生物体试样中的l-色氨酸分析方法以及用于该方法的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种包括将样品、L-色氨酸氧化酶和水混合的步骤、将所得反应液在氧的存在下放置指定时间的步骤、测定放置后的反应液中存在的因所述酶的作用而产生的反应产物的步骤的L-色氨酸的定量方法。所述L-色氨酸氧化酶具有指定氨基酸序列，且具有在氧和水的存在下，作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0～3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性。本发明还公开了包含上述L-色氨酸氧化酶的L-色氨酸的定量用试剂盒和使用上述L-色氨酸氧化酶的酶传感器。本发明的方法、试剂盒和酶传感器使用了L-色氨酸特异性酶，因此即使在其他氨基酸共存下也能对L-色氨酸进行定量。
【专利说明】生物体试样中的L-色氨酸分析方法以及用于该方法的试剂盒
[0001]相关申请的相互引用
[0002]本申请要求2011年3月4日申请的日本特愿2011-48101号的优先权，其全部内容在此援引作为特别公开。
【技术领域】
[0003]本发明涉及使用L-色氨酸氧化酶的L-色氨酸分析方法以及用于其的试剂盒，其中，所述L-色氨酸氧化酶适合于将生物体试样中的L-色氨酸转化为可定量的产物、通过该产物的检测或定量来测定L-色氨酸的含量。
【背景技术】
[0004]以血中为代表的生物体试样中的氨基酸浓度的定量是各种疾病检测的标志物，其定量方法的开发是医疗立场上强烈需求的。氨基酸浓度的酶定量方法与仪器分析相比具有迅速、简便等特点，是一种适合于在实际的医疗现场进行各种疾病检测的方法。
[0005]作为对L-色氨酸进行酶学定量的传统技术，已知有使用(i)L_色氨酸单加氧酶(非专利文献A、非专利文献B)、和(ii)L-氨基酸氧化酶的方法(专利文献A)。
[0006]专利文献A:日本特开2001-069974号公报
[0007]非专利文献 A:Emanuele, J.J.,Heasley, C.J., and Fitzpatrick,P.F.(1995) ArchBiochem Biophys316，241-248
[0008]非专利文献B:Simonian，A.L.，Rainina，E.1.，Fitzpatrick, P.F.，and Wild,J.R.(1997)Biosens Bioelectronl2，363-371
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[0010]非专利文献D:0naka，H.，Taniguchi，S.，Igarashi, Y.，and Furumai, T.(2002) JAntibiot55，1063-1071
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【发明内容】
[0017]在上述的使用(i)L_色氨酸单加氧酶的方法中，有必要检测伴随L-色氨酸氧化的氧减少量。因此，需要原理上复杂的装置(非专利文献B)。此外，上述L-色氨酸单加氧酶在对L-色氨酸的活性设为100%时，对L-苯丙氨酸显示出83%、对L-甲硫氨酸显示出42%的高相对活性(非专利文献A)。因而，使用该酶的方法不适合进行简便、廉价且L-色氨酸特异性高的检测。
[0018]对于上述的使用(ii)L-氨基酸氧化酶的方法，公知的L-氨基酸氧化酶一般而言底物特异性低，L-色氨酸以外的多种L-氨基酸也可作为反应底物。因此，尚不知晓在杂质存在下利用L-氨基酸氧化酶进行L-色氨酸特异性检测的例子。例如，作为L-氨基酸氧化酶，已知蛇毒中的多种酶。但是，上述酶均对广泛的氨基酸种类具有活性(非专利文献E、F)。此外，软体动物、细菌来源的L-氨基酸氧化酶也有报告。但是，这些也均已知底物特异性宽泛(非专利文献G，H，I，J)，使用这些酶对L-色氨酸进行定量在原理上是不可能的。
[0019]作为对L-色氨酸的底物特异性较高的酶,报告了担子菌Coprinus sp.来源的L-氨基酸氧化酶(专利文献A)。但，上述酶对L-苯丙氨酸等其他种类的氨基酸也显示7%左右的反应性。因而，依然不适合于杂质多的生物体试样的测定。此外，上述酶对L-色氨酸的Km值为650 μ Μ，为了对血中中仅以数十μ Μ数量级的浓度存在的L-色氨酸准确进行定量，底物亲和性低也成为问题。实际上，目前为止尚不知有使用L-氨基酸加氧酶对试样中的L-色氨酸进行定量的例子。而且，上述酶未经基因鉴定，担子菌的长期(约1个月)培养和复杂的纯化过程对其制造而言是必要的。基于以上理由，利用上述酶的生物体试样中的L-色氨酸定量、以及需要大量的酶的实用化是困难的。
[0020]因此，本发明的目的在于，探索即使在共存有其他氨基酸的生物体试样中，也能够用于L-色氨酸特异性定量的新酶，提供使用该酶的、L-色氨酸的新的分析方法。
[0021 ] 而且，本发明的目的还在于提供可在实施上述酶的分析方法时利用的测定用试剂盒。而且，本发明的目的还在于提供可在上述酶的分析方法中利用的酶传感器。
[0022]本发明人从细菌的双吲哚类抗生素生物合成途径中的基因中发现了对L-色氨酸底物特异性高的L-色氨酸氧化酶。通过使该酶与生物体试样中所含的L-色氨酸反应，可以生成可检测的化合物，而且，发现该酶不受生物体试样中混合存在的其他氨基酸的影响，能够进行L-色氨酸特异性定量，从而完成了本发明。
[0023]本发明如下。
[0024][1], 一种分析样品中的L-色氨酸的方法，所述方法包括
[0025]步骤(Α):将样品、L-色氨酸氧化酶以及水混合，
[0026]步骤(Β):将通过所述混合而得到的反应液在氧的存在下放置指定时间，
[0027]步骤(C):对放置后的反应液中存在的因所述酶的作用而产生的反应产物中的至少一种的存在进行确认，或对所述反应产物中的至少一种的量进行测定；
[0028]其中，在所述L-色氨酸氧化酶中
