱导至少9组基因的表达(Ward等，1991)。通过用不同的SAR基因转化植物已经产生了转基因病害抗性植物(美国专利号5,614,395)。
尽管对SAR的大量研究已经在双子叶植物中进行，也在单子叶植物中证实了SAR。例如，已在稻中证实了SAR，其中由P.s.pv syringae诱导的感染造成了针对叶胚病原体Pyricularia oryzae的系统性保护(Smith和Metranx，1991)；在大麦和小麦中，对由白粉病原体Erysiphe gramins的事先感染导致对E.graminis的保护增强(Schweizer等，1989；Hwang和Heitefuss，1992)。化学诱导的对INA之抗性已经在大麦中证实(Kogel.等，1994；Wasterhack等1994)。近来，显示BTH在小麦中诱导对E.graminis、Pucciniarecondita和Septoria sp.的获得性抗性；以及对一些新植物基因转录的积累之诱导，所述基因在病原体感染期被诱导(Grlach，等1996)。
已经分离出了具有改良的SAR信号转导的大量拟南芥属突变体(Delaney，1997)。这些突变体中最重要的是所谓的lsd(病变模拟病害)突变体和acd2(加速的细胞死亡)(Dietrich等，1994；Greenberg等，1994)。这些突变体均在其叶上具有一定程度的自发性坏死病变形成、SA水平升高、SAR基因的mRNA累积和病害抗性显著提高。已经分离并表征了至少7种不同的lsd突变体(Dietrich等；1994；Weymann等，1995)。另一种有意义类型的突变体是cim(组成型免疫)突变体(Lawton等，1993)。另外参见美国专利号5,792,904和国际PCT申请WO 94/16077。类似于lsd突变体和acd2，cim突变体具有升高的SA和SAR基因表达和抗性，不过，与lsd或acd2相反，在其叶上不会表现出可检测到的病变。cpr1(PR基因的组成型表达子)可以是一类cim突变体；然而，因为尚未消除cpr1叶上存在的显微病变，所以cpr1可能是一类lsd突变体(Bowling等，1994)。
已经分离了在SAR信号传输中被阻断的突变体。ndr1(非物种特异性病害抗性)是一种使含有不同无毒力基因的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和寄生霜霉(Peronospera parasitica)的一般无毒性分离物生长的突变体(Century等；1995)。显然这种突变体在SAR信号传输中的早期被阻断。npr1(PR基因的非表达子)是一种不能在INA处理后诱导SAR信号途径表达的突变体(Cao等，1994)。已经根据eds(增强的病害敏感性)突变体在接种低浓度细菌后维持细菌感染的能力分离了它们(Glazebrook等，1996；Parker等，1996)。某些eds突变体在表型上非常类似于npr1且近来已经证实eds5和eds53是npr1的等位基因(Glazebrook等，1996)。nim1(非诱导型免疫)是一种在用INA处理后维持寄生霜霉(即霜霉病致病病原体)生长的突变体(Delaney等，1995；美国专利号5,792,904)。尽管nim1可以在病原体感染后累积SA，但是它不能诱导SAR基因表达或病害抗性，这提示这种突变阻断了SA下游的途径。nim1在其对INA或BTH反应的能力上也受到了削弱，这提示在这些化学药品作用的下游存在阻断作用(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。
已经分离并表征了拟南芥属的等位基因，它们的突变体分别对nim1和npr1表型负责(Ryals等，1997；Cao等，1997)。野生型NIM1基因产物与导致拟南芥属中SAR和基因对基因病害抗性的信号转导级联有关(Ryals等，1997)。Ryals等，1997还报导了nim1的另外5种等位基因的分离方法，这些等位基因显示出在化学诱导的PR-1基因表达和真菌抗性方面从每周削弱到被强力阻断的一系列的表型。将野生型NPR1基因转化成npr1突变体不仅补充了突变，从而恢复了SAR诱导作用对PR-基因表达和病害抗性的反应性，而且在没有SAR诱导作用存在的情况下赋予了所述的转基因植物对丁香假单胞菌导致的感染更高的抗性(Cao等，1997)。WO 98/06748中描述了从拟南芥属中分离NPR1和从Nicotiana glutinosa中分离同源物的方法。另外参见WO 97/49822、WO 98/26082和WO 98/29537。此外，美国专利申请09/265,149(Salmeron等人)描述了NIM1基因烟草(Nicotiana tabacum)、Lycopersicon esculentum(蕃茄)、Brassicanapus(油籽油菜)和拟南芥同源物的分离。
尽管作了大量研究且应用了包括植物的遗传转化在内的完善和深入细致的农作物保护措施，但是每年因病害导致的损失仍保持在10亿美元。因此，存在对开发基于植物中病害抗性的遗传基础不断增加的了解的新的农作物保护措施的持续需求。特别地，存在对鉴定、分离和表征来自其它植物物种特别是单子叶植物的NIM1基因同源物的需求。
本发明通过提供几种来自单子叶植物物种的拟南芥属NIM1基因同源物而满足了上述需求。特别地，本发明涉及NIM1基因的小麦(Triticum aestivum)(小麦)和稻(Oryza sativa)(稻)的同源物的分离，这些同源物编码认为与信号转导级联有关的蛋白质，所述的信号转导级联对可导致植物中系统获得性抗性的生物和化学诱导物敏感。
因此，本发明涉及一种分离的核酸分子，它包括来自单子叶植物的NIM1基因同源物的核苷酸序列。
在一个特定实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子，它包括编码SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的分离的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括核苷酸序列的分离的核酸分子，所述的核苷酸序列在序列中包括与SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的至少20、25、30、35、40、45或50个(优选20个)连续碱基对部分相同的至少20、25、30、35、40、45或50个(优选20个)连续的碱基对部分。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括核苷酸序列的分离的核酸分子，可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物对从单子叶植物DNA文库扩增所述的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括核苷酸序列的分离的核酸分子，可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物对从稻DNA文库扩增所述的核苷酸序列；在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括核苷酸序列的分离的核酸分子，可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物对从小麦DNA文库扩增所述的核苷酸序列；在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括核苷酸序列的分离的核酸分子，可以使用聚合酶链反应，采用含有SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的编码序列(CDS)之前20个核苷酸和最后20个核苷酸之反向互补物的引物对，从单子叶植物DNA文库扩增所述的核苷酸序列。
在又一实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子，其含有来自单子叶植物的核苷酸序列，其能在严格杂交和洗涤条件下与SEQ IDNO1、7、9、11、13、15、17或19的互补物杂交。
本发明还包括一种嵌合基因，它包括在植物中具有活性的与本发明NIM1同源物编码序列可操作地连接的启动子；本发明还包括含有这类嵌合基因的重组载体，其中所述的载体能够稳定地转化入宿主且可以用这类载体稳定地转化宿主。优选所述的宿主是诸如下列农学上重要的农作物之一的植物水稻、小麦、大麦、黑麦、canola、甘蔗、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黄瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、洋李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和糖甘蔗。本发明还包括来自本发明植物的种子。
此外，本发明涉及一种增加植物中SAR基因表达的方法，该方法通过在所述植物中表达自身含有在植物中具有活性的与本发明NIM1同源物编码序列可操作地连接的启动子的嵌合基因来进行，其中在转化的植物中以高于野生型植物的水平表达所编码的蛋白质。
此外，本发明涉及一种提高植物中病害抗性的方法，该方法通过在所述植物中表达自身含有在植物中具有活性的与本发明NIM1同源物编码序列可操作地连接的启动子的嵌合基因来进行，其中在转化的植物中以高于野生型植物的水平表达所编码的蛋白质。
此外，本发明涉及一种选自SEQ ID NO3或4的PCR引物。
本发明还包括一种用于分离与可导致植物中系统获得性抗性的信号转导级联相关的NIM1同源物的方法，该方法包括使用引物对的聚合酶链反应从单子叶植物DNA文库扩增DNA分子，其中所述的引物对相当于SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19编码序列(CDS)的前20个核苷酸和最后20个核苷酸的反向互补物；或所述的引物对表示为SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6。在一个优选的实施方案中，所述单子叶植物DNA文库是稻和小麦的DNA文库。
SEQ ID NO1-来自小麦的NIM1同源物的基因组DNA序列。
SEQ ID NO2-由SEQ ID NO1编码的小麦NIM1同源物的蛋白质序列。
SEQ ID NO3-寡核苷酸引物KL1。
SEQ ID NO4-寡核苷酸引物KL2。
SEQ ID NO5-PCR引物NIM 2B。
SEQ ID NO6-PCR引物NIM 2D。
SEQ ID NO7-由稻A扩增的498bp NIM-样DNA片段，它是13个序列的共有区且与拟南芥MIM1基因序列具有59％的序列同一性。
SEQ ID NO8-由SEQ ID NO7编码的蛋白质序列。
SEQ ID NO9-由稻B扩增的498bp NIM-样DNA片段，它与拟南芥NIM1基因序列具有62％的序列同一性。
SEQ ID NO10-由SEQ ID NO9编码的蛋白质序列。
SEQ ID NO11-由小麦扩增的498bp NIM-样DNA片段，它是3个序列的共有区且与拟南芥NIM1基因序列具有55％的序列同一性。
SEQ ID NO12-由SEQ ID NO11编码的蛋白质序列。
SEQ ID NO13-来自稻A的NIM1同源物的全长cDNA序列，它与SEQ ID NO7的PCR片段一致。
SEQ ID NO14-由SEQ ID NO13编码的稻NIM1同源物的蛋白质序列。
SEQ ID NO15-来自稻B的MM1同源物的部分cDNA序列，它相应于SEQ ID NO9的PCR片段。
SEQ ID NO16-由SEQ ID NO15编码的稻NIM1同源物的蛋白质序列。
SEQ ID NO17-来自小麦的NIM1同源物的全长cDNA序列，它相应于SEQ ID NO11的PCR片段。
SEQ ID NO18-由SEQ ID NO17编码的小麦NIM1同源物的蛋白质序列。
SEQ ID NO19-来自相应于小麦的NIM1样基因组序列pHW01(SEQ ID NO1)的全长cDNA序列。
SEQ ID NO20-由SEQ ID NO19编码的蛋白质序列。
在描述本发明的过程中，使用下列术语且这些术语的定义如下所示。
相关/可操作地连接指的是物理或功能相关的两个DNA序列。例如，认为启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”，条件是这两个序列可操作地连接或定位以使调节DNA序列影响编码或结构DNA序列的表达水平。
