开发萜烯合酶变体的方法

开发萜烯合酶变体的方法
【专利摘要】本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法，所述萜烯合酶变体可用于萜烯产物的商业生产。在本公开内容中另外包括优良的萜烯合酶变体和包含这样的萜烯合酶变体的宿主细胞。
【专利说明】开发萜烯合酶变体的方法
【1.【技术领域】】
[0001]本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法，所述萜烯合酶变体可用于萜烯产物的商业生产。在本公开内容中另外包括优良的萜烯合酶变体和包含这样的萜烯合酶变体的宿主细胞。
【2.【背景技术】】
[0002]萜类是在许多生物中产生的一大类烃。它们通过连接异戊二烯(C5H8)单元而衍生出，并且根据存在的异戊二烯单元的数目来分类。半萜由单个异戊二烯单元组成。异戊二烯自身被视作唯一的半萜。单萜由2个异戊二烯单元构成，且具有分子式CltlH1615单萜的例子是香叶醇、柠檬烯和松油醇。倍半萜由3个异戊二烯单元组成，且具有分子式C15H2415倍半萜的例子是金合欢烯、法尼醇和广藿香醇。二萜由4个异戊二烯单元构成，且具有分子式C2(iH32。二萜的例子是咖啡醇、咖啡白脂、西柏烯和紫杉二烯。二倍半萜由5个异戊二烯单元构成，且具有分子SC25H4tl。二倍半萜的一个例子是香叶基法尼醇。三萜由6个异戊二烯单元组成，且具有分子式C3tlH4815四萜含有8个异戊二烯单元，且具有分子式C4(iH64。生物学上重要的四萜包括无环的番茄红素、单环的Y-胡萝卜素和二环的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。多萜由许多异戊二烯单元的长链组成。天然橡胶由其中双键为顺式的聚异戊二烯组成。
[0003]当萜类经过化学改性(例如，通过氧化或碳骨架的重排)时，得到的化合物通常被称作萜类化合物，其也被称作类异戊二烯。类异戊二烯起许多重要的生物学作用，例如，作为电子传递链中的醌，作为膜组分，通过蛋白质异戊二烯化在亚细胞靶向和调节中起作用，作为光合色素(包括类胡萝卜素、叶绿素)，作为激素和辅因子，和作为植物防御化合物(利用不同的单萜、倍半萜和二萜 )。它们在工业上可用作抗生素、激素、抗癌药物、杀虫剂和化学试剂。
[0004]通过异戊烯基焦磷酸(异戊烯基二磷酸或IPP)和它的异构体二甲基烯丙基焦磷酸(二甲基烯丙基二磷酸或DMAPP)的缩合，生物合成萜类。已知2个产生IPP和DMAPP的途径，即真核生物的甲羟戊酸依赖性的(MEV)途径和原核生物的独立于甲羟戊酸的途径或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径。植物利用MEV途径和DXP途径。IPP和DMAPP又通过异戊二烯基二磷酸合酶(例如，分别为GPP合酶、FPP合酶和GGPP合酶)的作用而缩合成聚异戊二烯基二磷酸(例如，香叶基二磷酸或GPP、法呢基二磷酸或FPP、和香叶基香叶基二磷酸或GGPP)。
[0005]聚异戊二烯基二磷酸中间体被萜烯合酶转化成更复杂的类异戊二烯结构。萜烯合酶属于形成多种产物的大基因家族。萜烯合酶的例子包括倍半萜合酶，其将FPP转化成倍半萜。倍半萜合酶的一个例子是金合欢烯合酶，其将FPP转化成金合欢烯。已经广泛地研究并充分地理解了萜烯合酶的反应机理。总体上，需要3个步骤才能将二磷酸底物诸如FPP转化成它的类异戊二烯产物:a)形成酶-底物复合物(ES)，b)形成酶-结合的反应性的碳阳离子中间体，随后重排，并形成产物(EP)，和c)从酶-产物复合物释放出产物。对萜烯合酶催化的反应的体外动力学和前稳态动力学研究已经证实，所述反应的总限速步骤是产物的释放(Cane 等人.(1997)Biochemistry, 36(27):8332-9,和 Mathis 等人.(1997)Biochemistry 36(27):8340-8)。職烯合酶的周转率较低,通常在小于0.5s-1测得(Cane, D.C.(1990)Chem.Rev.90:1089-1103)。
[0006]萜烯合酶在通向类异戊二烯的途径通量的调节中是重要的，因为它们在代谢分支点起作用，并经常与其它代谢酶竞争异戊二烯基二磷酸库。例如，FPP是许多细胞分子(包括角鲨烯、多萜醇和辅因子血红素)的前体。在希望在其中生产倍半萜(诸如金合欢烯)的经工程改造的微生物中，萜烯合酶在这类萜的高产量生产中起关键作用。但是，因为它们是慢速酶，萜烯合酶经常是代谢途径的瓶颈。另外，它们可能具有其它缺点，诸如底物抑制，所述底物抑制会限制在经工程改造的微生物宿主中有效地生产萜类所需的动力学能力(Crock等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 94:12833-12838)。 [0007]因此，提高萜烯合酶的催化效率使得这些酶不再限制通向类异戊二烯的总代谢通量，具有潜在巨大的益处。以前已经描述了为改变的产物特异性而工程改造萜烯合酶的尝试以及合理方案(诸如基于结构引导或适应进化的那些)的应用(Greenhagen等人.(2006)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 103:9826-9831;O’ Maille 等人.(2008)Nat.Chem.Biol.4:617-623; Yoshikuni 等人.(2006) Nature 440:1078-1082; Yoshikuni 等人.(2008)Chem.Biol.15:607-618)。但是，这些研究没有在维持萜烯合酶的产物特异性的同时也提高萜烯合酶的动力学能力。另外，常规蛋白质工程策略(诸如定向进化)的应用已经回避了萜烯合酶，主要因为缺少可利用的且有效的高通量筛选方法(Yoshikuni等人.(2008)(出处同上))。因此，需要用于提高萜烯合酶的催化效率的可靠的高通量方法，以及具有这样的提高的催化效率的萜烯合酶变体。
【3.
