抗微生物融合化合物及其用途

抗微生物融合化合物及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种融合蛋白，其包含至少一种1型核糖体失活蛋白，多肽B；以及至少一种能抑制病毒进入的多肽A；和/或至少一种阳离子抗微生物肽，多肽C。
【专利说明】抗微生物融合化合物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗微生物融合化合物，特别是多肽，及其片段，并涉及其在微生物感染中作为治疗剂的用途。
【背景技术】
[0002]微生物感染会影响人类和动物并在全世界导致高水平的发病。微生物感染物包括原生动物寄生虫，细菌和真菌，对此通常可用抗微生物药剂。然而，某些抗微生物药剂附有不良副作用，且这类药剂的微生物抗性问题是日益严重的问题。
[0003]微生物感染物也包括病毒，其是困扰人类以及人类伴侣动物还有专门饲养用作人类食物的动物的许多广泛传播疾病的起因。大多数目前可用的用于人治疗应用的抗病毒药物性质上是单功能的并仅阻碍一个特定的病毒途径，例如，病毒进入宿主细胞，病毒基因组融合或整合入宿主细胞基因组，以适合整合入感染的宿主细胞基因组的形式的病毒ssRNA至dsDNA的翻译或反转录。因此，一旦病毒获得对单功能抗病毒药物的抗性，药物就失去其效用。
[0004]而且，目前没有对多种动物病毒有效的疗法，包括例如白斑综合症病毒(WSSV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)等。已知这些动物病毒特别影响对虾和猪产业。每年这些病毒中每种造成的损失相信超过10亿美元。
[0005]由于其高突变率，对这些病毒和大多数其他病毒的有效疫苗难以开发。而且，对一个地理小种起作用的疫苗也经常对相同病毒的其他地理小种的作用不佳。
[0006]抗病毒药物的例子包括恩夫韦地(罗氏以FUZEON?的商品名销售)，其为Hiv-1融合抑制剂。恩夫韦地是合成生产的修饰蛋白，并被报道指其是每年每人花费在25000美元区间中的昂贵治疗方 式。由于其是每天两次以皮下注射引入体内，其施用方式也非常不便。
[0007]抗病毒药物的另外例子包括奥司他韦(也以其商品名TAMTFLU?公知),其能通过阻止病毒化学切割与其宿主细胞连接，来减缓流感(流感)病毒在体内细胞间的传播。自1999年TAMTFLU:?已在超过5千万人身上被用于治疗和防止甲型流感病毒和乙型流感
病毒感染，并且其是以胶囊或者作为悬液口服的。然而，现在有许多抗TAMIFLU?的甲型流感病毒和乙型流感病毒的毒株。扎那米韦(也以其商品名RELENZA?.公知),作为神经氨酸酶抑制剂作用的另一种抗病毒药物被用于治疗和预防甲型流感病毒和乙型流感病毒。REL.ENZA?为通过吸入施用。本领域公知抗病毒药物TAMTFLU?和生产依赖于不能被经济合成的原料莽草酸。事实上，之前罗氏已经做出数个抗病毒药物TAMiFLU⑧和RELENZA?产量可能严重受限于莽草酸的供应的新闻稿。

【发明内容】

[0008]本发明在所附独立权利要求中限定。本发明的某些可选特征在所附从属权利要求中限定。
[0009]根据本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包含至少一种I型核糖体失活蛋白或其片段，多肽B;以及
[0010](i)至少一种能抑制病毒进入的多肽A ;和/或
[0011](ii)至少一种阳离子抗微生物肽(CAP)或其片段，多肽C。
[0012]所述多肽A可以为Θ防御素，其类似物，或其片段。
[0013]特别地，根据本发明任一方面的融合蛋白可以是适合口服施用的。
[0014]根据本发明 的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明任一方面的融合蛋白。
[0015]根据本发明的再一个方面，提供了在有需要的脊椎动物，无脊椎动物或植物中治疗和/或预防微生物感染的方法，包括给脊椎动物，无脊椎动物或植物施用有效量的根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物的步骤。特别地，所述微生物感染可以是病毒感染。所述脊椎动物可以为哺乳动物，鱼类或鸟类。甚至更特别地，哺乳动物可以为非人动物。
[0016]从下面的说明中显而易见，本发明优选实施方式融合蛋白具有最佳效果和广谱治疗，和/或如一些应用，允许蛋白质的口服递送。
【专利附图】

【附图说明】
[0017]现在将参考附图通过举例的方式描述所述融合蛋白的优选实施方式，其中:
[0018]图1 为 RetroMADl 的翻译图(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2)。
[0019]图2的图显示了大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中A)时间过程表达和B)RetroMADl表达溶解度。在诱导前(Oh)收获容有pRMD的细胞，且诱导后lh，2h，3h代表沉淀相，带星号(*)的小时数代表上清液相。在15%SDS_PAGE中分析蛋白。M:PageRuler? Fermentas蛋白梯，U:未诱导的，IND:诱导的，和IB:纯化的包含体。箭头指示大肠杆菌生产的RetroMADl(41.2kDa)。
[0020]图3的图显示了经过以RetroMADl孵育24和48小时的孵育期，(A)在MOI=0.1时对HSV-1，(B)在MOI=0.5时对HSV-1的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。
[0021]图4的图显示了经过以RetroMADl孵育24和48小时的孵育期，(A)在MOI=0.1时对HSV-2，(B)在MOI=0.5时对HSV-1的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。