嵌合基因一种重组DNA序列，其中启动子或调节DNA序列可操作地与编码mRNA或表达为蛋白质的DNA序列连接或相关，使得调节DNA序列能够调节相关DNA序列的转录或表达。嵌合基因的调节DNA序列通常不与在自然界中发现的相关的DNA序列可操作地连接。
编码序列转录成诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA这样的RNA的核酸序列。优选随后在生物体中翻译所述的RNA以便产生蛋白质。
互补指的是包括反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，所述的反平行核苷酸序列能够在反平行核苷酸序列中的互补碱基对残基之间形成氢键时彼此配对。
表达指的是植物中内源性基因或转基因的转录和/或翻译。例如，就反义构建体而言，表达可能指的仅是反义DNA的转录。
表达盒能够指导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中的表达的核酸序列，它包括与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述的感兴趣的核苷酸序列与终止信号可操作地连接。它一般还包括适当翻译所述核苷酸序列所需的序列。包括感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，即其成分中的至少一种相对于其其它成分中的至少一种而言是异源的。该表达盒还可以是一种天然存在但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，一般来说，该表达盒相对于宿主而言是异源的，即所述表达盒的特定核酸序列不会在宿主细胞中天然存在且必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或仅当宿主细胞接触某些特定的外部刺激物时启动转录的诱导型启动子的控制下进行。就诸如植物这样的多细胞生物体而言，所述的启动子对特定的组织或器官或发育阶段也具有特异性。
基因位于基因组内且除上述编码核酸序列外还包括对控制编码部分的表达、即转录和翻译来说是必不可少的其它主要调节核酸序列的确定区。基因还可以包括其它的5’和3’未翻译序列和终止序列。可以存在的其它元件例如是内含子。
异源DNA序列本文所用的术语“异源DNA序列”、“外源DNA片段”或“异源核酸”各自指的是来源于对特定宿主细胞而言是外来的来源的序列或如果来自相同来源那么是根据其原始形式修饰的序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞而言是内源性的但例如已经通过应用DNA改组修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多拷贝。因此，该术语指的是一种DNA片段，它对所述细胞而言是外源的或异源的或与所述细胞同源但位于通常未发现所述元件的所述宿主细胞核酸内的某一位置上。表达外源DNA片段以便产生外源性多肽类。
同源DNA序列天然与引入其中的宿主细胞相关的DNA序列。
同类编码当核酸序列编码与由参比核酸序列编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽时，该核酸序列与参比核酸序列为同类编码。
分离的在本发明的上下文中，分离的核酸分子或分离的酶是一种脱离其天然环境存在且因此不是天然产物的受人控制的核酸分子或酶。分离的核酸分子或酶可以以纯化形式存在或可以存在于诸如例如重组宿主细胞这样的非天然环境中。
最小启动子启动子元件、特别是TATA元件，它们是无活性的或在没有上游激活的情况下具有显著降低的启动子活性。在有合适的转录因子存在的情况下，最小启动子的功能是启动转录。
天然的指的是存在于未转化细胞基因组中的基因。
天然存在的术语“天然存在的”用于描述与由人通过人工方式生产不同的能在自然界中发现的物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列是天然存在的，它们可以分离自天然来源且没有被人在实验室中进行过人为修饰。
NIM1Ryals等，1997中描述的基因，它与SAR信号转导级联有关。
NIM1由NIM1基因编码的蛋白质。
核酸术语“核酸”指的是脱氧核苷酸或核糖核苷酸及其单或双链形式的聚合物。除非另有限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，它们与参比核酸具有相似的结合特性且以与天然出现的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列无疑还包括其保守修饰的变化形式(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。具体地，可以通过生成其中一种或多种选择的(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)195081(1991)；Ohtsuka等，《生化杂志》(J.Biol.Chem.)2602605-2608(1985)；Rossolini等，《分子细胞探针》(Mol.Cell.Probes)891-98(1994))。也可以将术语“核酸”或“核酸序列”与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。在本发明的上下文中，核酸分子优选是DNA片段。核苷酸由下列标准缩写的其碱基来表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)。
ORF可读框。
植物任何完整的植物。
植物细胞植物的结构和生理单位，它包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养的细胞形式，或作为诸如例如植物组织、植物器官或完整植物这样的较高组织化单位的一部分。
植物细胞培养物植物单位培养物，诸如例如原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同发育阶段的胚。
植物材料指的是叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。
植物器官植物明显的和可见的结构和分化部分，诸如根、茎、叶、花芽或胚。
植物组织组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物或培养物中的植物的任何组织。本术语包括但不限于完整植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何组的植物细胞。该术语连同如上所述的或由本定义包括的任何特殊类型的植物组织一起使用或在没有如上所述的或由本定义包括的任何特殊类型的植物组织的情况下使用并不排除任何其它类型的植物组织。
启动子含有RNA聚合酶II的结合位点并启动DNA转录的编码区上游的未翻译的DNA序列。启动子区还可以包括起基因表达调节物作用的其它元件。
原生质体不含细胞壁或仅含部分细胞壁的分离的植物细胞。
纯化的术语“纯化的”在用于核酸或蛋白质时指的是基本上不含其它在天然状态下与其相关的细胞成分的核酸或蛋白质。优选它是在同源状态下，不过，它可以处于无水的或含水的溶液中。一般使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析这样的分析型化学技术来测定纯度和均匀性。属于存在于制品中的主要物质的蛋白质基本上是纯化的。术语“纯化的”指的是核酸或蛋白质在电泳凝胶中主要产生一条带。特别地，它指的是核酸或蛋白质的纯度至少约为50％、更优选纯度至少约为85％且最优选纯度至少约为99％。
重组DNA分子使用重组DNA技术彼此连接的DNA分子的组合。
调节元件在控制核苷酸序列表达中所涉及的序列。调节元件包括可操纵地与感兴趣的核苷酸序列和终止信号连接的启动子。它们一般还包括正确翻译所述核苷酸序列所需的序列。
选择性标记基因其在植物细胞中的表达使细胞产生选择优势的基因。用选择性标记基因转化的细胞所具有的选择优势可能是由于与未转化细胞的生长相比它们在有诸如抗生素或除草剂这样的负选择剂存在情况下的生长能力所造成的。与未转化的细胞相比，转化细胞所具有的选择优势也可能是由于它们将添加的化合物用作营养物、生长因子或能源的增强的或新的能力所造成的。选择性标记基因还指其在植物细胞中的表达使细胞产生负的和正的选择优势的基因或基因组合。
显著提高大于测定技术中固有的误差限度的酶活性的提高，优选在有抑制剂存在的情况下使野生型酶的活性提高约2倍或2倍以上、更优选提高约5倍或5倍以上且最优选提高约10倍或10倍以上。
就两种或多种核酸或蛋白质序列而言所用的术语“相同”或“同一性”百分比指的是当进行最大相应性比较和序列对比时相同或具有规定的氨基酸残基或核苷酸百分比的两种或多种序列或亚序列，正如使用下列序列对比算法或通过目测检查所测得。
基本上相同就两种核酸或蛋白质序列而言所用的术语“基本上相同”指的是当进行最大相应性比较和序列对比时具有至少60％、优选80％、更优选90-95％且最优选99％的核苷酸或氨基酸残基同一性的两种或多种序列或亚序列，正如使用下列序列对比算法或通过目测检查所测得的。在至少约50个残基长的序列区内、更优选在约100个残基区内存在基本的同一性且最优选在约150个残基内序列基本上相同。在一个最优选的实施方案中，序列在全长编码区内基本上相同。此外，基本上相同的核酸或蛋白质序列具有基本上相同的功能。
为了进行序列比较，一般一个序列起参比序列的作用，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要指定亚序列等同物并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法以指定的程序参数为基准计算出测试序列与参比序列相比较的序列同一性百分比。
例如，可以通过下列方法进行用于比较的序列最佳排列Smith &waterman的局部同源性算法《数学应用发展》(Adv.Appl.Math.)2482(1981)；Needleman & Wunsch的同源性序列对比算法《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)443(1970)；Pearson & Lipman的相似性方法检索《美国国家科学院院报》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)852444(1988)；这些算法的计算机化应用(Wisconsin GeneticsSofware Package中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测检查(通常参见Ausubel等，参见下文)。
适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，它描述在Altschul等的《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)215403-410(1990)中。公众可以通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过确定查询序列中长度W的短词来确定主要划线的序列对(HSPs)，当用数据库序列中相同长度的词进行序列对比时，它们与某些正值阈值得分T相适应或满足它们。T指的是邻近词得分阈值(Altschul等，1990)。命中这些起始的邻近词为启动检索程序打下基础以便找到含有它们的更长的HSPs。然后沿各序列的两个方向扩展命中的词，直到累积的序列对比得分得到增加为止。就核苷酸序列而言，使用参数M(配对残基对的有利结果得分；总＞0)和N(错配残基的不利结果得分；总＜0)来计算累积得分。就氨基酸序列而言，将得分矩阵用于计算累积得分。当累积序列对比得分从其获得的最大值下降到X量时停止在各方向上扩展命中词，累积得分达到0或0以下，这是因为累积了一种或多种负得分的残基序列对比或达到各序列的末端所导致的。BLAST算法的参数W、T和X确定了序列对比的敏感性和速度。BLATN程序(就核苷酸序列而言)使用词长度(W)为11、期望值(E)为10、截止值为100、M＝5、N＝4和两链比较作为默认值。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用词长度(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62得分矩阵作为默认值(参见Henikoff& Henikoff《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915(1989)。
