悬滴板的制作方法

悬滴板的制作方法
【专利摘要】包含预定数量的小滴区室（10）的悬滴板（1），每一小滴区室（10）都能接收一滴液体。各个小滴区室（10）都包含围绕各个空腔（100）排列的环状微流润湿屏障（102），其防止小滴延伸到微流润湿屏障（102）外。此外，各个区室（10）包含封闭的底部（101）和至少一个额外的环状微流润湿屏障（104），每一额外的环状微流润湿屏障（104）都围绕前面的环状微流润湿屏障（102）排列。在两个邻近排列的微流润湿屏障之间排列了可润湿区域（103）。
【专利说明】悬滴板
[0001]本发明涉及根据独立权利要求的悬滴板。
[0002]普遍认同的是在许多应用和测定中，例如在药物研发中或者在毒性测定中，在三维构型中培养的细胞比在经典的二维(单层)培养中的细胞在生理学上更相关。建议将悬滴板用于形成此类三维细胞团聚体。将具有悬浮细胞的细胞培养基的液滴放置在此种平板的培养区室或者孔中，然后倒转该平板。由于不存在细胞粘附可以使用的基质，所以细胞在悬滴的顶点积累，并形成三维细胞团聚体。在使用胚胎干细胞的情况下，这些干细胞下沉到小滴的顶点，在此处它们会合形成三维细胞团聚体，称为拟胚体(embryoid body)。
[0003]WO 2010/031194中显示了不必倒转平板的悬滴板。在该参考文献中显示的平板包含平板主体、第一和第二共面表面，以及穿过整个主体(垂直地从第一(上)表面到第二(较低的)表面)的多个导管。导管包含与第一(上)表面邻近的漏斗形入口区室、与第二(较低的)表面邻近的倒转的漏斗形培养区室，以及在入口区室和培养区室之间排列的毛细管部分。提供了这样的浮雕结构，其具有各个边缘从主体的第二(较低的)表面伸出并围绕每一培养区室的形式。这些边缘防止液滴延伸到边缘外。
[0004]通过入口区室和毛细管部分将含有细胞的液体引入到培养区室中。例如，可以以这种方式将含有干细胞的液体培养基引入到培养区室中，然后将具有悬滴的平板培养预定的时间间隔，以使细胞团聚体形成三维拟胚体。在一段时间后必须供应新鲜液体培养基的情况下，这通过以下进行:经由入口区室和毛细管部分(例如借助于移液管)吸出“旧”液体培养基，然后以上述方式供应“新鲜”液体培养基。
[0005]尽管WO 2010/031194所述的平板通常适合于培养细胞以形成 三维细胞团聚体，所述平板仍有改进的空间。例如，为了经由入口区室和毛细管部分吸出旧的液体培养基，需要吸出装置(例如，移液管)，且必须将所述吸出装置紧密地贴合到入口区室壁上，以实现完全吸出。同样这也适用于随后供应新鲜液体培养基。然而，更重要地，各个培养区室中悬滴的稳定性是唯一受限制的。另一缺点是液体可以以不受控制的速率经打开的入口区室蒸发。
[0006]因此，本发明的目的是提出悬滴板，其克服了与悬滴的稳定性和液体的蒸发相关的前述问题。此外，应当容易地进行液体培养基的额外的供应和替换。
[0007]为了实现前述目的，本发明提出了悬滴板，通过涉及此种悬滴板的独立权利要求的特征详细说明了所述悬滴板。根据本发明的悬滴板的其他实施方案是从属权利要求的主题。
[0008]特别地，本发明提出了包含预定数量的小滴区室的悬滴板，每一小滴区室均能接收一滴液体。各个小滴区室均包含围绕各个空腔排列的环状微流润湿屏障，其防止小滴延伸到微流润湿屏障外。此外，各个区室包含封闭的底部和至少一个额外的环状微流润湿屏障，每一额外的环状微流润湿屏障均围绕前面的环状微流润湿屏障排列，在两个邻近排列的微流润湿屏障之间排列了可润湿区域。
[0009]特别地，当与WO 2010/031194所示的悬滴板相比时，培养区室的封闭底部构型，以及环状润湿屏障起着提高从各个培养区室中落下的悬滴的稳定性的作用，并且与WO2010/031194的悬滴板(其中在入口区室存在空气的入口)相比，认为这归因于本发明的悬滴板不存在空气的入口。此外，由于不存在空气入口，所以极大地减少了液体的蒸发。