[0022]图5的图显示了经过以RetroMADl孵育24和48小时的孵育期，(A)对DENV1，(B)在Μ0Ι0.1时对DENV2，和在Μ0Ι0.5时对DENV2，(C)对DENV3以及(D)对DENV4的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。
[0023]图6的图显示了在以RetroMADl经72小时孵育后同时处理PBMC的正常细胞数。
[0024]图7的图显示了在72小时孵育后同时处理非霍奇金淋巴瘤PBMC的细胞数。
[0025]图8的图显示了在24小时，48小时和96小时终点时测量的RetroMADl细胞毒性。所有的值被表示为三个重复试验的平均值土标准偏差。哺乳动物细胞系=(A)VeiO, (B)LLC-MK2，和(OBHK-21细胞系的最大非毒性剂量为ΙΟΟμ g/ml。
[0026]图9的图显示了在24小时，48小时和96小时终点时测量的RetroMADl细胞毒性。所有的值被表示为三个重复试验的平均值土标准偏差。人细胞系:(A)RWPE-1，(B)张氏肝细胞系，(ONL-20, (D) 184B5和(E) CCD-1127SK细胞系的最大非毒性剂量为ΙΟΟμ g/ml。[0027]图10(A)显示了凝胶图，其中441bp大小的条带显示感染了 HPV的对照个体对虾。22/23为HPV阳性。
[0028]图1OB显示了凝胶图，其中处理过的个体虾仅仅2/24感染了 HPV。22/24的个体虾为HPV阴性。
[0029]图11的图显示了试验感染WSSV虾的存活百分数，左边为对照而右边为处理过的。
[0030]图12A和B为使用捕获ELISA测定猫血清中RetroMADl浓度的标准曲线。
[0031]图13A的图显示了从捕获ELISA得到的对照和处理的小鼠血清中RetroMADl的浓度。
[0032]图13B的图显示了用于导出图13 (A)中血清RetroMADl浓度的三份数据，其确认了结果有极好的一致性。
[0033]图14为显不RetroMADl热稳定性的SDS-page结果。
[0034]图15 为使用 HPLC 的层析图，显示(A)PBS 对照，(Β)50 μ g/ml，(C) 100 μ g/ml，(D)200μ g/ml, (E) 400 μ g/ml 和(F) 500 μ g/ml 的 RetroMADl 峰。
[0035]图16为凝胶图，其显示了诱导前后AB，BA，BC和CB的表达。在15%SDS_PAGE上分析蛋白。M:未染色蛋白标记物(Fermentas )。
[0036]图17的图显示了有A-B，B-A，B_C和C-B结构的肽的抗单纯疱疹病毒_2 (HSV-2)抗病毒活性。
[0037]图18的图显示了使用噬菌斑减少试验测定Amatilin药物对HSV-2的抑制活性(如实施例19中所述)。
[0038]图19为四幅图，每幅显示了用如实施例17中所述的Amatilin, Catadarcin,Kudapan和RetroMADl处理的病毒DNA减少百分数。
【具体实施方式】
[0039]定义
[0040]为方便起见，这里收集了说明书，实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
[0041 ] 本发明上下文中使用的术语“佐剂”是指免疫佐剂。这样，佐剂是指能增强或促进对所考虑组分的免疫系统反应，由此在对象中诱导免疫反应或免疫反应系列的化合物。佐剂可以通过形成存储库(延长组分的半衰期)来促进治疗组合物的效果，提供额外的T细胞辅助并刺激细胞因子的产生。如果抗原分子只是弱抗原性的或者与免疫系统的化合物，分子，或细胞仅发生弱到中度的相互作用，在某些情况下，可能需要通过佐剂的抗原存活和非特异性刺激辅助。
[0042]本发明上下文中使用的术语“类似物”是指可以通过改变氨基酸序列来修饰以包含一个或多个天然存在的和/或非天然存在氨基酸的肽，只要该肽类似物能够减少或防止微生物生长或杀死微生物。例如，术语“类似物”涵盖有一个或多个保守氨基酸改变的抑制肽。术语“类似物”也涵盖有包含，例如一个或多个D-氨基酸的肽。这样的类似物具有例如蛋白酶抗性的特性。类似物也包括肽模拟物，如其中一个或多个肽键已被修饰的。优选的类似物包括根据本发明任意实施方式描述的，含有一个或多个非天然存在的氨基酸类似物的肽类似物。
[0043]本发明上下文中使用的术语“抗微生物”是指本发明的肽或其类似物或衍生物的生物活性，并表示本发明的蛋白有杀死微生物，干扰繁殖或以别的方式使微生物不能生长的能力。本发明的肽或其类似物或衍生物能够杀死微生物和/或减少或防止微生物生长，即，肽具有杀微生物活性和/或抑微生物活性。肽可以是用于治疗或防止微生物感染的药物，化合物或分子，包括根据本发明任意实施方式的融合蛋白。测定肽或其类似物或衍生物抗微生物活性的方法对本领域技术人员显而易见和/或在本发明中描述。例如，将肽或类似物或衍生物施加到微生物之前已经生长其上的平板上，并在适合的时间段之后，测定微生物的生长抑制和/或细胞死亡水平。
[0044]本发明上下文中使用的术语“包括”是指在实践本发明时可以被相连使用的各种成分，组分，或步骤。因此，术语“包括”涵盖了更严格的术语“基本由……组成”和“由……组成”。对术语“基本由……组成”，理解为本发明的表位/抗原“大体上”包括所示的序列作为“基本”的要素。其他的序列可以被包含在5’端和/或3’端。因此，对于偶然含有序列X的已知多肽，基本由序列X组成的多肽会是新颖的。对术语“由……组成”，理解为根据本发明的多肽，多核苷酸和/或抗原对应所示序列中的至少一个(例如以SEQ ID号表示的特定序列或其同源序列或片段)。