除计算序列同一性百分比外，BLAST算法还进行了两种序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin & Altschul《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个测定值是最小的和数概率(P(N))，它产生了一个概率的示数，通过该示数也许会出现两个核苷酸或氨基酸序列之间的配对。例如，如果在测试核酸序列与参比核酸序列进行比较过程中的最小和数概率约小于0.1、更优选约小于0.01且最优选约小于0.001，那么认为测试核酸序列与参比序列相似。
两个核酸序列基本上相同的另一种表示方式是两个分子在严格条件下彼此杂交。术语“特异性地与…杂交”指的是分子仅与特定的核苷酸序列在严格条件下的结合、双重组合或杂交，此时所述的序列存在于复合的混合物(例如总细胞)DNA或RNA中。“基本上结合”指的是探针核酸与靶核酸之间的互补杂交且包括可以通过降低杂交培养基的严格性而容纳的最小错配以便实现对靶核酸序列进行所需检测。
就诸如DNA杂交和Northern杂交这样的核酸杂交实验而言所用的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”具有序列依赖性且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列特别在较高的温度下杂交。关于核酸杂交的广泛指导原则可以在下列文献中找到Tijssen(1993)《生化实验室技术和分子生物学-使用核酸探针的杂交》(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes)第1部分第2章“杂交原理和核酸探针测定策略的综述”(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)，Elsevier，New York。一般来说，就在规定的离子强度和pH下的特定序列而言，将高度严格杂交和洗涤条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。一般来说，在“严格条件”下探针与其靶亚序列杂交而不与其它序列杂交。
Tm是50％的靶序列与完好配对探针杂交的温度(在指定的离子强度和pH下)。将非常严格的条件选择为等于特定探针的Tm。用于在DNA或RNA印迹中的滤膜上杂交具有100个以上互补残基的互补核酸的严格杂交条件的一个实例是在42℃下50％甲酰胺与1mg肝素杂交，其中将杂交过程进行过夜。高度严格的洗涤条件的一个实例是在72℃下用0.15M NaCl洗涤约15分钟。一个洗涤条件的一个实例是在65℃下用0.2×SSC洗涤15分钟(参见下文Sambrook对SSC缓冲液的描述)。通常在高度严格性洗涤前是低度严格性洗涤以便除去背景探针信号。就双链体、例如100个以上核苷酸而言，中度严格性洗涤的一个实例是在45℃下用1×SSC洗涤15分钟。就双链体、例如100个以上核苷酸而言，低度严格性洗涤的一个实例是在40℃下用4-6×SSC洗涤15分钟。就短探针(例如约10-50个核苷酸)而言，严格条件一般包括在pH 7.0-8.3下盐浓度低于约1.0 M Na离子、一般约为0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)且温度一般至少约为30℃。还可以通过添加诸如甲酰胺这样的去稳定剂来实现严格条件。一般来说，在特定杂交测定试验中对不相关探针所观察到的2倍(或2倍以上)的信噪比表明了检测特异性杂交。如果核酸编码的蛋白质基本上相同，那么在严格条件下无法彼此杂交的核酸仍基本上相同。例如，这种情况在使用遗传密码所允许的最大密码简并产生核酸拷贝时发生。
下面是可以用于克隆基本上与本发明参比核苷酸序列相同的同源核苷酸序列的杂交/洗涤条件组的实例参比核苷酸序列与参比核苷酸序列优选在50℃下的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中杂交、其中在50℃下用2×SSC洗涤；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交、其中在50℃下用1×SSC、0.1％ SDS洗涤；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交、其中在50℃下用0.5×SSC、0.1％ SDS洗涤；优选在50℃下的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交、其中在50℃下用0.1×SSC、0.1％ SDS洗涤；更优选在50℃下的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交、其中在65℃下用0.1×SSC、0.1％ SDS洗涤。
两种核酸序列或蛋白质基本上相同的进一步证明方式是由第一种核酸编码的蛋白质与由第二种核酸编码的蛋白质发生交叉免疫反应或特异性地与之结合。因此，一种蛋白质通常与第二种蛋白质基本上相同，例如，其中两种蛋白质的区别仅在于保守取代。
术语“特异性地(或选择性地)与抗体结合”或“特异性地(或选择性地)与…发生免疫反应”在涉及蛋白质或肽时指的是结合反应是在有蛋白质和其它生物制品的异源群体存在的情况下蛋白质存在的决定因素。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性抗体结合特定的蛋白质而不以显著量结合存在于样品中的其它蛋白质。在这类条件下与抗体的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白质的特异性来选择的抗体。例如，可以选择针对具有由本发明任何核酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质产生的抗体以便获得与该蛋白质发生特异性免疫反应而不与除多态变体外的其它蛋白质发生免疫反应的抗体。可以将多种免疫测定方式用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，通常将固相ELISA免疫测定法、蛋白质印迹或免疫组织化学法用于选择与蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane((1988)《抗体-实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Publications，New York“Harlow和Lane”)对可以用于测定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述。一般来说，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少2倍且更常见的是背景的10-100倍以上。
特定核酸序列的“保守修饰的变化形式”指的是编码相同或基本上相同的氨基酸序列或其中核酸序列不编码氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传密码的简并性，所以大量功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在用密码子表示的精氨酸的每一位上，可以将密码子改变成任何相应的所述密码子而不会改变所编码的蛋白质。这类核酸变化形式是“沉默变化形式”，它们是“保守修饰变化形式”的一个种类。除非另有说明，编码蛋白质的本文所述的每个核酸序列也描述了每一种可能的沉默变化形式。本领域技术人员认为可以修饰核酸中的各密码子(ATG除外，它通常仅是甲硫氨酸的密码子)以便通过标准技术得到功能相同的分子。因此，编码蛋白质的核酸的各“沉默变化形式”在各所述序列中是隐含的。
此外，本领域技术人员认识到在所编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或较小百分比的氨基酸(一般低于5％、更常见的是低于1％)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变化形式”，其中这种改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。下列5组中各包含属于相互保守取代的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外参见Creighton(1984)《蛋白质》(Proteins)，W.H.Freeman和Company。此外，在所编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或较小百分比的氨基酸的各个取代、缺失或添加也是“保守修饰的变化形式”。
“亚序列”指的是分别包括核酸或氨基酸的较长序列(例如蛋白质)的一部分的核酸或氨基酸序列。
当将其它核苷酸(或其它类似分子)引入核酸时核酸是“延长的”。最常见的是使用聚合酶(例如DNA聚合酶)、例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶进行该过程。
当将来自两种核酸中每一种的序列在子代核酸中组合时两种核酸被“重组”。当这两种核酸是用于重组的底物时可“直接”重组两条序列。当使用诸如交换寡核苷酸这样的中间体重组所述序列时可“间接重组”两条序列。就间接重组而言，仅仅一条序列是用于重组的真正底物且在某些情况下两条序列都不是用于重组的底物。
例如配体和受体这样的两种分子之间的“特异性结合亲和力”指的是在分子混合物中一种分子对另一种分子的优先结合。如果结合亲和力约为1×104M-1-约1×106M-1或1×106M-1以上，那么可以将该分子的结合看作是特异性的。
转化一种用于将异源DNA引入宿主细胞或生物体的过程。
“转化的”、“转基因的”和“重组的”指的是诸如细菌或植物这样已经引入了异源核酸分子的宿主生物体。核酸分子可以被稳定地整合入宿主的基因组或也可以作为染色体外分子存在。这类染色体外分子可以是自体复制的。认为转化的细胞、组织或植物不仅包括转化过程的终产物而且包括其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指的是例如细菌或植物这样不含异源核酸分子的野生型生物体。
根据有关国际公认的用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约，已经将下列材料保藏在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA。对所保藏材料的可得到性的所有限制在专利授权后最终将被取消。
克隆保藏号保藏日pHW01NRRL B-301521999年7月1日本发明涉及单子叶NIM1同源物，诸如那些从小麦和稻中分离的。如下面实施例中更详细的描述，本发明的单子叶NIM1同源物可从cDNA和/或基因组DNA文库中分离，方法是利用WO 00/53762中所述的烟草NIM1cDNA片段探查，此处引入该文献作为参考。
此外，可从单子叶植物cDNA和/或基因组DNA文库中分离，方法是通过PCR扩增，利用基于拟南芥、烟草和蕃茄的NIM1以及来自拟南芥的NML序列构建的引物(见，实施例5“简并性引物的设计”，WO 00/53762)。
此外，本发明的单子叶NIM1同源物可通过PCR方法分离，其中利用基于所附序列表中的序列之小麦和稻序列构建的PCR引物。例如，可以将具有SEQ ID NO19(例如SEQ ID NO10的核苷酸1-20和1649-1668)的大约前和最后20-25个连续核苷酸的用作构建PCR引物的基础，以便从来自植物来源(小麦)的cDNA文库直接扩增cDNA序列(SEQ ID NO19)。同样可以使用序列表中所示的DNA序列末端作为PCR引物基础，通过PCR从单子叶植物的cDNA或基因组DNA文库中扩增本发明的其它DNA序列。
据推定本文所述的NIM1基因同源物编码对生物和化学诱导物敏感的信号转导级联中所涉及的蛋白质，所述的信号转导级联可在植物中产生系统获得性抗性。本发明还涉及单子叶植物中这类NIM1同源物的转基因表达以便增加SAR基因表达并增强病害抗性。