【发明内容】
】
[0008]本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法。所述方法也允许连续提高这些酶的体内性能。
[0009]在一个方面，本发明提供了具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体的筛选方法，所述方法包括下述步骤:
[0010]a)将表达对照倍半萜合酶的宿主细胞工程改造成包含高水平的FPP，其中与不包含高水平的FPP的亲本细胞相比，所述高水平的FPP会降低宿主细胞的生存力；
[0011]b)在所述宿主细胞中表达试验倍半萜合酶而不是对照倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是对照倍半萜合酶的变体；和
[0012]c)通过与表达对照萜烯合酶的宿主细胞相比表达试验倍半萜合酶的宿主细胞的生存力增加，将试验倍半萜合酶鉴别为具有与对照倍半萜合酶相比提高的体内性能。
[0013]在某些实施方案中，将宿主细胞铺板在琼脂平板上，并通过菌落生长来鉴别包含具有提高的体内性能的试验萜烯合酶变体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括选择和/或分离具有提高的体内性能的试验倍半萜合酶。
[0014]在某些实施方案中，在宿主细胞集合中表达倍半萜合酶变体集合。在某些实施方案中，所述倍半萜合酶变体集合包含2-5、5-10、10-50、50-100、100-500、500-1，000、I, 000-10，000、10，000-100，000、100，000-1，000，000、和更多种倍半萜合酶变体。
[0015]在某些实施方案中，以迭代方式使用筛选方法，其中在一个迭代中鉴别出的试验倍半萜合酶用作下一个迭代的对照倍半萜合酶，且其中在一个迭代中的宿主细胞包含如此高水平的FPP:在有在前一个迭代中鉴别出的试验倍半萜合酶存在下，与不包含高水平的FPP的亲本细胞相比，所述宿主细胞具有降低的生存力。
[0016]在另一个方面，本文提供了包含2个细胞亚群的组合物，所述细胞亚群源自共同的包含高水平的FPP的宿主细胞群，其中:
[0017]a)第一亚群包含对照倍半萜合酶，其中与不包含高水平的FPP的亲本细胞的生存力相比，所述高水平的FPP会第一亚群的细胞的生存力；和
[0018]b)第二亚群包含试验倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是对照倍半萜合酶的变体。
[0019]在某些实施方案中，所述第二亚群的细胞的生存力大于第一亚群的细胞的生存力。
[0020]在另一个方面，本发明提供了用于鉴别具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的第二种筛选方法，所述方法包括下述步骤:
[0021]a)提供宿主细胞，其表达对照萜烯合酶且具有一定生长速率；
[0022]b)在所述宿主细胞中表达试验萜烯合酶而不是对照萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是对照萜烯合酶的变体；和
[0023]c)通过与表达对照萜烯合酶的宿主细胞的生长速率相比表达试验萜烯合酶的宿主细胞的生长速率的下降，将试验萜烯合酶鉴别为具有与对照萜烯合酶相比提高的体内性倉泛。
[0024]在另一个方面，本发明提供了鉴别萜烯合酶变体的体内性能和/或将其排序的竞争方法，所述方法包括下述步骤:
[0025]a)将宿主细胞群分成对照群和试验群；
[0026]b)在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶可以将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶可以将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；
[0027]c)在所述试验群中表达对比萜烯合酶和试验萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在试验群中和在对照群中以类似的水平表达；和
[0028]d)在试验群中和在对照群中测量第一萜烯与第二萜烯之比。
[0029]在单独的实施方案中，使用所述竞争方法来鉴别选自下述的萜烯合酶和/或对其排序:单萜合酶、二萜合酶、倍半萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶和多萜合酶。