[0045]本发明上下文中使用的术语“衍生物”包括，如所述肽的片段或被加工的形式，相对所述肽包含一个或多个氨基酸取代，缺失或添加的变体或突变体，包含所述肽的融合蛋白，或相对所述肽包含一种或多种其他非肽成分，如化学成分如聚乙二醇(PEG)的肽。术语“衍生物”也涵盖了包括根据本发明的融合蛋白的多肽。例如，该多肽包括标签，如，例如，表位，如FLAG表位或V5表位或HA表位。例如，表位为FLAG表位。这样的标签可用于，例如，纯化多肽。本发明抗微生物融合蛋白的优选衍生物具有增强的稳定性。例如，在融合蛋白要施用的对象中有活性的蛋白酶的切割位点被突变和/或缺失，以产生本发明抗微生物融合蛋白的稳定衍生物。术语“衍生物”也涵盖被衍生的肽，如，例如被修饰以含有一个或多个非氨基酸化学基团的肽。所述化学基团可以通过氨基末端氨基酸残基，羧基末端氨基酸残基，或者在内部氨基酸残基上被共价连接到肽。这样的修饰包括在肽的活性基团上添加保护性或封端基团，添加可检测标记，和不会不利破坏肽化合物活性的其他变化。
.[0046]因此，可接受的氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性，亲水性，电荷，大小等。考虑前面数个特征的示例性的取代是本领域技术人员公知的，其包括:精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。可以以本领域已知的多种适合方法制备本发明的分离的多肽，包括制备多肽序列的典型化学合成方法。
[0047]本发明上下文中使用的术语“片段”是指根据本发明任意方面融合蛋白的全序列中的不完整的或分离的部分，其包含将蛋白的特征和功能赋予序列的活性位点。特别是，其可以为更短到至少一个氨基酸。例如根据本发明融合蛋白的片段包含能使蛋白识别微生物的活性位点。片段可以为至少10个氨基酸长。例如，RIP的非限制性片段可以至少包含大小可约为5kDa的RIP核心或生物活性位点。
[0048]本发明上下文中使用的术语“融合蛋白”是指通过将两个或更多个原来编码每个蛋白的基因联合而产生的蛋白。这样融合基因的翻译得到了具有源自每个初始蛋白的功能特性的单一多肽。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，用于生物研究和治疗。例如，根据本发明任意方面的融合蛋白可以包括I型RIP，多肽B ;以及能够抑制病毒进入的多肽A 和 / 或 CAP，多肽 C。融合蛋白的结构可以是 A-B-C，A-C-B, C-A-B, C-B-A, B-A-C, B-C-A,A-B-C-C, A-B, B-C, B-C-C或C-C-B-C-C。特别是，融合蛋白可以包含_ 聚体和/或串联重复序列。更特别地是，根据本发明任意方面的融合蛋白可以是上述结构的重复体。例如，结构可以是A-A-B-C-C，C-C-B-C-C, A-A-B-A-A等。当重复时，每种融合蛋白中的多肽A，B或C可以是相同的蛋白或者可以是不同的蛋白。多肽A可以为Θ防御素，其类似物，或其片段。根据本发明的融合蛋白可以包括SEQ ID NO:1，其变体、衍生物或片段。用于本发明中的术语“RetroMADI”是指有A-B-C结构并且氨基酸序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白。特别是，在RetroMADl中多肽A可以为RetrocyclinlOl，多肽B可以为MAP30而多肽C可以为皮抑菌肽(Dermaseptin) I。这些肽可以被直接相互融合或者通过连接肽相互连接。
[0049]本发明上下文中使用的术语“连接肽”在本发明中与术语“连接物”可交替的使用。连接肽是共价或非共价连接两个或更多个分子或肽，从而产生由包括连接肽在内的全部分子或肽组成的更大复合体的肽。连接肽的非限制性例子可以为SEQ ID NO=Il0
[0050]本发明上下文中使用的术语“微生物感染”是指微生物在其他生物中或上的侵入，生长和/或增殖。微生物感染可以局限于生物或全身的特定区域。本发明的融合肽，类似物和/或衍生物用于治疗的感染包括由任何微生物例如但不限于细菌，真菌，酵母菌，原生动物和病毒引起的，影响哺乳动物，无脊椎动物，脊椎动物和/或植物的任何感染。技术人员应理解什么被认为是微生物感染。特别是，本发明的融合蛋白或类似物或衍生物或制剂可用于治疗病毒感染。所述病毒的例子包括但不限于麻疹病毒，单纯疱疹病毒(HSV-1和-2)，疱疹病毒家族成员(HIV，丙型肝炎，水泡性口膜炎病毒(VSV)，绵羊髓鞘脱落病毒，巨细胞病毒(CMV)等。
[0051]本发明上下文中使用的术语“微生物”涵盖了任何微小的生物或微生物。例如，但不限于，微生物包括细菌，古细菌，病毒，酵母菌，真菌或原生动物。特别地，微生物为病毒。病毒可以包括但不限于巨细胞病毒(CMV)肺炎，肠炎和视网膜炎；埃泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)淋巴增殖疾病；水痘/带状疱疹(由水痘-带状疱疹病毒，VZV引起)；HSV-1和-2黏膜炎；HSV-6脑炎；BK病毒出血性膀胱炎；病毒性流感；呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎；AIDS (由HIV引起)；以及甲型，乙型或丙型肝炎。