据推定在植物中转基因表达本发明的NIM1同源物可使一系列广泛的植物病原体产生免疫性，所述的植物病原体包括但不限于病毒或类病毒，例如烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒或坏死病毒、天竺葵叶卷曲病毒、红色三叶草环斑病毒、番茄丛矮病毒等病毒；真菌，例如卵菌诸如寄生疫霉和烟草霜霉；细菌，例如丁香假单胞菌和烟草野火病假单胞菌(Psendomonas tabacina)；昆虫、诸如蚜虫，例如桃短尾蚜；和鳞翅目，例如Heliothus的种类；以及线虫，例如南方根结线虫。本发明的载体和方法对大量玉米病害生物体来说是有用的、包括但不限于霜霉诸如；大孢指疫霉、Sclerophthora rayissiae、禾生指梗霉、Pernosclerospora sorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerospora sacchari和Peronosclerospora maydis；锈菌诸如高粱柄锈菌、多堆柄锈菌和Physopella zeae；其它真菌诸如Cercosporazeae-maydis、禾生刺盘孢、串珠镰孢、玉蜀黍赤霉、Exerohilumturcicum、玉蜀黍球梗孢、禾白粉菌、壳针孢属和Bipolaris maydis；和细菌诸如斯获氏欧文氏杆菌。
本发明的方法可以用于将病害抗性赋予各种植物，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。尽管可以使属于这些宽类别的任何植物产生病害抗性，但是它特别适用于农学上重要的农作物植物，诸如水稻、小麦、大麦、黑麦、油菜、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、南瓜、绿皮密生西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、芒果、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
可以将本发明的单子叶NIM1同源物编码序列插入为植物设计的表达盒以便使用标准遗传工程技术构建本发明的嵌合基因。对适合于实现所选植物宿主中所需模式和水平的表达的诸如启动子、信号序列、5，和3’未翻译序列和增强子这样的特异性调节序列的选择属于本领域普通技术人员的水平范围内。可以将含有在合适读框中连接的各个元件的所得分子插入能够转化至宿主植物细胞的载体中。
能够在植物或植物细胞中起作用的启动子的实例(即那些能够启动相关编码序列表达的启动子、诸如那些编码植物细胞中NIM1同源物的启动子)包括拟南芥属和玉米遍在蛋白质启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S或35S启动子和CaMV双启动子；水稻肌动蛋白启动子；来自烟草、拟南芥属或玉米的PR-1启动子；胭脂氨酸合酶启动子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(ssuRUBISCO)启动子等。特别优选的是拟南芥属遍在蛋白质启动子。可以修饰启动子自身以便控制启动子强度，从而按照本领域已知的方法提高相关编码序列的表达。优选用于本发明的启动子是那些产生高水平组成型表达的启动子。
可以使信号或转运肽类与本发明的嵌合DNA构建体中的单子叶NIM1同源物编码序列融合以便使所表达的蛋白质定向转运至所需的作用部位。信号肽类的实例包括那些与植物发病机理相关蛋白质天然连接的信号肽，例如PR-1、PR-2等。参见，例如Payne等，1988。转运肽类的实例包括诸如那些在Von Heijne等(1991)、Mazur等(1987)和Vorst等(1988)中所述的叶绿体转运肽类；以及诸如那些在Boutry等(1987)中所述的线粒体转运肽类。另外还包括使所编码的蛋白质集中于诸如液泡这样的各种细胞区室中的序列。例如，参见NeuhauS等(1991)和Chrispeels(1991)。
本发明的嵌合DNA构建体可以含有本发明的多拷贝的启动子或多拷贝的NIM1同源物编码序列。此外，该构建体可以包括标记物的编码序列和诸如信号或转运肽类这样的其它肽类的编码序列，它们各自在带有DNA分子中的其它功能元件的合适的读框中。这类构建体的制备方法属于本领域普通技术人员的水平范围内。
有用的标记物包括提供除草剂、抗生素或药物抗性的肽类，诸如例如耐原卟啉原氧化酶抑制剂、潮霉素、卡那霉素、G418、庆大霉素、洁霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、膦丝菌素等。可以将这些标记物用于从未转化的细胞中筛选用本发明嵌合DNA构建体转化的细胞。其它有用的标记物是可以通过例如颜色反应这样的可肉眼观察的反应方便检测的肽酶，例如荧光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。
可以用多种已知方法将诸如本文所述的那些用于植物表达的嵌合基因引入植物细胞。本领域技术人员会理解对方法的选择可能取决于为转化而靶向的植物(即单子叶植物或双子叶植物)和/或细胞器(即细胞核、叶绿体、线粒体)的类型。转化植物细胞的适宜方法包括微量注射(Crossway等，1986)、电穿孔(Riggs等，1986)、农杆菌属介导的转化(Hinchee等，1988；Ishida，1996)、定向基因转移(Paszkowski等，1984；Hayashimoto等，1990)和使用获自Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin and Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware的装置进行的冲击粒子加速(参见，例如美国专利4,945,050和McCabe等，1988)。另外参见Weissinger等(1988)；Sanford等(1987)(洋葱)；Christou等(1988)(大豆)；McCabe等(1988)(大豆)；Datta等(1990)(水稻)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Fromm等(1990)；和Gordon-Kamm等(1990)(玉米)；Svab等(1990)(烟草叶绿体)；Gordon-Kamm等(1993)(玉米)；Shimamoto等(1989)(水稻)；Christou等(1991)(水稻)；Datta等(1990)(水稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(鸭茅属和其它Pooideae)；Vasil(1993)(小麦)；Weeks等(1993)(小麦)；Wan等(1994)(大麦)；Jahne等(1994)(大麦)；Umbeck等(1987)(棉花)；Casas等(1993)(高粱)；Somers等(1992)(燕麦)；Torbert等(1995)(燕麦)；Weeks等(1993)(小麦)；WO 94/13822(小麦)；和Nehra等(1994)(小麦)。在Koziel等(1993)、Hill等(1995)和Koziel等(1996)中可以找到通过微粒轰击将重组DNA分子引入玉米的一组特别优选的实施方案。另一个优选的实施方案是公开在EP0 292 435中的玉米的原生质体转化方法。
一旦将包括单子叶NIM1同源物编码序列的嵌合基因转化入特定的植物物种，则可以使用传统的育种技术使之在该物种中繁殖或将其移入相同物种的其它的变种、特别包括商品变种中。本发明特别优选的植物包括上面所列的农学上重要的农作物。通过有性繁殖来传递上述基因工程的转基因种子和植物的遗传特性且这些特性由此可以在子代植物中得到维持和传播。
根据Zabarovsky和Turina，1988从K802裂解物中分离λ噬菌体DNA。9个阳性候选物中，6个与3’NIM1和5’NIM1探针均杂交，方法是限制性消化的λDNA Southern印迹。然后将杂交DNA片段克隆入pUC19载体(NEB)。
通过引物步行(primer walking)利用在ABI 3948 DNA合成仪上设计的18mer确定克隆HW01的DNA序列。用Big Dye Terminator序列测定反应测定HW01模板的序列，每次反应采用400ng模板。根据DT50-30程序确定循环条件95℃-10秒，50℃-5秒，60℃4分钟，共29个循环。热循环条件程序后，用异丙醇沉淀反应。将样品上样于聚丙烯酰胺凝胶并在ABI377自动序列测定仪上分析。
也将模板HW01经历Primer Island程序，籍此将模板在Qiagen机器人(Robot)中制备，并在96孔Marsh孔板块形式(Marsh plateblock format)中测序。用于孔板测序的引物为来自Primer Island试剂盒的正向和反向引物。分析测序数据，并利用Phred/Phrap和Consed程序装配。
来自部分λ克隆#8的亚克隆DNA序列之一称为pHW01，其带有4270bp SacI插入片段，并鉴定为拟南芥NIM1基因的小麦同源物(Ryals等，1997)。小麦NIM1同源物的翻译氨基酸序列是基于HW01的反向序列(i-HW01)，其中NIM1同源物的方向与拟南芥NIM1序列相同。小麦NIM1氨基酸序列与WO 00/53762的SEQ ID NO1烟草NIM1同源物有77/68％氨基酸相似性/相同性，与WO 00/53762的SEQ ID NO3番茄NIM1同源物有78/68％氨基酸相似性/相同性，与拟南芥NIM1同源物有65/61％氨基酸相似性/相同性(Ryals等，1997)，且分别与烟草、番茄和拟南芥NIM1基因有69％、69％和59％的核苷酸相似性(参见下面的表1和表2)。
表1 NIM1同源物的氨基酸比较(相似性/同一性)
表2 NIMI同源物的核苷酸比较
小麦NIM1同源物的基因组序列示于SEQ ID NO1，且其编码的蛋白质示于SEQ ID NO2。含有SEQ ID NO1的小麦NIM1同源物作为pHW01于1999年7月1日保藏NRRL(1815 North UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604，美国)的大肠杆菌DH5α中，保藏号NRRLB-30152。实施例2小麦NIM1同源物的PCR扩增使用PCR证实小麦NIM1同源物来自小麦基因组。分别相应于来自pHW01亚克隆序列的核苷酸1871-1890和核苷酸2360-2340的引物KL1(19nt5’-CCATTGCTACTCTTGCCTC-3’)(SEQ ID NO3)和KL2(21nt，5’-ATCGTTGTCTCCCTTTTAACC-3’)(SEQ ID NO4)用于引发PCR反应，利用小麦UC703基因组DNA作为模板。循环条件为94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，总共35个循环。得到约500bp条带并克隆。具有正确插入片段大小的克隆经测序显示从小麦基因组中扩增了3种不同的序列。所有三种不同的序列彼此高度相似，且其中一个序列与相应的HW01区域之排比非常相似，显示HW01事实上来自小麦基因组。本发明的小麦NIM1同源物因此可通过PCR从小麦基因组文库中利用上述PCR引物KL1和KL2通过PCR分离。实施例3通过Southern印迹分离单子叶NIM1同源物利用Dellaporta等(1983)的微型制备方法从单子叶植物中分离DNA。根据标准方法(Amersharm)进行Southern印迹。相应于NIM1特异性的“NIM环”之小麦NIM1同源物的DNA序列(I-HW01的核苷酸2180-3251，从pHW01分离的1.1kb NdeI/BglII片段)与小麦(c.v.UC703)基因组DNA和其他单子叶作物(如稻、大麦和玉米)杂交。优选的杂交在65℃于杂交缓冲液中(5X SSPE，5XDenhards，0.5％SDS，100μg stDNA/ml)进行，洗涤优选在如下条件进行(i)2X SSPE，0.1％SDS，室温下10分钟；(ii)0.2X SSPE，0.1％SDS，65℃15分钟；和(iii)0.1X SSPE，0.1％SDS，65℃15分钟，每次洗涤进行两次。测试的单子叶作物显示与小麦NIM1序列的强杂交信号，表明这些作物中存在NIM1同源物。在小麦基因组DNA中的杂交信号表明至少在小麦基因组中存在4中NIM1同源物。