[0030]在某些实施方案中，使用所述竞争方法来筛选突变体萜烯合酶文库，其基础是?与对照萜烯合酶相比，具有提高的体内性能的萜烯合酶变体能够将更多通量从聚异戊二烯基二磷酸底物转向它的職烯产物，从而产生更高的目标職烯/对比職烯之比(即，第一職烯/第二萜烯)。在这样的实施方案中，重要的是，在试验群中表达试验萜烯合酶的水平与在对照群中表达对照萜烯合酶的水平类似。[0031]在其它实施方案中，使用所述竞争方法来鉴别所需强度的启动子。在这样的实施方案中，对照萜烯合酶和试验萜烯合酶是相同的，并且对照群和试验群的差别在于对照萜烯合酶的表达水平。
[0032]在另一个方面，本文提供了包含2个细胞亚群的组合物，所述细胞亚群源自共同的宿主细胞群，其中:
[0033]a)第一亚群包含对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶会将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比倍半萜合酶会将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；和
[0034]b)第二亚群包含试验萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶会将聚异戍二烯基二磷酸转化成第一職烯，且其中所述试验職烯合酶是对照職烯合酶的变体。
[0035]在某些实施方案中，第二亚群的第一萜烯与第二萜烯之比大于第一亚群。
[0036]在另一个方面，本文提供了分离的金合欢烯合酶变体和分离的核酸，所述核酸包含编码这类金合欢烯合酶变体的核苷酸序列，所述β-金合欢烯合酶变体具有在在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含一个或多个在选自下述的位置处的氨基酸置换:SEQ ID N0:111 的位置2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0037]在另一个方面，本发明提供了一种遗传修饰的宿主细胞，其包含:
[0038](a)异源金合欢烯合酶，其中所述异源金合欢烯合酶是由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的变体；和
[0039](b) MEV途径或DXP途径酶；
[0040]其中与包含MEV途径或DXP途径酶和由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的亲本细胞相比，所述宿主细胞产生多了至少15%的β-金合欢烯。
[0041]在另一个方面，本文提供了一种生产金合欢烯的方法，所述方法包括下述步骤:
[0042](a)获得多个遗传修饰的宿主细胞，其包含:
[0043]i)第一异源核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的变体；和
[0044]ii)第二异源核苷酸序列，其编码MEV途径或DXP途径酶；
[0045](b)在适合生产金合欢烯的条件下，在包含碳源的培养基中，培养所述遗传修饰的宿主细胞；和
[0046](C)从所述培养基回收β -金合欢烯。
【4.【专利附图】

【附图说明】】
[0047]当结合附图阅读时会最佳地理解本公开内容，所述附图用于解释优选实施方案。但是，应当理解，本公开内容不限于在附图中公开的具体实施方案。
[0048]图1A-Z提供了在本发明宿主细胞的制备中使用的几种染色体整合构建体的图
-1'TfeP曰。
[0049]图2提供了用于基于FPP饥饿的选择的几个琼脂平板的图像，在所述琼脂平板上涂布了包含有活性的和无活性的倍半萜合酶的大肠杆菌宿主细胞。
[0050]图3提供了用于基于FPP毒性的生长选择的2个琼脂平板的图像，在所述琼脂平板上涂布了包含有活性的和无活性的倍半萜合酶的大肠杆菌宿主细胞。
[0051]图4提供了通过大肠杆菌宿主细胞的GC分析得到的金合欢烯滴度，所述大肠杆菌宿主细胞包含不同的金合欢烯合酶编码序列。[0052]图5提供了用于基于FPP毒性的生长选择的琼脂平板的图像，在所述琼脂平板上涂布了包含有活性的和无活性的倍半萜合酶的酿酒酵母宿主细胞。
[0053]图6提供了通过酿酒酵母宿主细胞的尼罗红荧光分析得到的金合欢烯滴度，所述酿酒酵母宿主细胞包含染色体整合的或染色体外维持的金合欢烯合酶编码序列。
[0054]图7提供了通过倍半萜合酶竞争排序的、通过酿酒酵母宿主细胞的GC分析得到的金合欢纟布滴度。
[0055]图8提供了通过酿酒酵母宿主细胞的GC分析得到的金合欢烯/曲古二烯(trichodiene)滴度比，所述酿酒酵母宿主细胞包含增加的拷贝数的金合欢烯合酶编码序列。