其他病毒例子包括但不限于逆转录病毒科；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒，肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒);杯状病毒科(Calciviridae)(如引起肠胃炎的毒株);披膜病毒科(例如，马脑炎病毒，风疹病毒);黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒(例如，水疱性口炎病毒，狂犬病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒(如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如,汉坦病毒，布尼亚病毒(bunga viruses),白蛉热和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝0嫩病毒科(乙肝病毒),细小病毒科(细小病毒);乳多空病毒科(乳头状瘤病毒，多瘤病毒);腺病毒科(多数腺病毒);疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)I和HSV-2，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒);痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒);和虹彩病毒科(如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，海绵状脑病病原因子，丁型肝炎因子(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星病毒)，非甲型非乙型肝炎因子(I类=体内传播；2类=非肠道传播(B卩，丙型肝炎)；诺沃克及相关病毒，星状病毒)。
[0052]例如，病毒可以是特异对水产养殖业的，如但不限于如甲壳类病毒如WSSV，HPV,MBV, IHHNV, YHV, TSV, GAV, LSNV, IMNV, MoV, KHVl，KHV2, KHV3, VNN。特异对水产养殖业的病毒可以包括来自双RNA病毒科,疱疫病毒科,虹彩病毒科，逆转录病毒科或弹状病毒科家族中的任意一种鱼类病毒。特别地，鱼类病毒可以是来自双RNA病毒科家族的胰腺坏死病毒(IPNV)，来自疱疹病毒科家族的水道猫鱼病毒(CCV)，来自虹彩病毒科家族的淋巴囊肿病毒(FLDV),属于弹状病毒科家族的造血组织坏死病毒(IHNV)和病毒性出血败血症病毒(VHSV)等。鲍鱼病毒包括-MG，AMAV等。
[0053]例如，病毒可以是特异对家禽的，如但不限于引起禽痘，鸡新城疫，传染性支气管炎，鹌鹑支气管炎，鸡马立克氏病(内脏白血病)，淋巴白血病，传染性法氏囊病，禽流感，流行性震颤等的病毒。
[0054]例如，病毒可以是特异对猪的，如但不限于猪戊型肝炎病毒，圆环病毒，疱疹病毒等。特别地，病毒可以是猪巨细胞病毒，伪狂犬病毒。
[0055]对猫重要的病毒包括但不限于猫泛白细胞减少症病毒(FPV)，猫疱疹病毒，猫杯状病毒，猫白血病病毒(FeLV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)等。病毒可以是特异对狗的，且其可以包括但不限于狂犬病病毒，犬细小病毒，犬冠状病毒，犬瘟热病毒，犬流感病毒，犬肝炎病毒，犬疱疹病毒，导致伪狂犬病的病毒，犬极小病毒等。
[0056]本发明上下文中使用的术语“多肽”是指长的，连续的，无分枝的肽并包括环状多肽。蛋白由一个或多个按生物功能方式排列的多肽组成并经常可以与辅助因子，或其他蛋白连接。特别地，根据本发明任意方面的蛋白可以是天然存在的，从头和/或合成的。
[0057]本发明上下文中使用的术语“对象”是指可能被微生物感染的任何动物，包括人，非人动物，植物或昆虫。特别地，对象为可能被微生物感染的任何动物，包括人，植物或昆虫，本发明的融合蛋白或类似物或衍生物对该微生物有活性。
[0058]本发明上下文中使用的术语“治疗”是指防止，缓解，治疗性或治愈性治疗。
[0059]本发明上下文中使用的术语“变体”交替或附加的以对其衍生来源母多肽一定程度的序列同一性为特征。更准确的，本发明上下文中的变体显示至少30%的序列同一性，特别地，至少40 %，50 %，60 %，70 %，80 %或90 %的序列同一性。更特别地，本发明的上下文中的变体显示与其母多肽至少95%的序列同一性。本发明的变体显示所示的序列同一性，而优选的序列同一性在超过100，150，200，300，315，320，330，340，344个或更多个氨基酸的连续延伸上。核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性百分数可以通过序列比对确定。可以以多种本领域已知的算法进行这样的比对，优选用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin&Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA90:5873-5877)，用 hmmalign(HMMER包，http://hmmer.wustl.edu/)或用如在 http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/ 上可用的CLUSTALo 优选使用的参数为如 http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/ 或 http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index, html 上设置的默认参数。可以使用如 BLAST,BLAT 或BlastZ (或BlastX)来计算序列同一性级别(序列匹配)。优选的，序列匹配分析由有已建立的同源绘图技术如 Shuffle_LAGAN(Brudno M.,Bioinformatics2003b, 19Suppll: 154-162)或Markov随机场补充。当本申请中提及序列同一性百分数时，如果没有特别指出其他的方式，这些百分数是对于更长序列的全长计算。[0060]本领域技术人员会理解根据本发明给出的方法可以无需过多试验来实践本发明。方法，技术和化学药品如给出的参考文献中所描述或来自标准生物技术和分子生物学教科书的方案。