[0010]此外，尽管必须再次倒转悬滴板，以给已经包含在培养区室中的小滴供应另外的液体培养基的小滴，从而形成较大的小滴，然而这可以以容易且方便的方式进行。这首先归因于良好的小滴稳定性，其次归因于额外的环状微流润湿屏障，以及额外的环状微流润湿屏障和前面环状微流润湿屏障之间的可润湿区域，所述可润湿区域允许容易地供应另外的液体培养基的小滴。通过所述额外的微流屏障防止了如此形成的较大小滴的铺展，以使平板再次倒转后，较大小滴维持了悬滴构型的良好稳定性。通常，并不限制额外的微流润湿屏障的数量，然而，在实践性实施方案中，可以存在仅一个或者两个额外的微流润湿屏障。
[0011]在根据本发明悬滴板的一个实施方案中，各个小滴区室是孔,而在另一个实施方案中，小滴区室可以由平面(分别由微流润湿屏障围绕)形成。
[0012]在根据本发明悬滴板的进一步的实施方案中，环状微流润湿屏障包含环状边缘，并且至少一个额外的环状微流润湿屏障包含至少一个额外的环状边缘。每一额外的环状边缘围绕前面的环状边缘排列，可润湿区域排列在两个邻近排列的环状边缘之间。在该实施方案的其他变型中，两个邻近的环状边缘以阶梯方式(stepped manner)排列。
[0013]在进一步的实施方案中，根据本发明的悬滴板由其中具有预定数量的洞的单独制造的平板和相应的预定数量的单独制造的孔(形成小滴区室)构成，其中将每一单独制造的孔压入到单独制造的平板的各个洞中。这允许容易地制造平板和孔，所述平板和孔可以由聚苯乙烯或者任何其他合适的物质制成。可以通过将孔压入到空洞中来容易地组合单独制造的平板和孔。尽管将孔超声波焊接到平板的内表面是一般的选择(在这种情况下，平板可以不包含洞)，但将孔压入到洞中是优选的，因为超声波焊接使得孔中含有的内含物的显微镜分析更加困难。
[0014]在根据本发明悬滴板的进一步的实施方案中，从形成平板外表面的平板侧面将单独制造的孔压入到洞中 。这允许容易地进行平板和孔的装配，其可以自动化地进行。在优选的实施方案中，根据本发明的悬滴板可以包含24个孔、96个孔或者384个孔。
[0015]在根据本发明的悬滴板的另一个实施方案中，环状微流润湿屏障包含环状边缘，并且至少一个额外的微流润湿屏障包含额外的环状边缘，每一额外的环状边缘围绕前面的环状边缘，并且可润湿区域排列在两个邻近排列的环状边缘之间。在该实施方案的一个变型中，邻近的环状边缘以阶梯方式排列，而在该实施方案的另一个变型中，环状边缘排列在一个平面上。
[0016]本发明的另一方面涉及组装的悬滴板，其包含根据本发明的如上所述的悬滴板和接收板。悬滴板具有预定数量的小滴区室或孔，以及接收板，所述接收板具有的孔的数量和悬滴板的小滴区室或孔的预定数量相对应。以这样的方式装配悬滴板和接收板:在这种装配状态下，接收板的孔与悬滴板的小滴区室或孔以对齐的方式排列。这种装配允许通过离心该装置将三维细胞团聚体从悬滴板容易地转移到接收板的孔中。
[0017]本发明的另一方面涉及测试物质对细胞的毒性的方法。该方法包括步骤:
[0018]a)将预定数量的液滴引入到相应数量的悬滴板的培养区室中，每一小滴含有预定体积的待测试物质和预定体积的液体培养基，以及多个细胞；
[0019]b)在悬滴板携带小滴的情况下，将悬滴板倒转并以这样的方式培养预定的时间间隔，所述方式使得小滴可以从各个培养区室中垂下，以允许细胞在各个小滴中形成三维细胞团聚体，
[0020]c)在培养区室中将额外的液体培养基供应给培养区室中的小滴，以促进三维细胞团聚体额外地生长；和
[0021]d)分析三维细胞团聚体，以评估待测试的物质是否对三维细胞团聚体有毒。
[0022]在根据本发明的方法中，如上所述使用根据本发明的悬滴板，并且步骤c)通过以下进行:再次倒转悬滴板，将一滴额外的液体培养基加入到含有三维细胞团聚体的各个小滴中，以在各个培养区室中形成各个较大的小滴。然后，再次倒转悬滴板，以允许三维细胞团聚体在从所述小滴区室中垂下的各个较大的小滴中生长。
[0023]当讨论根据本发明的悬滴板的优点时，上文已经提及了这些优点。此外，所述悬滴板允许至少一些处理步骤的自动化，例如，供应额外的液体培养基的自动化。
[0024]根据本发明的方法的一个实施方案进一步地包括以下步骤:
[0025]e)将生长的三维细胞团聚体从悬滴板的培养区室转移到相应数量的接收板的孔中；