[0029](al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且[0030](a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；
[0031](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列；
[0032](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或
[0033](3)与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0034][2],根据[1]所述的方法，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L_苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。 [0035][3], [1]或[2]所述的方法，其中，在步骤㈧中用于与样品混合的所述L-色氨酸氧化酶在所述酶的稳定剂的存在下保存。
[0036][4],根据[3]所述的方法，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
[0037][5], [1]~[4]中任一项所述的方法，其中，所述步骤(C)中进行确认或测定的反应产物是过氧化氢。
[0038][6],包含以下试剂的用于L-色氨酸分析的试剂盒:(K1)L_色氨酸氧化酶，所述L-色氨酸氧化酶
[0039](al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且
[0040](a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；
[0041](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列；
[0042](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或
[0043](3)与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0044][7], [6]所述的试剂盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L_苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0045][8], [6]或[7]所述的试剂盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶是与所述酶的稳定剂的混合物。
[0046][9],根据[8]所述的试剂盒，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
[0047][10].根据[6]~[9]中任一项所述的试剂盒，其还包含(K2)反应用缓冲液、(K3)过氧化氢检测用试剂、(K4)氨检测试剂和(K5)吲哚丙酮酸检测试剂中的至少一种。
[0048][11].一种含L-色氨酸氧化酶的用于L-色氨酸分析的组合物，其中，在所述L-色氨酸氧化酶中
[0049](al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且
[0050](a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；
[0051](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列；
[0052](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或
[0053](3)与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0054][12].根据[11]所述的组合物，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L_苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0055][13].根据[11]或[12]所述的组合物，其中，含有所述酶的稳定剂。
[0056][14].根据[13]所述的组合物，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
[0057][15].—种使用L-色氨酸氧化酶的用于L-色氨酸的检测或定量的酶传感器，其中，所述检测用电极是过氧化氢检测用电极，且所述L-色氨酸氧化酶
[0058](al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且
[0059](a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；
[0060](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列；
[0061](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或
[0062](3)与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨
基酸序列。
[0063][16].根据[15]所述的酶传感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L_苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
[0064][17].根据[15]或[16]所述的酶传感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶与所述酶的