[0056]图9提供了通过倍半萜合酶文库的大肠杆菌宿主细胞的GC分析相对于尼罗红荧光分析得到的金合欢烯滴度对比。
[0057]图10提供了通过大肠杆菌宿主菌株的GC分析得到的金合欢烯滴度，所述大肠杆菌宿主菌株从通过尼罗红荧光筛选出的FS变体文库中鉴别出。
[0058]图11提供了通过酿酒酵母宿主菌株的尼罗红荧光(A)和GC分析(B)得到的金合欢烯滴度，所述酿酒酵母宿主菌株从通过基于FPP毒性的生长选择筛选出的FS变体文库中鉴别出。
[0059]图12提供了通过酿酒酵母宿主菌株的尼罗红荧光分析得到的金合欢烯滴度，所述酿酒酵母宿主菌株从通过基于FPP毒性的生长选择筛选出的FS变体文库中鉴别出。
[0060]图13提供了在本发明宿主细胞的制备中使用的不同表达质粒的图谱。
[0061]图14提供了通过酿酒酵母宿主菌株的GC分析得到的金合欢烯滴度，所述酿酒酵母宿主菌株包含FS变体编码序列的单个染色体整合的拷贝。
[0062]图15提供了用于生产IPP和DMAPP的MEV途径的示意图。
[0063]图16提供了用于生产IPP和DMAPP的DXP途径的示意图。
[0064]图17提供了通过酿酒酵母宿主细胞的GC分析得到的紫穗槐二烯(amorphadiene)/曲古二烯滴度比,所述酿酒酵母宿主细胞包含紫穗槐二烯合酶变体的编码序列。
[0065]图18提供了通过酿酒酵母宿主细胞的GC分析得到的柠檬烯/香叶烯(myrcene)滴度比，所述酿酒酵母宿主细胞包含柠檬烯合酶变体的编码序列。
【5.【具体实施方式】】
[0066][5.1 定义】
[0067]在本文中使用的下述术语应当具有下面指出的含义。
[0068]本文中使用的术语“萜烯合酶变体”表示，与选定的萜烯合酶相比具有不同的核苷酸或氨基酸序列的萜烯合酶。例如，与选定的萜烯合酶的野生型序列相比，萜烯合酶变体可以包含可能导致或不导致对应氨基酸序列变化的核苷酸添加、缺失和/或置换。在某些其中核苷酸变化不会导致氨基酸序列变化的实施方案中，所述核苷酸变化仍然可能实现提高的合酶活性，例如，通过密码子优化。在其它实施方案中，所述萜烯合酶变体包含氨基酸添加、缺失和/或置换。因此，本文中使用的术语“倍半萜合酶变体”表示，与选定的倍半萜合酶相比具有不同的核苷酸或氨基酸序列的倍半萜合酶。例如，与选定的倍半萜合酶相比，倍半萜合酶变体可以包含可能导致或不导致对应氨基酸序列变化的核苷酸添加、缺失和/或置换。在其它实施方案中，所述萜烯合酶变体包含氨基酸添加、缺失和/或置换。
[0069]本文中使用的术语“经工程改造的宿主细胞”表示，通过使用基因工程技术(SP，重组技术)遗传修饰亲本细胞而产生的宿主细胞。经工程改造的宿主细胞可以包含对亲本细胞的基因组的核苷酸序列的添加、缺失和/或修饰。
[0070]本文中使用的术语“异源的”表示，在自然界中通常不存在的物质。术语“异源核苷酸序列”表示在自然界的给定细胞中通常不存在的核苷酸序列。这样，异源核苷酸序列可以是:(a)对于它的宿主细胞而言是的外来(即，对于该细胞而言是“外源的”);(b)在宿主细胞中天然地存在(即，“内源的”)，但是在该细胞中以非天然量存在(即，比在宿主细胞中天然存在的量更大或更小)；或(C)在宿主细胞中天然地存在，但是位于它的天然基因座之外。
[0071]本文中使用的术语“天然存在的”表示在自然界中存在的物质。例如，这样的萜烯合酶是天然存在的萜烯合酶:其存在于可从自然界来源分离出的生物体中，且其尚未在实验室中进行人工故意修饰。相反，本文中使用的术语“天然地不存在的”表示在自然界中不存在、而是通过人工干预产生的物质。
[0072]本文中使用的术语“生物合成酶”表示这样的酶:其在生物合成途径中起作用，从而导致天然存在的分子的产生。
[0073]本文中使用的术`语“体内性能”表示，当在宿主细胞中表达时，萜烯合酶的将聚异戊二烯基二磷酸底物转化成萜烯的能力。因此，术语“提高的体内性能”表示，当在宿主细胞中表达时，萜烯合酶的将聚异戊二烯基二磷酸底物转化成萜烯的能力增加。
[0074]本文中使用的术语“亲本细胞”表示这样的细胞:其具有与本文公开的宿主细胞相同的遗传背景，但是其不包含升高的细胞内FPP水平或者不包含特定异源核苷酸序列，并且其充当引入所述升高的细胞内FPP水平或所述异源核苷酸序列的起始点，从而导致本文公开的宿主细胞的产生。
[0075]【5.2 —般概述】
[0076]本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法。所述方法也允许连续提高这些酶的体内性能。