[0026]f)将接收板培养另外的预定时间间隔，所述接收板具有含三维细胞团聚体的孔；和
[0027]g)培养后，分析三维细胞团聚体，以评估待测试物质是否对三维细胞团聚体有毒。在根据本发明的方法的该实施方案的优选变型中，步骤e)通过以下进行:以接收板的各个孔与悬滴板的各个培养区室相对排列的方式来装配悬滴板和接收板，随后进行装配平板的离心。这允许将三维细胞团聚体从悬滴板方便地且自动地转移到接收板的各个孔中。
[0028]在根据本发明的方法的另外的实施方案中，细胞是胚胎干细胞，并且三维细胞团聚体是拟胚体。通过分析拟胚体是否含有心肌细胞来进行分析三维细胞团聚体以评估待测试物质是否对三维细胞团聚体有毒的步骤。该实施方案是方便的，因为心肌细胞是跳动的，所以可以容易地检测心肌细胞在三维细胞团聚体中的存在。
[0029]借助于附图，从实施方案的以下详细描述中可看出本发明的其他有利方面是显而易见的，其中:
[0030]图1显示根据本发明的悬滴板的第一个实施方案的透视图，其中一个孔含有小滴，并且其中另一个孔含有已经加入了额外的小滴的小滴；
[0031]图2显示图1的悬滴板的实施方案的俯视图；
[0032]图3显示在悬滴板再次倒转的情况下，沿图2中的线II1-1II的剖视图；
[0033]图4显示在悬滴板倒转的情况下，沿图2中的线II1-1II的剖视图；
[0034]图5显示图4的细节V的放大图；
[0035]图6显示图1的悬滴板的实施方案的一个孔的放大图；
[0036]图7显示根据本发明的悬滴板的第二个实施方案的孔的剖视图，该孔含有小滴；
[0037]图8显示在已经加入了额外的小滴的情况下，悬滴板的第二个实施方案的孔；
[0038]图9显示在已经加入另一个额外小滴的情况下，悬滴板的第二个实施方案的孔；
[0039]图10显示根据本发明的悬滴板的第三个实施方案的剖视图，该小滴区室含有小滴；
[0040]图11显示在已经加入了额外的小滴的情况下，根据本发明的悬滴板的第三个实施方案；
[0041]图12显示在已经加入了另一额外的小滴的情况下，根据本发明的悬滴板的第三个实施方案；
[0042]图13显示在又加入了另一额外的小滴的情况下，根据本发明的悬滴板的第三个实施方案；
[0043]图14显示在又加入了另一额外的小滴的情况下，根据本发明的悬滴板的第四个实施方案；
[0044]图15显示胚胎干细胞测定的实施方案，其中使用根据本发明的悬滴板；
[0045]图16以透视图显示根据本发明的24孔悬滴板的实施方案的单独制造的孔；
[0046]图17以剖视图显示图16的孔；
[0047]图18显示根据本发明的24孔悬滴板的实施方案的单独制造的平板的俯视图，可以将图16的单独制造的孔插入到所述平板的洞中；
[0048]图19显示图18的平板的仰视图；
[0049]图20显示图18和图19的平板的细节的放大图，所述平板包括待插入孔中的一个洞；
[0050]图21显示24孔悬滴板的俯视图，其中将图16的孔插入到图18的平板的洞中；
[0051]图22显示图21的24孔悬滴板的剖视图；
.[0052]图23显示图21的24孔悬滴板的仰视图；
[0053]图24显示图22的剖视图的细节，所述剖视图包括插入到一个洞中的一个孔；
[0054]图25显示其他的24孔板的实施方案的透视图，可以将图21的24孔悬滴板安装(与图15所示的装配相似)到所述24孔板上；
[0055]图26显示图25的其他24孔板的实施方案的剖视图；
[0056]图27显示图21的24孔悬滴板的透视图，将所述悬滴板安装到图25中所示的其他的24孔板上；
[0057]图28显示图27中所示的平板装配的剖视图；
[0058]图29以放大的透视图显示根据本发明的96孔悬滴板的实施方案的单独制造的孑L ；
[0059]图30以剖视图显示图29的孔；
[0060]图31显示图29的孔的细节，所述孔包括形成微流润湿屏障的阶梯状环状边缘；
[0061]图32显示根据本发明的96孔悬滴板的实施方案的单独制造的平板的俯视图，可以将图29的单独制造的孔插入到所述平板的洞中；
[0062]图33显示图32的平板的剖视图，所述平板包括图29的孔可以插入的洞；