[0061 ] 在本发明的一个方面，提供了至少一种融合蛋白，其包含I型RIP或其片段，多肽B ;以及
[0062](i)至少一种能抑制病毒进入的多肽A ;和/或
[0063](ii)至少一种CAP或其片段，多肽C。
[0064]根据本发明第一方面的融合蛋白也可以包括变体或衍生物。术语“变体”和“衍生物”如上定义。多肽A可以是Θ防御素，其类似物或片段。
[0065]阳离子抗微生物肽(CAP)可以是在病毒融合抑制，病毒基因抑制，病毒膜中断和/或病毒进入抑制中起关键作用的抗病毒CAP。CAP最大可以100个氨基酸长。CAP可以大多为动物来源。然而，也有来源于植物的CAP，包括但不限于环肽(cyclotides)。例如可以作为融合抑制物作用的细菌CAP可以包括但不限于Siamycin，NP-06和短杆菌肽(Gramicidin)A。可以作为融合抑制物作用的植物CAP可以包括环状杆菌素(Circulin)A、B7Kalata BI和B8 ;可以作为进入抑制物作用的植物CAP可以包括Kalata B8 ;可以作为病毒基因抑制物作用的植物CAP可以包括银杏抗菌蛋白基因(Ginkbilobin)，a -Basrubin,Lunatusin和防御蛋白样蛋白(Sesquin)。可以作为病毒膜中断物作用的植物CAP可以包括环状杆菌素(Circulin) A、C 和 D, Tricyclon A 和环紫菌素(cycloviolacin) H4。可以作为融合抑制物作用的动物CAP可以包括鲎肽(Polyphemusin) I和II，hfl_B5，内源性抗微生物多肽(Protegrins)(猪 Cathelicidin)，大鼠防御素 NP1，NP2，NP3 和 NP4，人 β -防御素 I 和 II，Temporin A, Temporin-LTc, Temporin-Pta, Caerinl.1, Ranatuerin6 和 9,爬行动物防御素以及毒鱼豆素(Piscidin) I和2 ;可以作为进入抑制物作用的动物CAP可以包括乳铁素B，兔中性粒细胞-1，皮质稳定素Illa，兔中性粒细胞-3A，兔α -防御素，Retrocyclin-1, Ret rocyclin-2, Retrocyclin-3,人 α -防御素 HNP-1, 2, 3,4, 5 和 6,人β-防御素III (HBD3)，恒河猴小防御素(minidefensin) (RTD-1, Θ防御素)，RTD-2恒河猴Θ防御素，RTD-3恒河猴Θ防御素，人中性粒细胞肽-2，人中性粒细胞肽-3和人中性粒细胞肽-4 ;可以作为病毒基因抑制物作用的动物CAP:杀菌肽(Cecropin) A，蜂毒肽(Melittin), EP5-1,马加宁(Magainin) 2, hepcidin TH1-5 和 Epinecidin-1 ;可以作为病毒膜中断物作用的动物CAP可以包括Π引哚菌肽(Indolicidin), Cathelicidin-4,人中性粒细胞妝 _1，LL_37Cathelicidin,皮抑菌妝(Dermaseptin) SI, S4 和 S9, Maximinl, 3,4 和5, Brevininl, Ranatuerin2P,6 和 9, Esculentin2P, Esculentin-lArb, Caerinl.1, 1.9 和4.1, Brevinin-2-相关，Maculatinl.3, Maximin H5 以及毒鱼豆素(Piscidin) I 和 2。其他 CAP 可以包括 Mundticin KS 恩特洛霉素(Enterocin) CRL-35，Lunatusin, FK_13(GI_20为衍生物)，速普肽(Tachyplesin) I, a -MSH,抗病毒蛋白Υ3,毒鱼豆素3, Palustrin_3AR,Ponericin L2, Spinigerin, Melectin, Clavanin B,牛 cathelicidin BMAP-27, BMAP-28,膝鼠cathelicidin CAP11,沙克乳杆菌细菌素(Sakacin) 5X,菌丝霉素(Plectasin),真菌防御素，GLK-19,乳铁蛋白(Lf)肽 2, Kalata B8, Tricyclon A, _蚬抗病毒肽(Alloferon)l，Uperin3.6,Dahlein5.6, Ascaphin-8,人富组蛋白(Histatin)5,豚鼠中性粒细胞 CAP2 和CAP1,厚壳贻贝抗菌肽(Mytilin) B和C,EP5_1和六肽(合成)皮质稳定素(Corticostatin)IV兔中性粒细胞2。
[0066]I 型 RIP 可以:
[0067](i )作为RNA N-糖苷酶作用，该酶水解真核生物核糖体中283_1^應普遍保守的八叠球菌(sarcin) /菌麻毒蛋白(ricin)结构域(S/R结构域)4324位置处的腺苷N-C糖苷键并使其不能进行蛋白合成，由此功能性阻断翻译，
[0068](ii)通过其多核苷酸:腺苷糖苷酶活性的方式直接作用于病毒颗粒或病毒核酸，和/或
[0069](iii)作为DNA糖基化酶/嘌呤(AP)裂解酶作用，该酶能够不可逆放松HIV-1超螺旋DNA并催化双链的断裂，形成无活性产物。