用PCR引物KL1和KL2(分别为SEQ ID NO3和4)获得的来自小麦基因组DNA的PCR产物用于探查小麦RNA的凝胶印迹。与总RNA杂交显示一种弱转录。但是，与polyA+RNA杂交显示存在两种转录物一种较小，更为丰富的mRNA转录物，和一种较大，不甚丰富的mRNA。较小的转录物相应于总RNA中检测到的大小。两种转录物显示以相同的丰度存在与从叶片组织中分离的RNA中，所述叶片未用BTH处理或用BTH处理了24小时。上述小麦“NIM环”也用作探针。实施例4利用PCR从单子叶作物基因组DNA文库中分离NIM1同源物引物KL1和KL2(分别为SEQ ID NO3和4)用于克隆来自其他单子叶作物的NIM1同源物。利用小麦基因组DNA扩增(实施例2)的相同循环条件，从稻、玉米和大麦基因组DNA中分别扩增了大小约为500bp的条带。克隆并测序了来自稻DNA的PCR产物。发现所以测序的克隆含有相同的插入片段，且插入片段序列显示与拟南芥NIM1和其作物同源物具有强相似性，表明克隆了稻NIM1同源物。实施例5从单子叶作物之cDNA文库中通过PCR分离NIM1同源物基于利用GCG seqweb多重序列排比程序(Pretty，WisconsinGenetics Computer Group)发现的保守性区域设计简并性PCR引物，用于和如下序列比对拟南芥NIM1基因(Ryals等，1997)；拟南芥NIM样(NML)基因组序列AtNMLc5，AtNMLc2，AtNMLc4-1，和AtNMLc4-2；来自烟草(Nicotiana tabacum)和蕃茄(Lycopersiconesculentum)的NIM1序列(见WO 0053762)。基于上述排比，设计简并性PCR引物，用于从包括小麦和稻的其他作物种类中扩增NIM1同源物。由这些保守性区域设计的引物中的两种列在如下表3。引物优选用Genosys Biotechnologies，Inc.(The woodlands，Texas)合成。简并性位置示于表3中，方法是在寡核苷酸的一个位点上注明多于一个的碱基。“取向”表示引物是朝向cDNA的3’端(下游)或是5’端(上游。
表3简并性引物
从小麦和稻中利用cDNA作为模板扩增NIM1同源物DNA片段。简并性引物PCR优选用Ready-To-G0 PCR珠(Amersham，Piscataway，NJ)在GeneAmp PCR系统9700(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)中进行。每次反应中使用5-10ngcDNA，每一引物的终浓度为0.8μM。优选的循环参数如下94℃1分钟；3个循环[94℃30秒；37℃30秒；72℃2分钟]；35个循环[94℃30秒，60℃30秒；72℃2分钟]；72℃7分钟；保持在4℃。反应产物在2％琼脂糖凝胶上分析，切割具有适当大小的DNA片段。从琼脂糖条带利用例如Geneclean III试剂盒(Bio101，Inc.，Carsbad，CA)将DNA片段分离，并利用例如TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)克隆。利用例如CONCERT Rapid Plasmid MiniPrepSystem(Life technologies，Inc.，Rockville，MD)分离质粒，用标准方法测定序列。
利用引物2B和2D，将两个特有的NIM1同源物DNA片段从稻cDNA文库中扩增(SEQ ID NO7和9)，一个特有的NIM 1同源物DNA片段从小麦cDNA文库中扩增(SEQ ID NO11)实施例6全长单子叶NIM1同源物cDNA优选通过使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，PaloAlto，CA)的RACE PCR从NIM1同源物PCR片段中获得相应的cDNA序列上游和下游。优选对至少三种独立的RACE产物的每个5，-或3’-末端测序，以便消除PCR误差。分别将相应于SEQ ID NO7的PCR片段之全长稻NIM 1同源物cDNA序列表示为SEQ ID NO13；将相应于SEQ ID NO9的PCR片段之NIM 1同源物稻cDNA序列表示为SEQ ID NO15；将相应于SEQ ID NO11的PCR片段之全长小麦NIM 1同源物cDNA序列表示为SEQ ID NO17；。
优选通过RACE PCR获得全长小麦NIM1同源物cDNA序列(SEQ ID NO1)，且如SEQ ID NO19所示(SEQ ID NO19的3’端来自cDNA预测程序)II.植物中本发明基因序列的表达可以使用常规的重组DNA技术将本发明的NIM1同源物引入植物细胞。一般来说，这一过程包括使用本领域中公知的标准克隆步骤将本发明的编码序列插入与该编码序列是异源的(即正常情况下不存在的)表达系统。所述载体含有转录和翻译所插入编码蛋白质的序列所必不可少的元件。可以使用本领域中公知的大量载体系统，诸如质粒、噬菌体病毒和其它修饰的病毒。合适的载体包括但不限于病毒载体，诸如λ载体系统λgtl1、λgtl0和卡隆4；质粒载体，诸如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII和其它相似系统。还可以修饰所述表达系统的成分以便增加表达。例如，可以使用截短的序列、核苷酸取代或其它修饰方法。在合适的条件下可以采用本文所述的表达系统转化实际上任何的农作物植物细胞。可以使转化的细胞再生成完整植物，使得单子叶NIM1同源物增加SAR基因表达并提高转基因植物中的病害抗性。实施例7植物表达盒的构建首先在表达盒中将用于转基因植物中表达的编码序列装配在植物中可表达的合适启动子之后。该表达盒还可以包括表达转基因所需或筛选的任何其它序列。这类序列包括但不限于转录终止子；诸如内含子这样促进表达的外部序列；活性序列和用于将基因产物靶向至特定细胞器和细胞区室的序列。然后便利地将这些表达盒转入下述植物转化载体。下面是典型表达盒中各种成分的描述。
1.启动子对表达盒中所用启动子的选择决定转基因植物中转基因的空间和时间分布型。所选择的启动子表达特殊细胞类型(诸如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或特殊组织或器官(例如，根、叶或花)中的转基因，并且这种选择反映出累积基因产物所需的位置。另一方面，所选择的启动子可以在不同诱导条件下启动基因的表达。启动子在其强度即促进转录的能力上是可变的。根据所用宿主细胞系统的不同，可以使用包括基因的天然启动子在内的许多合适启动子中的任何一种。下面是可以用于表达盒中的启动子的非限制性实例。
a.组成型表达、遍在蛋白质启动子遍在蛋白质是一种已知累积在许多细胞类型中的基因产物且已经从用于转基因植物的几个物种中克隆了其启动子(例如向日葵-Binet等人，1991；玉米-Christensen等人，1989；和拟南芥属-Norris等人，1993)。已经在转基因单子叶植物系统中研发了玉米遍在蛋白质启动子且为单子叶植物转化而构建的其序列和载体公开在专利申请EP 0342 926(Lubrizol)中。Taylor等人(1993)描述了包括玉米遍在蛋白质启动子和第一种内含子的载体(pAHC25)及其在通过微射轰击引入时大量单子叶植物的细胞混悬液中的高活性。特别优选将拟南芥属遍在蛋白质启动子用于本发明的NIM1同源物中。这种遍在蛋白质启动子适合于包括单子叶植物和双子叶植物在内的转基因植物中的基因表达。合适的载体是pAHC25的衍生物或在该申请中记载的通过引入合适的遍在蛋白质启动子和/或内含子序列而修饰的任何转化载体。
b.组成型表达，CaMV35S启动子质粒pCGN1761的构建记载在公开的专利申请EP 0392 225(实施例23)中。pCGN1761含有“双”CaMV35S启动子和tml转录终止子(在该启动子和该终止子之间具有单一EcoRI位点)并带有pUC-型主链。构建带有修饰的多接头的pCGN1761衍生物，所述的多接头除包括存在的EcoRI位点外还包括Notl和Xhol位点。将这种衍生物命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX用于克隆其多接头内的cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列)以便在转基因植物中在35S启动子控制下表达所述的序列。可以用与启动子5’连接的Hindlll、Sphl、Sall和Xbal位点和与终止子3’连接的Xbal、BamHl和Bgll位点切割如此构建的完整35S启动子-编码序列-tml终止盒以便转入诸如下述的转化载体。此外，可以通过用Hindlll、Sphl、Sall、Xbal或Pstl进行5’切割并用任何的多接头限制位点(EcoRI、Notl或Xhol)进行3’切割来除去双35S启动子片段，以便用另一启动子进行取代。如果需要，通过引入可以促进翻译的序列来进行克隆位点周围的修饰。这在需要超表达时特别有用。例如，可以如美国专利号5,639,949的实施例37中所述通过使翻译起始位点最佳化来修饰pCGN1761ENX。
c.组成型表达，肌动蛋白启动子已知在大多数细胞类型中表达了几种肌动蛋白的同种型且由此肌动蛋白启动子对组成型启动子来说是一种良好的选择。特别地，已经克隆和表征了来自稻Actl基因的启动子(McElroy等人，1990)。发现1.3kb的该启动子片段含有水稻原生质体中表达所需的全部调节元件。此外，已经特异性构建了用于单子叶植物的基于Actl启动子的大量表达载体(McElroy等人，1991)。它们结合了Actl-内含子1、Adhl5’侧翼序列和Adhl-内含子1(来自玉米醇脱氢酶基因)和来自CaMV35S启动子的序列。显示出最高程度表达的载体是35S和Actl内含子或Actl5’侧翼序列和Actl内含子的融合体。使起始ATG(GUS报道基因的)周围的序列最佳化也会促进表达。可以方便地修饰由McElroy等人(1991)所述的启动子表达盒以用于基因表达，并且这些启动子表达盒特别适用于单子叶植物宿主。例如，可以从McElroy构建体中除去含启动子的片段并将其用于取代pCGN1761ENX中的双35S启动子，然后将它用于插入特异性基因序列。接着可以将由此构建的融合基因转入合适的转化载体。在一个独立的报导中，还发现带有第一种内含子的稻Actl启动子指导经培养的大麦细胞中的高度表达(Chibbar等人，1993)。
d.诱导型表达，PR-1启动子可以用产生适宜的高度表达水平的所选择的任何其它启动子来取代pCGN1761ENX中的双35S启动子。根据实例，美国专利号5,614,395中所述的化学调节启动子之一可以取代双35S启动子。优选用限制酶从所选择的启动子来源中切割选择的启动子，不过，可以另外选择使用携带合适终止限制位点的引物来对所选择的启动子进行PCR扩增。应进行PCR扩增，然后应对所述启动子重新进行测序以便检查在靶载体中克隆扩增的启动子后的扩增误差。从质粒pCIB1004中切割化学/病原体调节烟草PR-1a启动子(用于构建，参见例如EP 0332 104中的实施例21)并将其转入质粒pCGN1761ENX(Uknes等人，1992)。用Ncol切割pCIB1004并通过用T4 DNA聚合酶处理使所得线性化片段的3’突出端钝端化。然后用Hindlll切割该片段并将所得的含PR-1a的启动子片段进行凝胶纯化，并克隆入已经除去了双35S启动子的pCGN1761ENX中。该过程通过下列步骤来进行用Xhol切割和用T4聚合酶钝端化处理；随后用Hindlll切割并分离含有pCIB1004启动子片段被克隆入的片段的较大载体-终止子。这一过程产生一种pCGN1761ENX衍生物，它带有PR-1a启动子和tml终止子以及带有单一EcoRI和Notl位点的间插多接头。可以将所选择的编码序列插入该载体，随后可以将融合产物(即启动子-基因-终止子)转入包括下文所述的那些载体在内的任何选择的转化载体。可以采用各种化学调节物来诱导所选择的编码序列在按照本发明转化的植物中的表达，这些化学调节物包括美国专利号5,523,311和5,614,395中公开的苯并噻二唑、异烟酸和水杨酸化合物。
e.诱导型表达，一种乙醇-诱导型启动子还可以将诸如乙醇这样的某些醇类或酮类诱导的启动子用于使本发明的编码序列产生诱导型表达。这类启动子例如是来自构巢曲霉的alcA基因启动子(Caddick等人，1998)。在构巢曲霉中，alcA基因编码醇脱氢酶I，其表达在有化学诱导物存在的情况下由AlcR转录因子来调节。为了本发明的目的，用本发明的编码序列来取代包括与最小35S启动子(Caddick等人，1998)融合的alcA基因启动子序列的质粒palcACAT中的CAT编码序列以便形成带有在alcA基因启动子控制下的编码序列的表达盒。可以使用本领域中众所周知的方法来进行该过程。
f.诱导型表达、一种糖皮质激素诱导型启动子使用基于类固醇激素的系统诱导本发明NIM1同源物的表达也是所关注的。例如，可以使用糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua，1997)并且通过应用糖皮质激素诱导基因表达，例如一种合成的糖皮质激素，优选地塞米松，优选的浓度范围在0.1mM-1mM、更优选10mM-100mM。为了本发明的目的，用编码NIM1同源物的基因序列取代荧光素酶基因序列以便在与35S最小启动子融合的GAL4上游活化序列6个拷贝的控制下形成带有编码NIM1同源物的基因序列的表达盒。使用本领域中众所周知的方法来进行该过程。反式作用因子包括GAL4 DNA的结合结构域(Keegan等人，1986)，该结构域与疱疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等人，1988)的反式激活域融合，这种反式激活域与大鼠糖皮质激素受体(Picard等人，1988)的激素结合结构域融合。融合蛋白的表达由适合于本领域中公知或本文所述植物中的表达的任何启动子来控制。这种表达盒还包括在含有编码与6xGAL4/最小启动子融合的NIM1同源物的基因序列的植物中。因此，获得融合蛋白的组织或器官特异性可导致NIM1同源物的诱导型组织或器官特异性。