[0063]图34显示图32的平板的仰视图；
[0064]图35显示96孔悬滴板的俯视图，其中将图29的孔插入到图32的平板的洞中；
[0065]图36显示图35的96孔悬滴板的剖视图；
[0066]图37显示图35的96孔悬滴板的仰视图；
[0067]图38显示图36的剖视图的细节，所述剖视图包括插入到一个洞的一个孔；
[0068]图39显示其他96孔平板的实施方案的俯视图，可以将图35的96孔悬滴板安装(与图15所示的装配相似)到所述96孔板上；[0069]图40显示图39的另外的96孔平板的实施方案的剖视图；和
[0070]图41显示图35的96孔悬滴板的透视图，其中将所述悬滴板安装到图39中所示的其他的96孔板上；；
[0071]图1至图6以多种视图(见上文)显示了根据本发明的悬滴板I的第一个实施方案或其细节。平板I以孔10的形式包含预定数量的小滴区室。所示的实施方案为24孔板，然而，任何其他数量的孔也是可能的。优选地是根据标准微孔板排列的具有标准化数量的孔的平板，例如96孔板或384孔板。
[0072]通常，尽管孔的不同实施方案是可能的，但悬滴板I的实施方案的孔10具体地如在图6中的放大图中所示。孔10以尖锐的环状边缘102围绕具有封闭底部101的第一空腔的形式包含第一环状润湿屏障。第二尖锐的环状边缘104围绕第一环状边缘102，其中可润湿区域103排列在第一环状边缘102和第二环状边缘之间。如在图6中可见，环状边缘以阶梯状方式排列，尽管这并不是强制的。以围绕第二环状边缘104的方式提供环状断流器 105。
[0073]当观察图3、图4和图5时，孔10的几何学构型的原因变得更加明确，所述图3、图4和图5显示了将小滴供应给孔10并使得它们从孔10垂下的方法。在图3中，悬滴板I以再次倒转的位置显示，即孔10朝上。在最外层左边位置排列的孔10中，可以识别出小液滴20。在左边第二个孔10中，可以识别出较大的小滴21，其通过给小滴20供应另一个液滴获得，从而形成较大的小滴21。可以看出，可以例如借助移液管将小滴供应给孔10。特别地，可以借助移液机器人，但也可以手动地将小滴放置于孔10中。此外，在从孔中吸出一些液体的情况下(例如，在预期用“新鲜”液体培养基替换“旧”液体培养基的情况下)，因为小滴是容易接近的，所以可以容易地进行该操作。
[0074]图4显示了悬滴板1，在所述悬滴板I的位置上较小的小滴20和较大小滴21从各个孔10中垂下，并且这可以在图5中最佳观察，图5显示了图4的细节V。较小小滴20从最外层的左孔10中垂下，而较大小滴21从左边第二孔10中垂下。
[0075]在图5和图6中，更加明确了第一和第二环状边缘102和104作为微流屏障防止小滴20和较大小滴21延伸到边缘外的功能。因此，第一和第二环状边缘102和104有助于从各个孔10中垂下的小滴的稳定。对于第二环状边缘104，该作用通过环状断流器105增强。在第一和第二环状边缘102和104之间排列的可润湿区域103 (见图6)允许容易地给小滴20添加额外的液滴，以形成较大的小滴21 (见图4和图5)。孔10的封闭底部防止液体经由洞或通道穿过底部蒸发，并且由于防止了空气“从后面”推动小滴，所以还用于稳定从孔中垂下的小滴。
[0076]根据本发明的悬滴板的第二个实施方案分别显示于图7至图9中，其中仅显示了悬滴板3的单个孔30。该实施方案也包含防止小滴延伸到各个微流屏障外的微流屏障的阶梯状构型，所以一定程度上与上文详述的第一个实施方案相关外。然而，第二个实施方案与第一个实施方案的不同之处在于，孔30不包含尖锐的边缘而包含具有封闭底部300的空腔301，围绕空腔301并朝孔30的开口端伸出到空腔外的第一环状边缘302围绕所述封闭底部300。图7显示了从孔30中垂下的小液滴40。通过形成微流屏障的第一环状边缘302将小滴40保留在空腔301中。
[0077]图8不同于图7，因为已经将另一液滴加入到液滴40中，以形成较大的小滴41。通过围绕第一环状边缘302的第二环状边缘304，以及在第一环状边缘302和第二环状边缘304之间排列的可润湿区域303保留较大的小滴41。此外，第二环状边缘304起着防止较大小滴41延伸到边缘304外的微流屏障的作用。