[0070]特别地，I型 RIP 可以选自由 a-Ebulitin，β-Ebulitin，Y -Ebulitin,Nigritin fl，Nigritin f2，Amarandin-S,觅抗病毒 /RIP, Amarandin-l，Amarandin-2,觅色素(Amaranthin)，滨藜(Atriplex patens) RIP，甜菜 RIP，β -vulgin,鸡冠花 RIP，藜 RIP，CAP30B，菠菜(Spinacea oleracea) RIP，Quinqueginsin，Asparin-1, Asparin-2，麦仙翁毒蛋白(Agrostin),石竹素(Dianthin) 29，DAP-30，DAP-32，石竹素30，石竹(Dianthus chinensis) RIPl，石竹 RIP2，石竹 RIP3，剪秋罗苷(Lychnin)，Petroglaucin,Petrograndin,岩生肥阜草(Saponaria ocymoides) RIP，Vacuolas 阜草素(saporin)，阜草素-1，皂草素_2，皂草素_3，皂草素-5，皂草素-6，皂草素-7，皂草素-9，麦蓝菜(Vaccariahispanica) RIP，Benincasin，a-Benincasin，β-Benincasin，Hispin，Byrodin IiByrodinII，大肠杆菌素(Colocin) I，大肠杆菌素 2，黄瓜(Cucumis figarei) RIP, Melonin,南瓜(C.moschata)RIP，Cucurmosin，廣香銷素(Moschatin)，廣香銷素I，廣香銷素II，廣香銷素III，廣香銷素IV，廣香銷素V，Pepocin，绞股蓝毒蛋白(Gynostemmin) I，绞股蓝毒蛋白II，绞股蓝毒蛋白III，绞股蓝毒蛋白IV，绞股蓝毒蛋白V，绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)RIP, Gypsophilin, Lagenin, Luffaculin，Luffangulin,丝瓜素(Luffin)-α，丝瓜素-B，MOR-1, MOR-1I,木鳖子苷(Momordin) II，α -苦瓜素(Momorcharin), β _ 苦瓜素，Y δ-苦瓜素，Y -苦瓜素，木鳖根蛋白(Momorcochin)，木鳖根蛋白-S，佛手瓜蛋白(Sechiumin), Momorgro svin，蛇瓜毒蛋白(Trichoanguin)，a -Kirilowin, β -Kirilowin,α _ 天花粉蛋白(trichosanthin)，TAP-29，括楼素(Trichokirin)，Trichomislin，天花粉蛋白，Karasurin-A，Karasurin-B，马干铃蛋白(Trichomaglin)，Trichobakin，巴豆毒蛋白(Crotin) 2，巴豆毒蛋白3，Euserratinl, Euserratin2,抗病毒蛋白GAP-31，白树毒素(Gelonin)，沙盒树(Hura crepitans) RIP,麻疯树毒蛋白(Curcin)，麻疯树(Jathropacurcas) RIP, Mapalmin，Manutinl, Manutin2，a -pisavin, Charibdin，风信子(Hyacinthusorientalis) RIP，Musaminl, Musamin2，Musamin3，Musamin4，荷兰鸾尾(Iris hollandica)RIP， Cleroendrum aculeatum RIP， CIP-29， CIP-34， Crip-31, Bouganin，三角梅(Bougainvilla spectbilis)RIP，杂交(红)叶子花(Bougainvillea x buttiana)抗病毒蛋白 I (BBAP1)，苹果酸酶(ME1)，ME2，MAP-S，美洲商陆抗病毒蛋白(PAPa-l)，PAPa-2，PAP-a，PAP-L PAP-1I, PAP-S, PD-SI, DP-S2，Dodecandrin，抗病毒蛋白 PAP，PIP, PIP2，八蕊商陆(Phytolacca octandra)抗病毒蛋白，八蕊商陆抗病毒蛋白II，大麦(Hordeum vuIgare)RIP-1，大麦RIP-1I，大麦亚种大麦翻译抑制剂II，黑麦(Secale cerealdRIP，麦芽凝集素(Tritin)，二倍体多年生大会草(Zea diploperemis) RIP I，二倍体多年生大会草RIP II，苹果(Malus X domestica)RIP，苦瓜抗HIV蛋白(MAP30)，大戟科多花白树蛋白(Geloniummultiflorum) (GAP31),美洲商陆抗病毒蛋白(PAP),阔叶寄芋蛋白(Mirabilis expansa)I (ME1)，苹果酸酶(ME2)，杂交(红)叶子花抗病毒蛋白I (BBAP1)，噬菌体MUl，betavulgin(Bvg)，麻疯树毒蛋白 2，皂草素 6，玉米 RIP (B-32)，烟草 RIP (TRIP), Beetin (BE)，BE27，紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)，天花粉蛋白(TCS)，α-丝瓜素，α-苦瓜素(α-MMC)，β-MMC丝瓜素，Ocymoidin, Bryodin, Pepopsin, β -天花粉蛋白，樟脑水杨酸钠(Camphorin), YLP,岛藤喊(Insularin),大麦 RIP,麦芽凝集素，Lamjarin,和草燕(Volvariella volvacea) RIP组成的组。
[0071]根据本发明任一方面的融合蛋白可以是能够广谱应用的抗微生物化合物，并且不像本领域已知的某些化合物，其可以不受原料供应的任何限制来经济地生产。根据本发明任一方面的融合蛋白因此可以不受原料供应的任何限制来经济地大规模生产。
[0072]为了获得广谱的活性，根据本发明任一方面的融合蛋白可以能以多种不同途径，这就是说，以病毒进入抑制，病毒融合抑制，病毒整合酶抑制和病毒翻译抑制来干扰病毒感染和传播过程。融合肽因此可以具有多功能性能。由此可以从根据本发明任一方面的融合蛋白来生产全新类型的抗病毒药物。可以从作为融合抗病毒蛋白表达的多肽A，B和C获得的组合和排列的数量潜在的数以万计。
[0073]特别地，融合蛋白可以包括选自式1-XIII组成的组的至少一种结构式:
[0074]式1:A-B-C，
[0075]式II:A-B-C-C,
[0076]式III:A-B,
[0077]式IV:A-C-B,.