[0077]在一个方面，本发明提供了具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的筛选方法。在某些实施方案中，通过它们的解救经工程改造的宿主细胞免于细胞死亡的能力，鉴别出具有提高的体内性能的萜烯合酶变体。所述经工程改造的宿主细胞包含会造成升高的细胞内FPP水平的遗传修饰。因为FPP对细胞具有高毒性并因此降低细胞生存力(Withers等人.(2007) Appl.Environ.Microbiol.73:6277-6283)，为了实现与不包含高水平的细胞内FPP的亲本细胞相当的生存力，所述经工程改造的宿主细胞需要足够活性的倍半萜合酶来降低细胞内FPP水平。
[0078]因此，本文提供的筛选方法包括下述步骤:
[0079]a)将表达对照倍半萜合酶的宿主细胞工程改造成包含高水平的FPP，其中与不包含高水平的FPP的亲本细胞相比，所述高水平的FPP会降低宿主细胞的生存力；
[0080]b)在所述宿主细胞中表达试验倍半萜合酶而不是对照倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是对照倍半萜合酶的变体；和
[0081]c)通过与表达对照倍半萜合酶的宿主细胞相比表达试验倍半萜合酶的宿主细胞的生存力增加，将试验倍半萜合酶鉴别为具有与对照倍半萜合酶相比提高的体内性能。
[0082]在某些实施方案中，所述方法进一步包括选择和/或分离具有提高的体内性能的试验倍半萜合酶。
[0083]如果宿主细胞中的高水平的FPP是可诱导的，那么是最方便的。诱导可以响应于诱导剂或特定生长条件(例如，温度)而发生。宿主细胞中高水平的FPP可以在比亲本细胞的FPP水平高约10%到至少约1，000倍或更高的范围内。
[0084]表达对照倍半萜合酶的宿主细胞与亲本细胞相比降低的生存力可以是从降低的细胞生长至致死。因而，在某些实施方案中，与亲本细胞相比，表达对照倍半萜合酶的宿主细胞会在液体培养物中或在琼脂平板上产生减少数目的后代细胞。在其它实施方案中，与亲本细胞相比，表达对照倍半萜合酶的宿主细胞在液体培养物中或在琼脂平板上不产生后代细胞。因此，表达试验倍半萜合酶(而不是对照倍半萜合酶)的宿主细胞的生存力的增加可以表现为:在液体培养 物中，更高数目的后代细胞；或者，在琼脂平板上，与表达对照倍半萜合酶的宿主细胞产生的后代细胞的数目或菌落大小相比，更大的菌落大小。
[0085]通过改变宿主细胞中在FPP或其前体的生产中涉及的酶的表达和/或活性，可以实现宿主细胞中高水平的FPP。在某些这样的实施方案中，改变MEV或DXP途径的酶的表达和/或活性。在某些这样的实施方案中，改变HMG-CoA还原酶和/或甲羟戊酸激酶的表达和/或活性。可替换地，通过改变宿主细胞中FPP或其前体的利用所涉及的酶的表达和/或活性，可以实现宿主细胞中高水平的FPP。在某些这样的实施方案中，改变角鲨烯合酶的表达和/或活性。
[0086]所述对照倍半萜合酶可以是天然存在的倍半萜合酶或天然地不存在的倍半萜合酶。所述试验倍半萜合酶与所述对照倍半萜合酶的差别可能在于，包含一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加。另外或可替换地，所述试验倍半萜合酶可以包含与所述对照倍半萜合酶相同的氨基酸，但是编码这些氨基酸的密码子在所述试验倍半萜合酶和所述对照倍半萜合酶之间可能是不同的。在某些这样的实施方案中，所述密码子为在宿主细胞中的使用经过优化。
[0087]在某些实施方案中，所述对照倍半萜合酶选自:β_金合欢烯合酶、α-金合欢烯合酶、曲古二烯合酶、广藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照倍半萜合酶是黄花蒿(Artemisia annua)的β-金合欢烯合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照倍半職合酶具有在SEQ ID NOilll中给出的氨基酸序列。
[0088]为了能够对比宿主细胞在有试验倍半萜合酶存在下的生存力和宿主细胞在有对照倍半萜合酶存在下的生存力，必须确保所述对照倍半萜合酶和所述试验倍半萜合酶在宿主细胞中的类似表达水平。这可以如下实现:将2种宿主细胞中编码倍半萜合酶的核苷酸序列置于相同调节元件的控制下。
[0089]为了防止其中包含生长促进突变(而不是改进的倍半萜合酶变体)的快速生长的假阳性宿主细胞在宿主细胞培养物中占优势的竞争性生长情形，所述筛选方法的一个实施方案包含基于琼脂平板的选择系统。在该实施方案中，将宿主细胞铺在琼脂平板上，并通过菌落生长来鉴别包含具有提高的体内性能的试验倍半萜合酶变体的宿主细胞。