g.根特异性表达基因表达的另一种模式是根表达。合适的根启动子由de Framond(1991)描述并且也记载于公开的专利申请EP 0452 269中。将这种启动子转入诸如pCGN1761ENX这样合适的载体以便插入所选择的基因，随后将完整的启动子-基因-终止盒转入目的转化载体中。
h.创伤诱导型启动子创伤诱导型启动子也适合于基因表达。已经描述了大量这类启动子(例如Xu等人，1993)；Logemann等人，1989；Rohrmeier & Lehle，1993；Firek等人，1993；Warner等人，1993)，它们均适用于本发明。Logemann等人描述了双子叶植物马铃薯wunl基因的5’上游序列。Xu等人证实来自双子叶植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中具有活性。此外，Rohrmeier & Lehle描述了玉米WiplcDNA的克隆，它是创伤诱导型的且可以将其用于使用标准技术分离关连启动子。类似地，Firek等人和Warner等人已经描述了来自单子叶植物石刁柏的创伤诱导型基因，将它在局部创伤和病原体侵害部位表达。使用本领域中众所周知的克隆技术可以将这些启动子转入与涉及本发明基因融合的合适载体，并用于在植物创伤部位上表达这些基因。
i.髓优选的表达专利申请WO 93/07278中描述了优选在髓细胞中表达的玉米trpA基因的分离。列出了从转录起点扩展至-1726bp的基因序列和启动子。使用标准分子生物学技术可以将这种启动子或其部分转入诸如pCGN1761这样的载体，其中它可以取代35S启动子，并可用于以髓优选方式启动外源基因的表达。实际上，可以将含有髓优选的启动子或其部分的片段转入任何载体并修饰以便在转基因植物中的应用。
j.叶特异性表达Hudspeth & Grula(1989)已经描述了编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准分子生物学技术可以将用于该基因的启动子用于以叶特异性方式启动转基因植物中任何基因的表达。
k.花粉特异性表达WO 93/07278中描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖性蛋白激酶(CDPK)的分离。基因序列和启动子从转录起点扩展至1400bp。使用标准分子生物学技术可以将这种启动子或其部分转入诸如pCGN1761这样的载体，其中它可以取代35S启动子，并可用于以花粉特异性方式启动本发明NIM1同源物的表达。
2.转录终止子各种转录终止子可以应用于表达盒。它们负责转基因及其正确聚腺苷酸化后的转录终止。合适的转录终止子是那些已知在植物中起作用的终止子且包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物。此外，可以使用一种基因的天然转录终止子。
3.用于表达的增强或调节的序列已经发现了大量来自转录单位内的可促进基因表达的序列，并且可以将这些序列与本发明的基因联合使用以便增加其在转基因植物中的表达。
已经证实不同的内含子序列可促进表达、特别是在单子叶植物细胞中。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子可显著促进野生型基因在引入玉米细胞时在其关连启动子控制下的表达。发现内含子1特别有效且在与氯霉素乙酰基转移酶基因的融合构建体中的表达得到提高(Callis等，1987)。在相同的实验系统中，来自玉米bronze1基因的内含子在促进表达方面具有相似的作用。通常将内含子序列引入植物转化载体、一般是未翻译的前导区内。
已知许多来源于病毒的未翻译前导序列也可促进表达，并且它们在双子叶植物细胞中特别有效。特别地，已经证实来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列可有效促进表达(例如Gallie等人，1987；Skuzeski等人，1990)。
4.细胞内基因产物的靶向已知在植物中存在靶向基因产物的不同机理，并且已经以一定的具体方式表征了控制这些机理起作用的序列。例如，由在进入叶绿体以产生成熟蛋白质的过程中被切割的不同蛋白质氨基酸末端发现的信号序列控制将基因产物靶向至叶绿体(例如Comao等人，1988)。这些信号序列可以与异源基因产物融合以便影响异源产物引入叶绿体(van den Broeck等人，1985)。编码合适的信号序列的DNA可以分离自编码RUBISCO蛋白质、CAB蛋白质、EPSP合酶、GS2蛋白质和已知是叶绿体定位的许多其它蛋白质的5’末端。另外参见美国专利号5,639,949的实施例37中的小标题“使用叶绿体靶向的表达”。
其它基因产物定位于其它诸如线粒体和过氧化物酶体这样的细胞器(例如Unger等人，1989)。还可以操纵编码这些产物的cDNAs以便使异源基因产物靶向至这些细胞器。这类序列的实例是核编码的腺苷三磷酸酶和特异性线粒体用的天冬氨酸转氨酶同种型。Rogers等人(1985)已经描述了靶向细胞蛋白质体。
此外，已经表征了可使基因产物靶向至其它细胞区室的序列。氨基末端序列负责靶向至ER、质外体和从糊粉细胞进行胞外分泌(Koehler & Ho，1990)。另外，氨基末端序列与羧基末端序列负责基因产物的液泡靶向(Shinshi等人，1990)。
通过将上述合适的靶向序列与目的转基因序列融合，有可能使得转基因产物定向于任何细胞器或细胞区室。例如，为了进行叶绿体靶向，使来自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列与转基因的氨基末端ATG进行框内融合。所选择的信号序列应包括已知的切割位点，并且所构建的融合体应考虑到切割所需的切割位点后的任何氨基酸。在某些情况中，通过在切割位点与转基因ATG之间添加少量氨基酸或在转基因序列中取代某些氨基酸可以满足这种要求。通过体外翻译体外转录的构建体、随后使用由Bartlett等人(1982)和Wasmann等人(1986)所述的技术，通过叶绿体体外摄取来测试为引入叶绿体所构建的融合体的叶绿体摄入功效。这些构建技术在本领域中是众所周知的且同样可用于线粒体和过氧化物酶体。
上述细胞靶向机理不仅可以与其关连启动子共同使用，而且可以与异源启动子一起使用，从而在与靶向信号来源的启动子不同的表达模式的启动子转录调节下实现特异性靶向细胞的目的。实施例8植物转化载体的构建大量可以应用于植物转化的转化载体对于植物转化领域的普通技术人员来说是公知的，并且可以将涉及本发明的基因与任何这类载体一起使用。对载体的选择将取决于优选的转化技术和用于转化的靶物种。就某些靶物种而言，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中通常使用的选择标记包括产生卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因(Messing & Vierra，1982；Bevan等人，1983)、产生除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，1990；Spencer等人，1990)、产生抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger & Diggelmann)和产生氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，1983)以及产生草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)。
1.适合于农杆菌属转化的载体许多载体可以应用于使用根癌土壤杆菌的转化。它们一般携带至少一种T-DNA边缘序列且包括诸如pBIN19(Bevan，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)(1984))和pXYZ这样的载体。下面描述了适合于农杆菌属转化的两种典型载体的构建。
a.pCIB200和pCIB2001二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建适用于农杆菌属的重组载体，且以下列方式构建它们。通过Narl消化pTJS75而生成pTJS75kan(Schmidhauser & Helinski，1985)，从而切下四环素抗性基因，随后插入来自携带NPTII的pUC4K的Accl片段(Messing &Vierra，1982；Bevan等人，1983；McBride等人，1990)。将Xhol接头与含有左和右T-DNA边缘、植物选择性nos/nptll嵌合基因和pUC多接头的PCIB7的EcoRV片段连接(Rothstein等人，1987)，并将Xhol-消化的片段克隆入Sall-消化的pTJS75kan中，以便生成pCIB200(还可参见EP 0 332 104，实施例19)。pCIB200含有下列单一多接头限制位点EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal和Sall。pCIB2001是通过插入其它限制位点的多接头而生成的pCIB200的衍生物。在pCIB2001的多接头中的单一限制位点有EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal、Sall、Mlul、Bcll、Avrll、Apal、Hpal和Stul。pCIB2001除含有这些单一限制位点外还具有植物和细菌卡那霉素选择性、用于农杆菌属介导的转化的左和右T-DNA边缘、用于大肠杆菌与其它宿主之间转移的RK2-衍生的trfA功能和同样来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适合于克隆含有其自身调节信号的植物表达盒。
b.pCIB10及其潮霉素选择衍生物二元载体pCIB10含有编码植物中筛选用的卡那霉素抗性的基因和T-DNA右和左边缘序列并引入来自广泛宿主范围质粒pRK252的序列，使它在大肠杆菌和农杆菌属中复制。Rothstein等人(1987)描述了其构建。构建了引入潮霉素B磷酸转移酶的基因(Gritz等人，1983)的pCIB10的各种衍生物。这些衍生物能够选择仅针对潮霉素(pCIB743)或针对潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)的转基因植物细胞。
2.适合于非农杆菌属转化的载体不使用根癌土壤杆菌的转化避开了在选择的转化载体中对T-DNA序列的需求，结果除了诸如上述含有T-DNA序列的载体之外，还可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌属的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体吸收(例如PEG和电穿孔)和微注射的转化。对载体的选择主要取决于对所转化物种的优先选择。下面描述了适合于非农杆菌属转化的典型载体的构建。
a.pCIB3064pCIB3064是一种适合于与通过除草剂basta(或膦丝菌素)选择联用的定向基因转移技术的pUC-衍生的载体。质粒pCIB246包括可操作地与大肠杆菌GUS基因融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录终止子，在PCT公开申请WO 93/07278中有描述。这种载体的35S启动子含有两个起始位点的ATG序列5’。使用标准PCR技术使这些位点发生突变，以这样一种方式以便除去ATGs并生成限制位点Sspl和Pvull。新的限制位点是离单一Sall位点96和37 bp和离实际起始位点101和42 bp。将所得的pCIB246衍生物命名为pCIB3025。然后通过用Sall和Sacl消化从pCIB3025上切下GUS基因，使末端钝端化并重新连接而生成质粒pCIB3060。质粒pJIT82获自John InnesCentre，Norwich，切下含有来自产绿色链霉菌的bar基因的400bpSaml片段并将其插入pCIB3060的Hpal位点(Thompson等人，1987)。该过程生成pCIB3064，它包括在除草剂筛选用的CaMV 35S启动子和终止子控制下的bar基因、氨苄青霉素抗性基因(用于大肠杆菌中的筛选)和带有单一位点Sphl、Pstl、Hindlll和BamHl的多接头。这种载体适合于克隆含有其自身调节信号的植物表达盒。