[0078]式V: C-A-B,
[0079]式VI:C-B-A
[0080]式VI1:C-B，
[0081]式VII1:B-A-C，
[0082]式IX:B-A-C-C,
[0083]式X: B-C-A,
[0084]式XI:B-A-C,
[0085]式XI1:B-C，
[0086]式XII1:B-A，
[0087]式XIV =C-C-B-C-C,
[0088]式XV: C-B-C。
[0089]其中多肽A可以为Θ防御素，其类似物或片段，多肽B可以为I型RIP，或其片段，而多肽C可以为CAP，或其片段；而-可以为直接连接或连接肽。
[0090]特别地，连接肽可以包括多肽序列:[VPXVG]n，(SEQ ID NO:11)，其中X为未知的或其他氨基酸而η为每个连接肽中SEQ ID Ν0:11的重复数。例如，η可以是1，2，3，4或5。更特别地，SEQ ID NO:11中X为G而η为2。
[0091]特别地，融合蛋白可以包括式1:
[0092]A-B-C-[0093]其中多肽A为Θ防御素，其类似物或片段，多肽B可以为I型RIP，或其片段，而多肽C可以为CAP，或其片段，而-可以为直接连接或连接肽。
[0094]更特别地，多肽A可以通过至少一个SEQ ID NO:11的第一连接肽与多肽B融合。甚至更特别地，多肽A可以通过SEQ ID N0:11的肽与多肽B融合，其中X为G而η为2。多肽B可以不用中间的连接肽直接连接到多肽C。式I中的多肽C可以在不连接B的游离段包括第二连接肽。第二连接肽可以包括式SEQ ID NO=Il0甚至更具体的，在第二连接肽中X为G而η为2。
[0095]多肽A可以是脊椎动物或无脊椎动物来源的Θ防御素。特别地，Θ防御素可以来自细菌，真菌，哺乳动物，两栖类或爬行动物。哺乳动物可以是非人灵长类动物和/或无脊椎动物可以是鲎和/或昆虫。Θ防御素可以选自由来自猕猴的分别为SEQ ID NOs:15-20的恒河猴小防御素(minidefensin) (RTD-1), RTD-2, RTD-3, Retrocyclin-1, Retrocyclin-2,Retrocyclin-3 等组成的组(Tang YQ, 1999; Leonava L, 2001; Wang W,2004)。
[0096]Θ防御素可以是合成的并可以选自由序列分别为SEQ ID NOs:21_33的retrocyclin 同源物 RC100-RC108 和 RCl 10-RC114 组成的组(Cole 等 Λ, 2002:PNAS,V99(4):1813-1818;ffang 等人，2003:J.1mmunol.170:4708-4716)。 Retrocyclin (RC)100-108和RC110-114的序列示于下面表Ia中。
[0097]
【权利要求】
1.一种融合蛋白，其包含至少一种I型核糖体失活蛋白(RIP)或其片段，多肽B ;以及 (i)至少一种能抑制病毒进入的多肽A ;和/或 (?)至少一种阳离子抗微生物肽(CAP)或其片段，多肽C。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述多肽A为Θ防御素，其类似物或片段。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括结构A-B-C，A-C-B,C-A-B，C-B-A，B-A-C，B-C-A, A-B-C-C, A-B，B-A，B-C，C-B，C-B-C,或 C-C-B-C-C。
4.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含多肽A，B和C。
5.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽A，B和C直接相互连接。
6.根据权利要求1到5任一项所述的融合蛋白，其在所述多肽A，B和C每个之间进一步包含至少一个连接肽。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述连接肽具有SEQID NO=Il0
8.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽A选自由恒河猴小防御素(RTD-1), RTD-2, RTD-3, Retrocyclin-1, Retrocyclin-2, Retrocyclin-3,合成的Retrocyclin 同源物 RC100, RC101, RC102, R`C103, RC104, RC105, RC106, RC107, RC108,RCl 10，RC111, RCl 12，RCl 13 和 RCl 14 组成的组。
9.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中I型RIP(多肽B)选自由Ebulitins，Nigritins, Amarandins,觅抗病毒 /RIP,觅色素，滨藜 RIP,甜菜 RIP, β -vulgin,鸡冠花 RIP7 藜 RIP, CAP30B,菠菜 RIP, Quinqueginsin, Asparins,麦仙翁毒蛋白，石竹素，DAPs,石竹的，剪秋罗苷，Petroglaucin, Petrograndin,岩生肥阜草 RIP, Vacuolas 阜草素，阜草素，麦蓝菜 RIP, Benincasins, Hispin, Byrodins,大肠杆菌素，Cucumis f igareiRIP, Melonin,南瓜RIP, Cucurmosin,磨香蛾素，Pepocin,绞股蓝毒蛋白，绞股蓝RIP,Gypsophilin, Lagenin, Luffaculin, Luffangulin,丝瓜素，MORs,木鳘子苷 II,苦瓜素，木鳘根蛋白，木鳘根蛋白-S,佛手瓜蛋白，Momorgrosvin,蛇瓜毒蛋白，Kiri lowin, α -天花粉蛋白，ΤΑΡ-29,括楼素，Trichomislin,天花粉蛋白，Karasurin,马干铃蛋白，Trichobakin,巴豆毒蛋白，Euserratin抗病毒蛋白GAP-31，白树毒素，沙盒树RIP，麻疯树毒蛋白，麻疯树 RIP, Mapalmin, Manutins, a -pisavin, Charibdin,风信子 RIP, Musamin,荷兰鳶尾RIP, Cleroendrum aculeatum RIP, CIPs), Crip-31, Bouganin,三角梅 RIP,杂交(红)叶子花抗病毒蛋白I (BBAP1)，苹果酸酶，MAP-S，美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)，PD-SI, DP-S2，Dodecandrin, PIP, PIP2，八蕊商陆抗病毒蛋白，大麦RIP，大麦亚种大麦翻译抑制剂II，黑麦RIP，麦芽凝集素，二倍体多年生大刍草RIPs，苹果RIP，苦瓜抗HIV蛋白，大戟科多花白树蛋白，阔叶寄芋蛋白1，噬菌体MUl，betavulgin (Bvg)，麻疯树毒蛋白2，皂草素6，玉米RIP(B-32)，烟草RIP (TRIP), Beetins，紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)，天花粉蛋白(TCS)，丝瓜素，苦瓜素，Ocymoidin, Bryodin, Pepopsin, β -天花粉蛋白，樟脑水杨酸钠，YLP,岛藤碱,大麦RIP，麦芽凝集素，Lamjarin，和草菇RIP组成的组。