稳定剂一起使用。
[0065][18].根据[17]所述的酶传感器，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
[0066][19.]根据[15]~[18]中任一项所述的酶传感器，其中，过氧化氢检测用电极是酶式过氧化氢电极或隔膜式过氧化氢电极。
【发明内容】
[0067]根据本发明，通过使用对L-色氨酸特异性的色氨酸氧化酶，即使在包含其他氨基酸等许多杂质的试样中，也能够L-色氨酸特异地进行迅速、简便的检测。特别是，对于血浆、血清或尿这样的生物体试样，本发明是有效的，通过与过氧化物酶等酶偶联，不仅能够采用生色法、荧光法对L-色氨酸进行定量，还能够提供电极型酶传感器。【专利附图】
【附图说明】[0068][图1]显示各L-色氨酸浓度中的StaO的活性。
[0069][图2]显示StaO引起的L_色氨酸标准曲线制作样品的吸光度的时间性变化。
[0070][图3]显示利用使用StaO的样品制作的L-色氨酸标准曲线。
[0071][图4]显示VioA引起的L-色氨酸标准曲线制作样品的吸光度的时间性变化。
[0072][图5]显示利用使用VioA的样品制作的L-色氨酸标准曲线。
[0073][图6]显示利用仪器分析或L-色氨酸氧化酶进行的人血浆试样中L-色氨酸定量结果。
[0074][图7]显示各种甘油浓度存在下的StaO残存活性的时间性变化。
[0075][图8]显示各种甘油浓度存在下的VioA残存活性的时间性变化。
[0076][图9]显示10%甘油存在下或不存在下的、4°C或_80°C过夜保存VioA后的残存活性。
[0077]发明的【具体实施方式】
[0078]<L-色氨酸的分析方法>
[0079]本发明的L-色氨酸的分析方法包括:将样品和L-色氨酸氧化酶和水混合的步骤(A);将通过所述混合而得 到的反应液在氧的存在下放置指定时间的步骤(B);确认放置后的反应液中存在的因所述酶的作用而产生的反应产物中的至少一种的存在、或者测定所述反应产物中的至少一种的量的步骤(C);其是通过这些步骤来确认样品中的L-色氨酸的存在、或对其进行定量的方法。
[0080]在本发明的方法中，作为样品使用的生物体试样是具有包含L-色氨酸的可能性的试样即可，可以是任何生物体试样。生物体试样可以根据通过使L-色氨酸氧化酶作用于生物体试样、对哪个产物进行确认或定量，来对生物体试样中的L-色氨酸进行确认或对其浓度进行测定，来适宜地选择。例如，在利用生色剂、荧光剂对上述产物进行确认或定量的情况下，优选无色的水溶液，作为例子可以列举出血清和血浆等。
[0081]本发明中使用的所述L-色氨酸氧化酶
[0082](al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，且对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性。
[0083](1)序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列；
[0084](2)在序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列中，具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或
[0085](3)与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列
[0086](1)具有序列表的SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性的酶是VioA,其是紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)来源的酶。VioA是作为催化紫色色杆菌生产的抗生素紫色杆菌素的生物合成途径的一部分的酶被鉴定出来的，该酶被报告具有L-色氨酸氧化活性(非专利文献C)。但是，本酶的以底物特异性为代表的酶学的性质目前尚未开展研究，因而，VioA是具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，且对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸不具有氧化酶活性的酶这一事实，是在本发明中首次明确的。而且，对于将VioA用于L-色氨酸的定量，目前尚无报告。
[0087](1)具有序列表的SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下，作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性的酶是作为链霉菌属种(Streptomyces sp.) TA-A0724来源的酶的StaO。关于StaO,该酶的基因是在该菌所生产的抗生素星形孢菌素(staurosporine)的生物合成基因簇中被发现的(非专利文献D)。本基因与上述VioA的基因不具有显著同源性，此外，对基因产物未进行过生化解析，其基因产物的性质是未知的。因而，StaO是具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸不具有氧化酶活性的酶这一事实，是在本发明中首次明确的。
[0088]而且，在本说明书中，“对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%”中的“对L-苯丙氨酸的氧化酶活性”和“对L-色氨酸的氧化酶活性”是指:在实施例中的“4.L-色氨酸氧化酶对氨基酸的底物特异性”的试验方法中，分别使用L-苯丙氨酸和L-色氨酸作为组成蛋白质的氨基酸的情况下得到的相对活性。上述“4.L-色氨酸氧化酶对氨基酸的底物特异性”的试验方法中得到的活性值的检测限均为0.5%。此外，本发明中使用的L-色氨酸氧化酶从提高分析精度的观点来看，优选对L-苯丙氨酸的氧化酶活性为对L-色氨酸的氧化酶活性的0~2%的范围，更优选0~1.5%的范围，更优选0~1%的范围。