b.pSOG19和pSOG35pSOG35是一种使用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DFR)作为产生氨甲蝶呤抗性的选择标记的转化载体。将PCR用于扩增35S启动子(-800bp)、来自玉米Adh1基因的内含子6(-550bp)和18bp来自pSOG10的GUS未翻译前导序列。另外通过PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250-bp片段，并给这两种PCR片段装配来自包括pUC19载体主链和胭脂氨酸合酶终止子的pB1221(Clontech)的Sacl-Pstl片段。装配这些片段产生含有与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导区、DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子的pSOG19。来自玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的前导序列对pSOG19中的GUS前导区取代的产生了pSOG35载体。pSOG19和pSOG35携带用于氨苄青霉素抗性的pUC基因并具有用于克隆外来物质的Hindlll、Sphl、Pstl和EcoRl位点。
1.双子叶植物的转化用于双子叶植物的转化技术在本领域中是众所周知的且包括基于农杆菌属的技术和不需要农杆菌属的技术。非农杆菌属技术包括由原生质体或细胞直接摄入外源性遗传物质。该过程可以通过PEG或电穿孔介导的吸收、粒子轰击介导的转运或微注射来完成。这些技术的实例由Paszkowski等人，1984；Potrykus等人，1985；Reich等人，1986和Klein等人，1987描述。在每种情况中，使用本领域中公知的标准技术使转化的细胞再生成完整植物。
农杆菌属介导的转化是一种用于转化双子叶植物的优选技术，这是由于其高转化效率及其在许多不同物种的广泛应用所导致的。农杆菌属转化一般包括将携带有意义的外源DNA的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)转入合适的农杆菌属菌株的步骤，这种合适的农杆菌属菌株可以依赖于共存Ti质粒上由宿主农杆菌属菌株携带的Vir基因补体或染色体的存在方式(例如pCIB200和pCIB2001所用的菌株CIB542)(Uknes等人，1993)。将重组二元载体转入农杆菌属的过程通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌进行的三亲交配步骤来完成，所述的大肠杆菌是一种携带诸如pRK2013且能够使重组二元载体达到靶农杆菌属菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株。另一方面，可以通过DNA转化将重组二元载体转入农杆菌属(Hfgen & Willmitzer，1988)。
通过重组农杆菌属转化靶植物物种通常包括农杆菌属与来自植物的外植体的共培养，并按照本领域中众所周知的方案进行。在携带二元质粒T-DNA边缘之间存在的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上使转化的组织再生。
另一种使用基因转化植物细胞的手段包括使惰性或生物活性颗粒推进到植物组织和细胞上。这项技术公开在美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792中。一般来说，该过程包括在有效透过细胞外表面并在其内部产生结合的条件下将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中。当使用惰性颗粒时，可以通过给颗粒包裹含有所需基因的载体而将所述载体引入细胞。另一方面，靶细胞可被载体包围，使得该载体尾随颗粒进入细胞。也可以将生物活性颗粒(例如各自含有试图引入的DNA的干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体)推进到植物细胞组织中。
2.单子叶植物的转化目前大多数单子叶植物物种的转化已经成为常规的。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转入原生质体和粒子轰击入愈伤组织。可以使用单DNA物种或多DNA物种进行转化(即共转化)且这两项技术均适用于本发明。共转化可以具有避免完全载体构建和生成带有感兴趣基因的未连锁的基因座和选择性标记的转基因植物的优点，从而能够在随后的生产过程中除去所述的选择性标记，应将这一过程看作是理想的。然而，使用共转化的缺点在于整合入基因组的单一DNA种类的频率低于100％(Schocher等人，1986)。
专利申请EP 0292 435、EP 0392 225和WO 93/07278中描述了用于来自玉米原种近交系的愈伤组织和原生质体的制备、使用PEG或电穿孔转化原生质体和由转化的原生质体再生玉米植物的技术。Grodon-Kamm等人(1990)和Fromm等人(1990)已经公开了使用粒子轰击转化A188-衍生的玉米品系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等人(1993)中描述了通过粒子轰击转化玉米原种近交系的技术。这项技术使用传粉后14-15天从玉米穗上切下的1.5-2.5mm长的未成熟胚和轰击用PDS-1000He Biolstics装置。
还可以通过使用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术来进行稻的转化。已经描述了针对日本型和印度型的原生质体介导的转化(Zhang等人，1988；Shimamoto等人，1989；Datta等人，1990)。两种类型也通常是使用粒子轰击转化的(Christou等，1991)。此外，WO 93/21335中描述了通过电穿孔转化水稻的技术。
专利申请EP 0 332 581中描述了Pooideae原生质体的生成、转化和再生。这些技术用于转化鸭茅属和小麦。此外，Vasil等人(1992)已经描述了使用粒子轰击入C型长期再生性愈伤组织的细胞进行小麦的转化，Vasil等人(1993)和Weeks等人(1993)也描述了使用粒子轰击未成熟胚和成熟胚衍生的愈伤组织来进行小麦的转化。然而，优选的小麦转化技术涉及通过粒子轰击未成熟胚转化小麦并包括在基因递送之前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，将任何数量的胚(0.75-1mm长)平板固定在含有3％蔗糖(Murashiga & Skoog，1962)和3mg/l2，4-D的MS培养基上以便诱导体细胞胚，使该步骤在黑暗中进行。在选择进行轰击的当天，从诱导培养基中取出胚并置于渗压剂(即含有一般以15％的所需浓度添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)上。使胚进行质壁分离2-3小时，然后进行轰击。虽然并不关键，但通常是每个靶平板上有20个胚。应用标准程序使一种合适的携带基因的质粒(诸如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金粒子上。用使用～1000psi的破裂压力并使用标准80目筛的DuPont Biolistics氦装置向各平板的胚发射。在轰击后，将胚放回黑暗处以便恢复约24小时(仍然在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上取出胚并放回诱导培养基上，在此它们在再生前稳定约1个月。约1个月后，将带有发育中的胚发生愈伤组织的胚外植体转入再生培养基(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)，该培养基进一步含有合适的选择剂(就pCIB3064而言是10mg/lbasta，就pSOG35而言是2mg/l氨甲蝶呤)。约1个月后，将发育的枝条转入称作“GA7”的含有半数浓度的MS、2％蔗糖和相同浓度的选择剂的较大无菌容器中。
还描述了使用农杆菌属转化单子叶植物的技术方案。参见，WO94/00977和美国专利号5,591,616。III.培育和种子生产通过有性繁殖或营养生长传递上述基因工程的转基因种子和植物的遗传特性，由此可以在子代植物中维持并传播这些特性。通常所述的维持和传播充分利用了为适合特殊目的发展的农业方法，诸如耕种、播种或收获。还可以应用诸如水培或温室技术这样的特殊方法。当生长的农作物易受到由昆虫或感染以及杂草植物竞争所导致的损害和破坏时，实施某些措施以便控制杂草、植物病害、昆虫、线虫和其它不良条件以改善产量。它们包括耕作土壤或除去杂草和感染植物这样的机械措施以及施用诸如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、催熟剂和杀虫剂这样的农用化学品。
在植物培育中可以进一步应用本发明的有利遗传特性的转基因植物和种子，其目的在于开发具有改善特性的植物，所述的改善特性诸如害虫、除草剂或应激耐受性、改善的营养价、产量提高或使倒伏或脱落损失减小的改进结构。不同培育步骤的特征在于充分确定的人的干预诸如选择杂交品系、亲本品系的定向传粉或选择合适的子代植物。根据所需特性的不同，制定不同的培育措施。相关技术在本领域中是众所周知的，而且包括但不限于杂交、近交、回交培育、多线培育、变种混合、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还包括植物不育化以便通过机械、化学或生化方式产生雄性或雌性不育植物。带有不同品系花粉的雄性不育植物的交叉传粉确保了雄性不育的基因组，而雌性不育植物均匀地获得了两亲本品系的特性。因此，可以将本发明的转基因种子和植物用于改善的植物品系的培育，例如，这种培育方法提高了诸如除草剂或杀虫剂(pestidice)处理这样的常规方法的有效性，或因其改进的遗传特性而不再需要所述的方法。另一方面，可以获得具有改善的应激特性的新型农作物，由于它们具有最佳化遗传“设备”，从而使收获产品的质量优于不能耐受类似的不良发育条件的产品。
本发明的再一个方面是提供诸如上述典型方法这样的新型农用方法，其特征在于使用本发明的转基因植物、转基因植物物质或转基因种子。
可以将种子装入由合适的包装材料构成的包、容器或管中，所述的包、容器或管能够密封以包含种子。可以将包、容器或管设计成种子的短期或长期包装或两者均有的包装。合适的包装材料的实例包括诸如牛皮纸这样的纸、硬质塑料或柔顺塑料或其它聚合材料、玻璃或金属。理想的情况是所述的包、容器或管由多层相同或不同类型的包装材料构成。在一个优选的实施方案中，提供所述的包、容器或管以便防止或限制水和湿气接触种子。在一个实例中，将所述的包、容器或管密封、例如加热密封以便防止水或湿气进入。在另一个实施方案中，将吸水物质置于包装材料层之间或接近包装材料层。在另一个实施方案中，将包、容器或管或构成的包装材料进行处理以便限制、抑制或防止种子储存或运输过程中的病害、污染或其它不利影响。这类处理方法的一个实例是例如通过化学方式或通过接触射线进行不育化。本发明包括的是一种商品包，它装有包含本发明基因的转基因植物的种子、合适的载体及其用于使植物产生广谱病害抗性的标记说明书，其中所述转基因植物种子中包含本发明基因，其在所述转化植物中的表达水平高于在野生型植物中的表达水平。IV.病害抗性评价用本领域中公知的方法抗性病害抗性评价。参见Uknes等人(1993)；Grlach等人(1996)；Alexander等人(1993)。例如，几种有代表性的病害抗性测定如下所述。实施例12寄生疫霉(黑胫病)抗性测定对如Alexander等人(1993)中所述生长的6周龄植物进行黑胫病致病生物体寄生疫霉抗性测定。给植物浇水、排干水且然后通过给土壤施用10ml孢子囊混悬液(300孢子囊/ml)进行接种。将接种的植物保存在维持在日温度23-25℃和夜温度20-22℃的温室内。本试验用枯萎指数如下0＝无症状；1＝无症状；1＝有一定枯萎征兆、膨胀度下降；2＝明显的枯萎症状、但无腐烂或矮化；3＝明显的枯萎症状、伴有矮化，但无明显的茎腐烂；4＝严重枯萎、肉眼可见茎腐烂和一定的对根系的损害；5＝如4所述，但植物接近死亡或已经死亡并伴有根系的严重减少。在对以随机设计方式排列的植物全盲的情况下取得全部测定得分。实施例13丁香假单胞菌抗性测定给几种6-7周龄植物的两个下部的叶子注入浓度为106或3×106/ml水溶液的丁香假单胞菌变种烟草野火病假单胞菌(Pseuodomonas syringae pv.tabaci)菌株#551。在各个时间点评价6株单独的植物。给烟草野火病假单胞菌感染的植物定为5点病害严重等级5＝100％死亡的组织；0＝无症状。对每天的评价结果进行T-检验(LSD)并在平均病害等级值后显示分型。在评价当天后面跟着相同字母的数值在统计学上没有显著差异。实施例14烟草尾孢抗性测定将烟草尾孢(ATCC#18366)的孢子混悬液(100,000-150,000个孢子/ml)喷洒在叶表面的紧急溢放口上。将植物维持在100％湿度下5天。此后给植物喷水雾、每天5-10次。在各时间点处评价6株单独的植物。给烟草尾孢定级为显示病害主要症状的叶面积百分比a％。对每天的评价结果进行T-检验(LSD)并在平均病害等级值后显示分型。在评价当天后面跟着相同字母的数值在统计学上没有显著差异。实施例15寄生霜霉抗性测定对如Uknes等人(1993)中所述的植物进行寄生霜霉抗性测定。通过喷洒分生孢子混悬液(大约5×104个孢子/毫升)给植物接种寄生霜霉的相容分离物。在17℃下的生长室内的湿度下通过14小时-日/10小时-夜循环培养接种植物。在有分生孢子梗存在的情况下接种后的3-14天、优选7-12天时检查植物。此外，随机选择经各种处理的几种植物并用乳酚-锥虫蓝染色(Keogh等人，1980)以便于镜检。