[0090]本文公开的筛选方法的一个重大优点是，它的以迭代方式持续选择越来越好的倍半萜合酶变体的能力，其中将在一个迭代中鉴别出的试验倍半萜合酶用作后续迭代中的对照倍半萜合酶。因而，该方法可以与本领域已知的其它测定区分开，所述其它测定的目的是，仅仅鉴别特定倍半萜合酶在生物合成途径中是否有活性，并且不寻求鉴别与对照(例如，亲本合酶)相比具有提高的活性的合酶。在某些实施方案中，检查宿主细胞中的FPP水平，并且所述FPP水平可能在每个迭代中增加(例如，通过增加或降低酶的表达水平，增加或减少酶，增加或降低基因的拷贝数，替代控制酶表达的启动子，或通过基因突变而改变酶)至这样的水平:当宿主细胞表达新对照倍半萜合酶(即，前一个迭代的试验倍半萜合酶)时，其造成降低的生存力。可替换地或额外地，在每个迭代中，可以减少对照倍半萜合酶的表达(例如，通过减少对照倍半萜合酶转录物或多肽的表达，或通过使用更弱的启动子，或通过降低对照倍半萜合酶转录物或多肽的稳定性)，以提供降低的对照倍半萜合酶活性。在下一个迭代中，然后可以鉴别这样的试验倍半萜合酶:与前一个迭代的试验倍半萜合酶相比，其仍然具有增加的体内性能。
[0091]本文公开的筛选方法的另一个重大优点是，它的高通量实现的简单性和能力。简单地基于细胞生存力而鉴别出可以将经工程改造的宿主细胞中的细胞内FPP水平降低至无毒水平的倍半萜合酶变体，使得其它昂贵的和费时的筛选方法成为实际上非必需的。因而，在一个实施方案中，使用所述方法针对具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体而筛选倍半萜合酶变体集合(例如，突变体倍半萜合酶文库)。在这样的一个实施方案中，不是在宿主细胞中表达单一试验倍半萜合酶，而是在宿主细胞集合中表达试验倍半萜合酶集合。然后可以在琼脂平板上培养宿主细胞，并可以基于菌落生长而鉴别出表达具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述倍半萜合酶变体集合包含 2-5、5-10、10-50、50-100、100-500、500-1，000、1，000-10，000、10，000-100，000、100，000-1, 000, 000和更多的倍半萜合酶变体。
[0092]本文公开的筛选方法的另一个重大优点是，改进的倍半萜合酶的选择是在体内(而不是在体外)进行。所以，可以获得增强倍半萜合酶变体的体内性能的多种酶性能的提闻。
[0093]在另一个方面，本发明提供了用于鉴别具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的第二种筛选方法。在该第二种筛选方法中，通过它们的使聚异戊二烯基二磷酸(例如，FPP)的宿主细胞饥饿的能力，鉴别出具有提高的体内性能的萜烯合酶变体。在有高活性的萜烯合酶变体存在下，可以耗尽宿主细胞中它的聚异戊二烯基二磷酸底物的细胞内库，从而造成细胞不能维持细胞存活所需的基础细胞过程。
[0094]本文提供的第二种筛选方法因此包括下述步骤:
[0095]a)提供宿主细胞，其表达对照萜烯合酶且具有一定生长速率；[0096]b)在所述宿主细胞中表达试验萜烯合酶而不是对照萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是对照萜烯合酶的变体；和
[0097]c)通过表达试验萜烯合酶的宿主细胞与表达对照萜烯合酶的宿主细胞相比降低的生长速率，将所述试验萜烯合酶鉴别为具有与对照萜烯合酶相比提高的体内性能。
[0098]所述对照萜烯合酶可以是单萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶或多萜合酶。在某些实施方案中，所述对照萜烯合酶是倍半萜合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照萜烯合酶是β_金合欢烯合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照職烯合酶是黄花蒿的β-金合欢烯合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照職烯合酶具有在SEQ ID NOilll中给出的氨基酸序列。
[0099]在有试验萜烯合酶存在下在宿主细胞中被耗尽的聚异戊二烯基二磷酸底物可以是FPP。除了倍半萜以外，从FPP合成宿主细胞的生存力和生长所必需的许多其它化合物。这样的化合物包括、但不限于:角鲨烯、羊毛固醇、麦角固醇、环阿屯醇、胆固醇、类固醇激素和维生素D。因而，在某些实施方案中，表达试验萜烯合酶的宿主细胞可以在它的细胞膜中包含减少的量的胆固醇或麦角固醇。用于定量细胞中的胆固醇或麦角固醇的方法是本领域已知的(例如，Crockett 和 Hazel (2005) J.Experimental Zoology, 271 (3): 190-195; Arthington-Skaggs 等人.(1999) J Clin Microbiol.37 (10): 3332 - 3337; Seitz 等人.(1979)Physiol.Biochem.69:1202-1203)。在某些实施方案中，在有试验萜烯合酶存在下在宿主细胞中不能维持的、细胞存活所需的基础细胞过程是细胞膜的产生和/或维持。在其它实施方案中，在有试验萜烯合酶存在下在宿主细胞中被耗尽的聚异戊二烯基二磷酸底物是GPP或 GGPP。