[0089]而且，“对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸不具有氧化酶活性”中的“对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸的氧化酶活性”是指:在实施例中的“4.L-色氨酸氧化酶对氨基酸的底物特异性”的试验方法中，作为组成蛋白质的氨基酸分别使用L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸的情况下所得的相对活性。而且，“不具有氧化酶活性”是指相对活性为1%以下，优选不显示超过检测限(0.5%)的相对活性。
[0090]而且，具有作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性、对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%、对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性，这些分别可以采用实施例所述的分析方法(定量方法)来确认。此外，组成蛋白质的氨基酸是指:L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-。
[0091]本说明书中提及的“具有1~50个的氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列”中的“1~50个”的范围是指:具有缺失等的蛋白质是具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸不具有氧化酶活性的酶。所述“1~50个”的范围从是具有所述氧化酶活性的蛋白质的比例高的观点来看，可以是例如，1~40个、优选1~30个、更优选1~20个、更优选1~10个、更优选1~7个、更优选1~5个、特别优选1~3个左右。
[0092]本说明书中提及的“与序列表的SEQ ID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列”中的同一性是指:具有所述氨基酸序列的同一性的蛋白质是具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%的范围，对L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的氨基酸不具有氧化酶活性的酶即可，没有特殊限制。所述氨基酸序列的同一性是90%以上即可，没有特殊限制，优选95%以上、更优选96%以上、更优选97%以上、更优选98%、特别优选99%以上。
[0093]本发明中使用的L-色氨酸氧化酶不限于是由特定的种生产的，其是指:伴随特异地对L-色氨酸的氨基的氧化脱氨基化，生产过氧化氢。
[0094]而且，本发明中使用的L-色氨酸氧化酶具有同样的活性即可，包括从自然界分离出的生物来源的，也包括将编码本酶的基因以大肠杆菌、其他生物作为宿主进行表达而得到的酶或蛋白质。
[0095]此外，作为利用异种表达的生产方法，可以列举出例如，由从具有同样的活性的生物物种抽提的基因组DNA对该基因进行PCR扩增，将其插入pET或pUC等中构建质粒载体，然后转化BL21、JM109等宿主菌株，再进行培养的方法。也可以适宜采用这些以外的公知的方法。
[0096]对于本发明中使用的L-色氨酸氧化酶的取得方法没有特殊限制，可以是化学合成的蛋白质，也可以是采用基因重组技术制作的重组蛋白质。在制作重组蛋白质的情况下，如后述地取得编码该蛋白质的基因(DNA)。通过将该DNA导入适当的表达系统，可以产生上述的L-色氨酸氧化酶。
[0097]上述L-色氨酸氧化酶可以通过下述上述生产方法来制备，所述生产方法包括:将编码L-色氨酸氧化酶的基因搭载在载体上，利用该载体转化宿主细胞后，培养转化的宿主细胞，在培养物中蓄积编码所述基因的蛋白质，收集蓄积的蛋白质。
[0098]对编码上述L-色氨酸氧化酶的基因的取得方法没有特殊限制。编码本发明的L-色氨酸氧化酶的基因例如可以基于SEQ ID NO:1或者2所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:3或者4所记载的碱基序列的信息，采用化学合成、基因工程方法或突然诱变等本领域技术人员已知的任意方法来制作。
[0099]可以通过采用例如，对于具有序列表的SEQ ID NO:3或4所述的碱基序列的DNA，使之与作为突变原的药物接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程的方法等来进行。作为基因工程方法之一的定点诱变是一种能够针对特定的位置导入特定的突变的方法，因而是有用的，可以采用公知方法 来进行。
[0100]基于本说明书中的序列表的SEQ ID NO:1或者2所记载的氨基酸序列或SEQ IDNO:3或者4所示的碱基序列的信息，制备适当的探针、引物，通过使用它们对紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或链霉菌属种(Streptomyces sp.) TA-A0724的基因组文库进行筛选，能够分离出本发明的基因。基因组文库可以从紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或链霉菌属种(Streptomyces sp.) TA-A0724 米用常规方法来制作。[0101]还可以采用PCR法取得编码本发明的L-色氨酸氧化酶的基因。使用上述紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) NBRC12614 或链霉菌属种(Streptomyces sp.) TA-A0724的基因组文库作为模板，使用设计成可扩增SEQ ID NO:3或者4所记载的碱基序列的1对引物，进行PCR。PCR的反应条件可以适宜设定，可以列举出例如下述条件等:将由94°C 30秒(变性)、55°C 30秒~1分钟(退火)、72°C 2分钟(延伸)组成的反应步骤作为1个循环，例如进行30个循环后，72°C反应7分钟。然后，可以将扩增得到的DNA片段克隆至可在大肠杆菌(E.coli)等宿主中扩增的适合的载体中。