[0078]图9不同于图8，因为又将另一液滴加入到较大的小滴41中，以形成更大的小滴42。通过围绕第二环状边缘304的第三环状边缘306，以及在第二环状边缘304和第三环状边缘306之间排列的可润湿区域305保留小滴42。此外，第三环状边缘306起着防止更大的小滴42延伸到边缘306外的微流屏障的作用。
[0079]图10-图14显示了根据本发明的悬滴板5的第三个实施方案的单个小滴区室50。悬滴板5的实施方案与上文详述的第一个和第二个实施方案的不同之处在于:区室50并不包含阶梯状构型的微流屏障，而包含环状边缘形式的微流屏障，所述环状边缘排列在低于平板5的表面的平面上的。区室50也包含封闭底部500，同时空腔501与围绕空腔501的第一环状边缘502结合，并从平板5的较低表面伸出。图10显示了从区室50中垂下的小液滴64。通过形成微流屏障的第一环状边缘502将小滴64保留在空腔501中。
[0080]图11不同于图10，因为将又一液滴加入到液滴64中，以形成较大的小滴65 (此夕卜，作为第一个步骤，可以将较大的小滴41引入到小滴区室50中)。通过围绕第一环状边缘302的第二环状边缘504，以及在第一环状边缘502和第二环状边缘504之间排列的可润湿区域503保留较大的小滴65。此外，第二环状边缘504起着防止较大小滴65延伸到边缘504外的微流屏障的作用。
[0081]图12显示了更大的小滴66，通过围绕第二环状边缘504的第三环状边缘506，以及在第二环状边缘604和第三环状边缘506之间排列的另外的可润湿区域505保留小滴66。第三环状边缘506也起着防止小滴66延伸到边缘506外的微流屏障的作用。
[0082]图13显示了更大的小滴67，通过围绕第三环状边缘506的第四环状边缘508，以及在第三环状边缘506和第四环状边缘508之间排列的又一可润湿区域507保留小滴67。第四环状边缘508起着防止更大的小滴67延伸到边缘508外的微流屏障的作用。
[0083]最后，图14显示了更大的小滴68，通过围绕第四环状边缘508的第五环状边缘510，以及在第四环状边缘508和第五环状边缘510之间排列的另一可润湿区域509保留小滴68。第五环状边缘510以如上所述的相同方式，起着防止更大的小滴68延伸到边缘510外的微流屏障的作用。
[0084]在图15中，显示了代表根据本发明的方法的实施方案的胚胎干细胞测定的实施方案，其中可以使用根据本发明的悬滴板的任一上述实施方案。对于测定法的以下描述，假定使用根据本发明的悬滴板I的第一个实施方案。在测定法的这个实施方案中，测试了物质对拟胚体的毒性。为此，将预定数量的液滴引入到相应数量的小滴区室或孔中。每一小滴含有预定体积的待测试物质和液体培养基，以及多个干细胞82。在悬滴板I的第一个实施方案的情况下，当平板I处于再次倒转的位置(见图4)，可以将24滴小滴20引入到相应的孔10中。在已经将小滴20引入到孔10中后，倒转平板1，并将其与具有相应数量的孔70的另一个平板7 (孔70与悬滴板I的孔10相对排列)装配，以形成封闭的装置。孔70也可以含有培养基。如在上文所详细说明的，如此形成的装置可以使小滴20从孔10中垂下。将如此形成的装置(见图15，左上)培养预定的时间间隔，例如3天。在培养期间，在各个小滴中含有的干细胞82在各个小滴20中，在小滴的顶部，即在小滴20的最低点沉降并形成三维拟胚体83 (更通常地，三维细胞团聚体)(见图15，右上)。
[0085]第一个培养期后，需要给小滴20供应额外的液体培养基，以促进拟胚体83的额外生长。为此，重新打开该装置，并再次倒转平板I。在这种再次倒转的位置下，将额外的液体培养基供应给各个孔10中的各个小滴20，以形成更大的小滴21。一旦已经供应了额外的液体培养基(用于形成更大的小滴21)，就再次将平板I倒转，并将平板I与其他平板7 (平板7的孔70也可以含有新鲜的液体培养基)重新装配。将如此形成的装置培养另外的预定时间间隔，例如2天，以允许拟胚体的进一步生长。