[0100]在另一个方面，本发明提供了鉴别萜烯合酶变体的体内性能和/或将其排序的竞争方法。所述竞争方法采用已知的萜烯合酶作为与萜烯合酶变体进行对比的对比酶。将对比萜烯合酶和每种萜烯合酶变体在宿主细胞中共表达，它们在所述宿主细胞中竞争相同的聚异戊二烯基二磷酸底物(例 如，GPP、FPP或GGPP)，以产生它们的对应萜类。由于对比酶的性能在宿主细胞中保持恒定，由对比萜烯合酶和萜烯合酶变体产生的萜烯产物的滴度比例的任何变化是萜烯合酶变体的活性的直接结果。结果，这样的比例可以用于鉴别具有提高的体内性能的萜烯合酶变体，和/或针对它们将聚异戊二烯基二磷酸底物转向萜类生产的体内动力学能力对萜烯合酶变体进行排序或定量对比。
[0101]因此，本文提供的竞争方法包括下述步骤:
[0102]a)将宿主细胞群分成对照群和试验群；
[0103]b)在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶可以将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶可以将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；
[0104]c)在所述试验群中表达对比萜烯合酶和试验萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在试验群中和在对照群中以类似的水平表达；和
[0105]d)在试验群中和在对照群中测量第一萜烯与第二萜烯之比。
[0106]值得注意的是，本文公开的竞争方法可以应用于多种萜烯合酶。因而，在单独的实施方案中，使用所述竞争方法来鉴别选自下述的萜烯合酶和/或将其排序:单萜合酶、二萜合酶、倍半萜合酶、二倍半萜合酶、三萜合酶、四萜合酶和多萜合酶。因此，在单独的实施方案中，所述第一萜烯和所述第二萜烯选自:单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜.在某些这样的实施方案中，所述第一萜烯或所述第二萜烯选自:3-金合欢烯、0-金合欢烯、曲古二烯、广藿香醇、紫穗槐二烯、瓦伦烯、法尼醇、橙花叔醇、柠檬烯、香叶烯和努特卡酮。
[0107]所述对照萜烯合酶可以是天然存在的萜烯合酶或天然地不存在的合酶。所述试验萜烯合酶可以包含与对照萜烯合酶相比的氨基酸置换、缺失或添加，或包含由编码对照萜烯合酶和试验萜烯合酶的核苷酸序列中的不同密码子编码的相同氨基酸。在某些实施方案中，所述对照萜烯合酶是倍半萜合酶。在某些这样的实施方案中，所述倍半萜合酶选自:β -金合欢烯合酶、α -金合欢烯合酶、曲古二烯合酶、广藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照倍半萜合酶是黄花蒿的β_金合欢烯合酶。在某些这样的实施方案中，所述对照倍半萜合酶具有在SEQ ID NOilll中给出的氨基酸序列。
[0108]为了能够对比对照群和试验群的第一萜烯/第二萜烯之比，必须确保对比萜烯合酶的类似表达水平。这可以如下实现:将2个宿主细胞群中编码对比萜烯合酶的核苷酸序列置于相同调节元件的控制下。在使用竞争方法来鉴别萜烯合酶变体的实施方案中，2个细胞群中的对照萜烯合酶和试验萜烯合酶的表达水平也必须是类似的。在其中使用竞争方法例如鉴别提供所需表达水平的调节元件(例如，启动子)的其它实施方案中，所述试验萜烯合酶与所述对照萜烯合酶的差别不仅在于核苷酸或氨基酸序列，而且在于表达水平。在这样的实施方案中，使用不同的调节元件来表达所述对照萜烯合酶和所述试验萜烯合酶。
[0109]本文公开的竞争方法具有众多实用性。在某些实施方案中，使用所述方法来筛选具有提高的体内性能的萜烯合酶变体(例如，从突变体萜烯合酶文库中)，其基础是:与对照萜烯合酶相比，具有提高的体内性能的萜烯合酶变体能够将更多通量从聚异戊二烯基二磷酸底物转向它的職烯产物，从而产生更高的目标職烯/对比職烯之比(即，第一職烯/第二萜烯)。在这样的实施方案中，重要的是，在试验群中表达试验萜烯合酶的水平与在对照群中表达对照萜烯合酶的水平类似。