10.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中CAP蛋白(多肽C)选自由环肽，Siamycins, NP-06,短杆菌肽A,环状杆菌素，Kalatas,银杏抗菌蛋白基因，a-Basrubin,Lunatusin,防御蛋白样蛋白，Tricyclon A, Cycloviolacins,當肽，hfl-B5,内源性抗微生物多肽(猪 Cathelicidin)，大鼠防御素，人 β -防御素,Temporins, Caerins, Ranatuerins,爬行动物防御素，毒鱼豆素，乳铁素B,兔中性粒细胞,兔α-防御素，Retrocyclins,人α _防御素，人β _防御素III (HBD3),恒河猴minidefensin (RTD-1, Θ防御素),恒河猴Θ防御素，人中性粒细胞肽，杀菌肽As，蜂毒肽，EP5-1，马加宁2s，杂种(CE-MA)，hepcidinTH1-5, Epinecidin-1, 口引哚菌肽，Cathelicidin-4, LL_37Cathelicidin,皮抑菌肽，Maximins, Brevinins, Ranatuerins, Esculent ins, Maculat in 1.3, Maximin H5 和毒鱼豆素，Mundticin KS 恩特洛霉素 CRL-35，Lunatusin, FK-13 (G1-20 为衍生物)，速普肽，a-MSH，抗病毒蛋白 Υ3, Palustrin_3AR, Ponericin L2, Spinigerin, Melectin, Clavanin B,牛抗菌肽，豚鼠cathelicidin CAPlI，沙克乳杆菌细菌素5X，菌丝霉素，真菌防御素，GLK-19，乳铁(Lf)肽2,1?蚬抗病毒肽I, Uperin3.6, Dahlein5.6, Ascaphin-8,人富组蛋白5,豚鼠中性粒细胞，厚壳贻贝抗菌肽，EP5-1，六肽(合成)皮质稳定素IV兔中性粒细胞2，Aureins,Latarcin,菌丝霉素，Cycloviolins, Varv 妝 E, Palicourein, VHL-1,和 Buforins 组成的组。
11.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述I型RIP为MAP30，所述CAP为皮抑菌肽而所述多肽A为Retrocyclin。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述皮抑菌肽为皮抑菌肽I而所述Retrocyclin 为 RetrocyclinlOl。
13.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，包括氨基酸序列SEQID N0:1。
14.根据前面权利要求任一项所述的融合蛋白，其适合口服施用。
15.一种分离的核酸分子，其能够表达根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白。·
16.一种质粒或载体，其包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求15所述的核酸分子和/或根据权利要求16所述的质粒或载体。
18.—种生产根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白的方法，包括在表达融合蛋白的条件下培养根据权利要求17所述的宿主细胞。
19.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述组合物适合口服施用。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的药物组合物，其进一步包括至少一种药学可接受载体，赋形剂，稀释剂和/或表面活性剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自由熊去氧胆酸钠，甘氨酰熊去氧胆酸钠，熊去氧胆酸钾，甘氨酰熊去氧胆酸钾，熊去氧胆酸亚铁，甘氨酰熊去氧胆酸亚铁，熊去氧胆酸铵，甘氨酰熊去氧胆酸铵，牛磺熊去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸钠，牛磺熊去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸钾，牛磺熊去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸亚铁，牛磺熊去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸铵，N-甲基牛磺熊去氧胆酸钠，N-甲基牛磺熊去氧胆酸钾，N-甲基牛磺熊去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺熊去氧胆酸铵，胆酸钠，去氧胆酸钠，胆酸钾，去氧胆酸钾，胆酸亚铁，去氧胆酸亚铁，胆酸铵，去氧胆酸铵，鹅去氧胆酸钠，甘氨酰胆酸钠，鹅去氧胆酸钾，甘氨酰胆酸钾，鹅去氧胆酸亚铁，甘氨酰胆酸亚铁，鹅去氧胆酸铵，甘氨酰胆酸铵，牛磺胆酸钠，N-甲基甘氨酰胆酸钠，牛磺胆酸钾，N-甲基甘氨酰胆酸钾，牛磺胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰胆酸亚铁，牛磺胆酸铵，N-甲基甘氨酰胆酸铵，N-甲基牛磺胆酸钠，甘氨酰去氧胆酸钠，N-甲基牛磺胆酸钾，甘氨酰去氧胆酸钾，N-甲基牛磺胆酸亚铁，甘氨酰去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺胆酸铵，甘氨酰去氧胆酸铵，牛磺去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰去氧胆酸钠，牛磺去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰去氧胆酸钾，牛磺去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰去氧胆酸亚铁，牛磺去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰去氧胆酸铵，N-甲基牛磺去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸钠，N-甲基牛磺去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸钾，N-甲基牛磺去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸铵，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸钠，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸钾，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸铵，熊去氧胆酸乙酯，熊去氧胆酸丙酯，甘氨酰鹅去氧胆酸钠，甘氨酰鹅去氧胆酸钾，甘氨酰鹅去氧胆酸亚铁，甘氨酰鹅去氧胆酸铵，牛磺鹅去氧胆酸钠，牛磺鹅去氧胆酸钾，牛磺鹅去氧胆酸亚铁，牛磺鹅去氧胆酸铵，和去氧胆酸钠组成的组。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为去氧胆酸钠。
24.一种在有需要的脊椎动物和无脊椎动物中治疗和/或防止微生物感染的方法，包括给脊椎动物和无脊椎动物施用有效量的根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白或根据权利要求19到23任一项所述的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述微生物感染为病毒感染。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述脊椎动物为哺乳动物，鱼类或鸟类。
27.根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白或根据权利要求19到23任一项所述的药物组合物在医药中的用途。
28.根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白或根据权利要求19到23任一项所述的药物组合物在脊椎动物，无脊椎动物或植物中治疗和/或防止微生物感染中的用途。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白和/或药物组合物，其中所述微生物感染为病毒感染。
30.根据权利要求1到14任一项所述的融合蛋白或根据权利要求19到23任一项所述的药物组合物，在制备用于在脊椎动物或无脊椎动物中治疗和/或防止微生物感染的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述微生物感染为病毒感染。
【文档编号】C12N15/11GK103429621SQ201280011838
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年1月9日 优先权日:2011年1月7日
【发明者】艾格·穆罕默德萨加夫·阿布巴卡尔, 英焕·瓮 申请人:威联生物制药私人有限公司