上述公开的实施方案是解释性的。对本领域技术人员来说本发明的该公开内容仅是本发明许多变化形式的一部分。所有这类显而易见和可预测的变化形式均包括在权利要求中。
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>新型单子叶植物基因及其用途<130>A-31281A<140><141><150>US 09/519233<151>2000-03-06<160>20<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>4270<212>DNA<213>小麦(Triticum aestivum)<220><221>外显子<222>(1396)..(2163)<220><221>内含子<222>(2164)..(2337)<220><221>外显子<222>(2338)..(2532)<220><221>内含子<222>(2533)..(2933)<220><221>外显子<222>(2934)..(3188)<400>1gagctcgcca acctcttcca ggtccgcctc tccctctccc cttctcctcc atgatgcttt 60cttggtttca gacatttatt gtgcttgctg ggaatgcata tttgcgcgca cgttcttgtg 120ctcagacagc aaggtttaat gctgtctttt ctttctgcac gcggggacgt tttctgtatg 180cggcaaaatg ggcttagatc cccttaccat ttctgctaaa tttaatcaat ttcagtactt 240ctgaaaaata gcgttaaaca ttggttagta ctagtacgtt ttgtcggtag caatgaggag 300cttgtgctta tcatgtggtg atcttgaaat tggtgaagtt gtcaatggaa attgtacagt 360tgggaccttg aggtgccgtg tcattttgat gctatctcaa ggattcttgt tctgatgttt 420tttttttctt ggggaaaaat ggtaattgtt cattgctcaa agaatgagtg gtgtcaatat 480ggtacatgcc cctacttata tttttcatca atgaaatgca gttcttatga aactgtacaa 540atctaggttg cattaatgca 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sativa)<220><221>CDS<222>(2)..(496)<400>7g gca ytg gat tct gat gat gtt gag ctt gtg aag ttg ctt ctt aac gaa 49Ala Xaa Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu1 5 10 15tct gag atc acc ttg gat gat gcc aat gca ttg cac tat gct gct gct 97Ser Glu Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala20 25 30tac tgt gat tcg aaa gtt gtt tcg gag ttg tta gac ttg aga ctt gcc 145Tyr Cys Asp Ser Lys Val Val Ser Glu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Ala35 40 45aac ttg aat ttg aag aat tcg cgt gga tac acg gca ctc cat ctg gct 193Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala50 55 60gct atg agg aga gag cca gct att atc atg tgt ctc cta aac aaa gga 241Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly65 70 75 80gca gct gta tca caa ttg act gct gat ggc cag agt gca atg agt atc 289Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser Ile85 90 95tgc cgg agg tta aca agg atg aaa gac tac aat aca aag atg gag caa 337Cys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu 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1.一种分离的核酸分子，它包括来自单子叶植物且为NIM1基因同源物的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，它包括(a)编码SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19；(c)包括与SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的至少20个连续碱基对部分相同的至少20个连续的碱基对部分；(d)可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物对从单子叶植物DNA文库扩增的所述的核苷酸序列；(e)可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQID NO5和6的引物对从稻DNA文库扩增的所述的核苷酸序列；(f)可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4、或SEQID NO5和6的引物对从小麦DNA文库扩增的所述的核苷酸序列；(g)可以使用聚合酶链反应，采用含有SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的编码序列(CDS)之前20个核苷酸和最后20个核苷酸之反向互补物的引物对，从单子叶植物DNA文库扩增的所述的核苷酸序列；(h)核苷酸序列，其能在严格杂交和洗涤条件下与SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的互补物杂交。
3.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括编码SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列。
4.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO1、7、9、11、13、17或19。
5.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列包括在序列中与SEQ ID NO1、7、9、11、13、17或19中的至少20个连续碱基对部分相同的至少20个连续碱基对部分。
6.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物对从单子叶植物DNA文库扩增的核苷酸序列。
7.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物对从稻DNA文库扩增的核苷酸序列。
8.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括可以使用聚合酶链反应采用表示为SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物对的从小麦DNA文库扩增的核苷酸序列。
9.根据权利要求2的分离的核酸分子，包括可以使用聚合酶链反应采用引物对从单子叶植物DNA文库扩增的核苷酸序列，所述的引物对相应于SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19编码序列(CDS)的前20个核苷酸和最后20个核苷酸的反向互补物。
10.权利要求2的分离的核酸分子，包括在严格杂交和洗涤条件下可与SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19互补物杂交的核苷酸序列。
11.一种包含在植物中具有活性的与权利要求1的核酸分子可操作地连接的启动子的嵌合基因。
12.一种包含权利要求11所述的嵌合基因的重组载体。
13.一种包含权利要求11所述的嵌合基因的宿主细胞。
14.一种包含权利要求11所述的嵌合基因的植物。
15.权利要求14的植物，其为单子叶植物。
16.权利要求14所述的植物，它选自下列植物稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、canola、向日葵、胡萝卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黄瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、洋李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和糖甘蔗。
17.来自权利要求14的植物的种子。
18.一种增加植物中SAR基因表达的方法，该方法包括在所述植物中表达权利要求11所述的嵌合基因。
19.一种提高植物中病害抗性的方法，该方法包括在所述植物中表达权利要求11所述的嵌合基因。
20.一种PCR引物，它选自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4。
21.一种用于分离与可导致植物中系统获得性抗性的信号转导级联相关的NIM1同源物的方法，该方法包括使用聚合酶链反应采用引物对从植物DNA文库扩增DNA分子，所述的引物对相应于SEQ IDNO1、7、9、11、13、15、17或19编码序列(CDS)的前20个核苷酸和最后20个核苷酸的反向互补物；或所述的引物对表示为SEQ IDNO3和4或SEQ ID NO5和6。
22.权利要求21所述的方法，其中所述的植物DNA文库是稻或小麦的DNA文库。
全文摘要
本发明涉及从单子叶作物诸如Triticumaestivum(小麦)和Oryza sativa(稻)中分离与可导致系统获得性抗性(SAR)的信号转导级联相关的拟南芥属NIM1基因同源物。本发明进一步涉及用于在转基因植物中表达单子叶NIM1同源物以便增加SAR基因表达并提高广谱病害抗性的转化载体和方法。
文档编号C12N1/21GK1411511SQ01806112
公开日2003年4月16日 申请日期2001年3月5日 优先权日2000年3月6日
发明者H·X·王, J·M·萨尔梅隆, M·G·维尔里兹, K·A·洛顿 申请人:辛根塔参与股份公司