[0086]在另一个培养期后，可以通过离心，将拟胚体83转移到平板7 (接收板)的孔70中，这可以用本领域熟知的离心装置进行。在将拟胚体83离心到含有液体培养基的平板7的孔70中后，可以将装置培养另一预定的时间间隔，例如5-7天。拟胚体83沉降到平板7的各个孔70的平板底部。
[0087]这这个培养期之后，可以重新打开所述装置，并检查细胞团聚体，测定待测试物质是否对细胞有毒。当考虑多种类型的分析时，一种类型的分析是借助于显微镜分析细胞团聚体。因为细胞团聚体静止在平板7的孔的底部上，所以显微镜分析是可能的。例如，可以检查细胞团聚体，以确定它们是否含有心肌细胞，这是因为心肌细胞收缩和扩张(它们跳动)，所以在显微镜下，可以容易地鉴定这种类型的细胞。
[0088]任选地是通过离心进行拟胚体或三维细胞团聚体至另外的平板7的孔70的前述转移。备选地，可以重新打开所述装置，并可以以基于离心，使拟胚体或细胞三维细胞团聚体从小滴的顶部朝孔10的底部101移动的方式，将平板I安装到离心机上(见图6)。随后，由于拟胚体排列在孔10的底部101上，所以可以借助于显微镜分析平板的孔10中的拟胚体，所述孔10的底部101形成了用于显微镜分析的稳定背景。
[0089]图16-图24显示了根据本发明的悬滴板6的另一个实施方案(图21-图23)。该实施方案包括单独制造的孔60 (见图16和图17)，可以将其压入到单独制造的平板61的洞610中(见图18-图20)。从图 17所示的单独制造的孔60的剖视图中可以看出，孔60包含第一环状边缘602、第二环状边缘604和第三环状边缘606。借助于图7、图8和图9已经详细描述了孔和第一、第二以及第三环状边缘的结构和功能，因此参考上述的这些部分。在所示的实施方案中，从形成平板61的外表面611的平板61侧，将孔60压入到平板61的洞610中。一旦将全部孔60均压入到洞610中，孔60与平板61固定连接，并完成了悬滴板6的形成(图21-图24)。
[0090]备选地，可能的是单独制造的孔60与平板61的内表面612连接(例如通过超声波焊接或者通过粘合)。在这种情况下，平板61可以不包含洞。然而，将孔60超声波焊接和粘合到平板61的内表面612的位置可能是可见的，并可能使得孔内含物的显微镜分析更加困难。因此，优选的是将孔60压入到平板61的洞610中。
[0091]图25和图26显示了另一个平板8的实施方案，其包含的孔80的数量相应于悬滴板6的孔60的数量。此外，另一个平板8的孔80以相应于悬滴板6的孔60的排列方式排列。
[0092]在图27和图28中可以看出，可以以堆叠的方式将悬滴板6安装在另一个平板8上，以使悬滴板6的每一孔60均排列在另一个平板8的相应孔80之上。对于图15，已经详述了此种装配的一个目的，因此参考上述的这些部分。[0093]借助于图16-图28，仅描述了 24孔板或者24孔板的装置，然而，可以将相似的考虑应用于96孔板，这在下文中是明确的。
[0094]图29-图38显不了表现为96孔悬滴板的根据本发明的悬滴板9的又一实施方案(图35-图37)。与24孔实施方案相似，96孔实施方案包括单独制造的孔90 (见图29和图31)，可以将其压入到单独制造的平板61的洞910中(见图32-图34)。从图30和图31所示的单独制造的孔90的剖视图中可以看出，孔90包含第一环状边缘902、第二环状边缘904和第三环状边缘906。借助于图7、图8和图9已经详细描述了孔和第一、第二以及第三环状边缘的结构和功能，因此参考上述的这些部分。在所示的实施方案中，从形成平板91的外表面911的平板91侧，将孔90压入到平板91的洞910中。一旦将全部孔90均压入到洞910中，孔90将与平板91固定连接，并完成悬滴板9的形成(图35-图38)。
[0095]图39-图41显示了另一个平板92的实施方案，所述平板92包括的孔920的数量相应于悬滴板9的孔90的数量。此外，另一个平板92的孔920以相应于悬滴板9的孔90的排列方式排列。