[0102]上述的探针或引物的制备、基因组文库的构建、基因组文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作可以按照本领域技术人员已知的方法适宜进行。
[0103]上述L-色氨酸氧化酶的基因可以插入到适当的载体中来使用。对本发明中使用的载体的种类没有特殊限制，例如，可以是可自主复制的载体(例如质粒等)，或者可以是导入到宿主细胞中时能够整合到宿主细胞的基因组中、并与被整合的染色体一起复制的载体。优选载体是表达载体。在表达载体中，上述基因与转录所必需的元件(例如启动子等)可操作连接。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适宜选择。
[0104]作为可在细菌细胞中工作的启动子，可以列举出:嗜热脂肪土芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、地衣芽胞杆菌α 淀粉酶基因(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、解淀粉芽胞杆菌BAN淀粉酶基因(Bacillus amylo liquefaciens BAN amylase gene)、枯草芽抱杆菌喊性蛋白酶基因(Bacillus subtilis alkaline protease gene)或短小芽抱杆菌木糖苷酶基因(Bacilluspumilus xylosidase gene)的启动子、或Lambda曬菌体的PK或者Pl启动子、大肠杆菌(E.coli)的lac、trp或者tac启动子等。
[0105]作为可以在哺乳动物细胞中工作的启动子的例子，有SV40启动子、MT-1 (金属硫蛋白基因)启动子、或腺病毒2主后期启动子等。作为可以在昆虫细胞中工作的启动子的例子，多角体蛋白启动子、P10启动子、Autographa californica polyhedrosis碱性蛋白启动子、棒状病毒即时型早期基因1启动子、或棒状病毒39K延迟型早期基因启动子等。作为可以在酵母宿主细胞中工作的启动子的例子，可以列举出酵母解糖系基因来源的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1启动子、ADH2-4C启动子等。作为可以在丝状真菌细胞中工作的启动子的例子，有ADH3启动子或tpiA启动子等。
[0106]此外，上述L-色氨酸氧化酶的基因可以视需要与适合的终止子可操作连接。含L-色氨酸氧化酶的基因的重组载体还可以具有Poly A信号(例如SV40或腺病毒5Elb区域来源的)、转录增强子序列(例如SV40增强子)等元件。含L-色氨酸氧化酶的基因的重组载体还可以具备使得该载体能够在宿主细胞内复制的DNA序列，作为一例，可以列举出SV40复制起点(宿主细胞为哺乳类细胞时)。
[0107]含L-色氨酸氧化酶的基因的重组载体还可以含有选择标志物。作为选择标志物，可以列举出例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI基因等这样的宿主细胞内缺乏其补体的基因，或者例如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素或者潮霉素这样的药物抗性基因。将L-色氨酸氧化酶的基因、启动子、和视需要的终止子和/或分泌信号序列分别连接，再将其插入适合的载体的方法是本领域技术人员周知的。[0108]通过将含L-色氨酸氧化酶的基因的重组载体导入适当的宿主，可以制作转化体。被导入含L-色氨酸氧化酶的基因的重组载体的宿主细胞表达L-色氨酸氧化酶的基因即可，可以是任意细胞，可以列举出细菌、酵母、真菌和高等真核细胞等。
[0109]作为细菌细胞的例子，可以列举出芽孢杆菌或streptomyces等革兰氏阳性菌或大肠杆菌(E.coli)等革兰氏阴性菌。这些细菌的转化可以采用原生质体法、或按公知的方法使用感受态细胞来进行。作为哺乳类细胞的例子，可以列举出HEK293细胞、HeLa细胞、COS细胞、BHK细胞、CHL细胞或CH0细胞等。转化哺乳类细胞、并在该细胞中表达导入的DNA序列的方法也是公知的，可以采用例如，电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法等。
[0110]作为酵母细胞的例子，可以列举出属于酵母或裂殖酵母的细胞，可以列举出例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)等。作为对酵母宿主导入重组载体的方法，可以列举出例如，电穿孔法、球状体法、醋酸锂法等。 [0111]作为其他真菌细胞的例子，是丝状真菌，例如属于曲霉、脉孢菌、镰孢菌、或木霉菌的细胞。在使用丝状真菌作为宿主细胞的情况下，可以通过将DNA构建物整合至宿主染色体得到重组宿主细胞。来进行转化。DNA构建物对宿主染色体的整合可以采用公知方法、例如同源重组或非同源重组来进行。
[0112]在使用昆虫细胞作为宿主的的情况下，可以采用公知的方法将重组基因导入载体和棒状病毒共导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清中中得到重组病毒后，在用重组病毒感染昆虫细胞，从而表达蛋白质。
[0113]作为棒状病毒，可以使用例如，作为感染夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
[0114]作为昆虫细胞，可以使用作为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞的Sf9、Sf21〔棒状病毒表达载体，实验室操作手册，W.H.Freeman and Company, (NewYork)、(1992)〕、作为甘蓝尺蠖(Trichoplusia ni)的卵巢细胞的 HiFive (Invitrogen 公司制造)等。