[0096]在图41中可以看出，可以以堆叠的方式将悬滴板9安装在另一个平板92上，以使悬滴板9的每一孔90均排列在另一个平板92的相应孔920之上。
[0097]不言而喻 ，前述实施方案仅是根据本发明的方法、悬滴板和悬滴板的多种应用的一个实例，因此它们并不意在限制本发明。相反，预期通过所附权利要求来限定所保护的范围。
【权利要求】
1.悬滴板(I；3 ；5 ；6 ;9)，其包含预定数量的小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ;90)，每一小滴区室均能接收液体的小滴(20、21 ;40、41、42 ;60、61、52、63、64)，所述各个小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)包含围绕各个空腔(100 ；500)排列并防止小滴延伸到微流润湿屏障外的环状微流润湿屏障(102 ；302 ；502 ；702 ;902)， 其中所述各个小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ;90)包含封闭底部(101 ;501)和至少一个额外的环状微流润湿屏障(104 ;304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)，所述每一额外的环状微流润湿屏障(104 ;304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)均围绕前面的环状微流润湿屏障(102 ;302、304 ;502、504、506、508 ;604、606 ;904、906)排列，在两个邻近排列的微流润湿屏障之间排列着可润湿区域(103 ;303、305 ;503、505、507、509)。
2.根据权利要求1的悬滴板，其中所述各个小滴区室是孔(10；30 ；60 ;90)。
3.根据权利要求1或2中任一项的悬滴板，其中所述环状微流润湿屏障包含环状边缘(102)，并且其中所述至少一个额外的环状微流润湿屏障包含至少一个额外的环状边缘(104)，所述每一额外的环状边缘(104)均围绕前面的环状边缘(102)排列，在两个邻近排列的环状边缘(102、104)之间排列着所述可润湿区域(103)。
4.根据权利 要求3的悬滴板，其中所述两个邻近的环状边缘(102、104)以阶梯方式排列。
5.根据权利要求1或权利要求2的悬滴板，其中所述环状微流润湿屏障包含环状边缘(302 ；502 ；602 ;902)，并且其中所述至少一个额外的微流润湿屏障包含额外的环状边缘，所述每一额外的环状边缘(304、306 ;504、506、508、510 ;604、606 ;904、906)均围绕前面的环状边缘(302、304 ;502、504、506、508 ;602、604 ;902、904)，在所述两个邻近排列的环状边缘之间排列着可润湿区域(303、305 ;503、505、507、509)。
6.根据权利要求5的悬滴板，其中所述邻近排列的环状边缘(302、304、306;602、604、606 ;902、904、906)以阶梯方式排列。
7.根据权利要求2-6中任一项的悬滴板(6;9)，其中所述悬滴板由其中具有预定数量的洞(610 ;910)的单独制造的平板(61 ;91)和相应的预定数量的单独制造的孔(60 ;90)构成，所述孔形成小滴区室，将所述每一单独制造的孔(60 ；90)压入到所述单独制造的平板(61 ；91)的各个洞(610 ；910)中。
8.根据权利要求7的悬滴板(6;9),其中从形成所述平板(6 ;9)的外表面(611、911)的平板(6 ;9)侧面，将所述单独制造的孔(60 ;90)压入到所述洞(610 ；910)中。
9.根据权利要求7或权利要求8的悬滴板，其包含24孔悬滴板、96孔悬滴板或384孔悬滴板。
10.根据权利要求5的悬滴板，其中所述环状边缘(503、504、506、508、510)排列在一个平面上。