[0115]作为用于制备重组病毒的、针对昆虫细胞的重组基因导入载体以及上述棒状病毒的共导入方法，可以列举出例如，磷酸钙法或脂质体法等。
[0116]将上述的转化体在导入的基因可表达的条件下在适合的营养培养基中进行培养。为了从转化体的培养物分离纯化出本发明中使用的L-色氨酸氧化酶，可以采用通常的蛋白质分离、纯化方法。例如，在本发明中使用的L-色氨酸氧化酶以溶解于细胞内的状态表达的情况下，培养结束后，将细胞通过离心分离回收，悬浮于水系缓冲液后，利用超声波破碎机等破碎细胞，得到无细胞抽提液。从将该无细胞抽提液离心分离而得到的上清中，单独或组合使用通常的蛋白质分离纯化方法，即溶剂抽提法、利用硫酸铵等进行的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂进行的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)琼脂糖等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，可以以纯化标准品的形式得到本发明的L-色氨酸氧化酶。
[0117]利用L-色氨酸氧化酶进行的L-色氨酸的氧化反应如以下的反应式A所示。
[0118][化学式1][0119]
【权利要求】
1.一种分析样品中的L-色氨酸的方法，所述方法包括步骤(A):将样品、L-色氨酸氧化酶以及水混合，步骤(B):将通过所述混合而得到的反应液在氧的存在下放置指定时间，步骤(C):对放置后的反应液中存在的因所述酶的作用而产生的反应产物中的至少一种的存在进行确认，或对所述反应产物中的至少一种的量进行测定；其中，在所述L-色氨酸氧化酶中(al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或(3)与序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(A)中用于与样品混合的所述L-色氨酸氧化酶在所述酶的稳定剂的存在下保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
5.权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(C)中进行确认或测定的反应产物是过氧化氢。
6.包含以下试剂的用于L-色氨酸分析的试剂盒:(Kl)L-色氨酸氧化酶，在所述L-色氨酸氧化酶中，(al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或(3)与序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
8.权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述(Kl)L-色氨酸氧化酶是与所述酶的稳定剂的混合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
10.根据权利要求6~9中任一项所述的试剂盒，其还包含(K2)反应用缓冲液、(K3)过氧化氢检测用试剂、(K4)氨检测试剂和(K5)吲哚丙酮酸检测试剂中的至少一种。
11.一种含L-色氨酸氧化酶的用于L-色氨酸分析的组合物，其中，在所述L-色氨酸氧化酶中(al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或(3)与序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
13.根据权利要求11或12所述的组合物，其中，含有所述酶的稳定剂。
14.根据权利要求13所述的`组合物，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
15.一种使用L-色氨酸氧化酶的用于L-色氨酸的检测或定量的酶传感器，其中，所述检测用电极是过氧化氢检测用电极，且在所述L-色氨酸氧化酶中，(al)具有下述⑴~(3)中的任一个的氨基酸序列，且(a2)具有在氧和水的存在下作用于L-色氨酸而生成过氧化氢和氨的氧化酶活性，对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~3%，对除L-色氨酸和L-苯丙氨酸以外的组成蛋白质的氨基酸不具有氧化酶活性；(1)序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列；(2)在序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列中具有1~50个氨基酸的缺失、取代和/或添加的氨基酸序列；或(3)与序列表的SEQID NO:1或2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的酶传感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶的(al)中的对L-苯丙氨酸的氧化酶活性是对L-色氨酸的氧化酶活性的0~1%。
17.根据权利要求15或16所述的酶传感器，其中，所述L-色氨酸氧化酶与所述酶的稳定剂一起使用。
18.根据权利要求17所述的酶传感器，其中，所述稳定剂是选自甘油、蔗糖、山梨糖醇和海藻糖中的至少1种。
19.根据权利要求15~18中任一项所述的酶传感器，其中，过氧化氢检测用电极是酶式过氧化氢电极或隔膜式过氧化氢电极。
【文档编号】C12N9/06GK103635589SQ201280011699
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月4日
【发明者】浅野泰久, 龟谷将史, 尾仲宏康 申请人:富山县, 味之素株式会社