11.悬滴板装置，其包含根据权利要求1-10中任一项的悬滴板(I；3 ；5 ；6 ;9),所述悬滴板具有预定数量的小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔，以及接收板(7)，所述接收板(7)具有的孔(70)的数量相应于所述悬滴板的小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔的预定数量，所述悬滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)和所述接收板(7)以这样的方式装配:在这种装配状态下，所述接收板的孔(70)与所述悬滴板的小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)或孔以对齐的方式排列。
12.测试物质对细胞的毒性的方法，其包括步骤:a)将预定数量的液滴(20;40;64)引入到相应数量的悬滴板(1;3;5;6;9)的小滴区室(10; 30; 50; 60; 90)中，每一小滴含有预定体积的待测试物质和预定体积的液体培养基，以及多个细胞(82)； b)在所述悬滴板携带所述小滴(20;40; 64)的情况下，将所述悬滴板(I; 3; 5; 6; 9)倒转并以这样的方式培养预定的时间间隔，所述方式使得所述小滴(20;40;64)从各个小滴区室(10 ；30 ；50 ；60 ；90)垂下，以允许所述细胞(82)在所述各个小滴(20;40;64)中形成三维细胞团聚体(83)， c)在所述各个小滴区室(10;30; 50; 60; 90)中将额外的液体培养基供应给所述小滴(20; 40; 64)，以促进所述三维细胞团聚体(83)额外地生长；和 d)分析所述三维细胞团聚体(83)，以评估待测试的物质是否对所述三维细胞团聚体(83)有毒。 其中，使用根据前述权利要求任一项的悬滴板(1;3;5;6;9)，并且其中步骤c)通过以下进行:再次倒转所述悬滴板(1;3;5;6;9)，将所述一滴额外的液体培养基加入到含有所述三维细胞团聚体的所述各个小滴中，以在所述各个小滴区室(10;30;50;60;90)中形成各个较大的小滴(21; 41，42; 65，66，67，68)，然后，再次倒转所述悬滴板(I; 3; 5; 6; 9)，以允许所述三维细胞团聚体(83)在从所述小滴区室(10; 30; 50; 60; 90)中垂下的所述各个较大的小滴(21; 41，42; 65，66，67，68)中生长。
13.根据权利要求12的方法，其进一步包括步骤: e)将所述生长的三维细胞团聚体(83)从所述悬滴板(1;3;5;6;9)的小滴区室(10; 30; 50; 60; 90)转移到相应数量的接收板(7)的孔(70)中； f)将接收板(7)培养另外的预定时间间隔，所述接收板(7)具有含三维细胞团聚体`(83)的孔(70);和 g)培养后，分析所述三维细胞团聚体，以评估待测试物质是否对三维细胞团聚体有毒。
14.根据权利要求13的方法，其中所述步骤e)通过以下进行:以所述接收板(7)的各个孔(70)与所述悬滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)的各个小滴区室(10; 30; 50; 60; 90)相对排列的方式装配所述悬滴板(I ；3 ；5 ；6 ;9)和所述接收板(7)，随后离心所装配的平板。
15.根据权利要求13或14中任一项的方法，其中所述细胞(82)是胚胎干细胞，并且所述三维细胞团聚体(82)是拟胚体，并且其中通过分析所述拟胚体是否含有心肌细胞，来进行分析所述三维细胞团聚体(83)以评估所述待测试物质是否对所述三维细胞团聚体有毒的步骤。
【文档编号】C12M3/00GK103429729SQ201280011537
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月3日
【发明者】C·法廷格, P·亚萨, T·基斯林, D·沃格林, T·楚姆斯泰因, C·麦金尼斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司