[0110]可以使用类似测定将一系列启动子的强度排序(参见实施例16，例如，其中使用这样的测定来鉴别适合用于在本文公开的第一种筛选方法中表达对照倍半萜合酶的启动子)。在这样的一个实施方案中，所述对照萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是基本上相同的，但是它们处于不同启动子的调节控制下，使得对照群和试验群的差别不在于试验萜烯合酶的类型，而在于它们的试验萜烯合酶的表达水平。在这样的一个实施方案中，对比在试验群中和在对照群中的第一萜烯与第二萜烯之比，会提供这样的信息:所述信息不是关于试验萜烯合酶的活性，而是关于驱动所述试验萜烯合酶表达的启动子的强度。
[0111]另外，该系统可以用于调控由不同细胞产生的2种或更多种萜烯产物的比例，使得具有确定比例的不同细胞的组合混合物具有商业上有用产品的期望性能。
[0112]本文公开的竞争方法的重大优点是，该方法消除了酶表达和活性的细胞之间的变异，该方法是稳健的，并且甚至在宿主细胞中的通向聚异戊二烯基二磷酸底物的总途径通量有限时也可以使用该方法。后者是重要的，因为当通向聚异戊二烯基二磷酸底物的总途径通量超过萜烯滴度时，基于绝对萜烯滴度测量的测定可以掩蔽酶活性的提高。[0113]可以对使用本文公开的筛选方法和/或竞争方法开发的酶进行额外的任选筛选方法，包括、但不限于，荧光筛选和/或通过气相色谱法对萜烯产物的直接定量。更具体地，这包括:用于测量倍半萜(诸如金合欢烯)的产生的、基于尼罗红的高通量荧光测定，和用于测量倍半萜(诸如金合欢烯)的滴度的、基于气相色谱法(GC)的直接定量方法。通过基因工程方法诸如诱导突变等，也可以进一步改进所述改进的酶。所以，接连地完成了增强最终酶性能的多种酶性能的改进，并鉴别出最有效的酶变体。
[0114]本公开内容也涉及优良的金合欢烯合酶变体和包含这样的金合欢烯合酶变体的宿主细胞。所述金合欢烯合酶变体使用本文中公开的方法开发出，并表现出体内性能的超过200%的提高。所述金合欢烯合酶变体具有提高的催化效率，即，它们能够以更快的速率催化它们的反应。这样，在高产量生产具有重大重要性的情况下，它们更适合用于倍半萜产品(诸如金合欢烯)的商业生产。
[0115]因而，在另一个方面，本文提供了分离的金合欢烯合酶变体和包含编码这类β -金合欢烯合酶变体的核苷酸序列的分离的核酸，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含一个或多个在选自下述的位置处的氨基酸置换:SEQ ID Ν0:111 的位置 2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0116]在另一个方面，本发明提供了一种遗传修饰的宿主细胞，其包含:
[0117](a)异源金合欢烯合酶，其中所述异源金合欢烯合酶是由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的变体；和
[0118](b) MEV途径或DXP途径酶；
[0119]其中与包含MEV途`径或DXP途径酶和由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的亲本细胞相比，所述宿主细胞产生多了至少15%的β-金合欢烯。
[0120]在某些实施方案中，所述异源金合欢烯合酶包含一个或多个在选自下述的位置处的氨基酸置换:SEQ ID NO: 111 的位置 2、3、4、6、9、11、18、20、24、35、38、50、61、72、80、89、105、115、144、196、211、251、280、288、319、348、357、359、369、371、385、398、423、433、434、442、444、446、460、467、488、495、505、526、531、556、572 和 575。
[0121]在某些实施方案中，所述MEV途径酶是HMG-CoA还原酶。在某些实施方案中，所述MEV途径酶是甲羟戊酸激酶。在下面的部分5.4中提供了 MEV途径的其它示例性酶。
[0122]在另一个方面，本文提供了一种生产金合欢烯的方法，所述方法包括下述步骤:
[0123](a)获得多个遗传修饰的宿主细胞，其包含:
[0124]i)第一异源核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO: 111编码的β -金合欢烯合酶的变体；和
[0125]ii)第二异源核苷酸序列，其编码MEV途径或DXP途径酶；
[0126](b)在适合生产金合欢烯的条件下，在包含碳源的培养基中，培养所述遗传修饰的宿主细胞；和
[0127](C)从所述培养基回收β -金合欢烯。
[0128]在某些实施方案中，所述MEV途径酶是HMG-CoA还原酶。在某些实施方案中，所述MEV途径酶是甲羟戊酸激酶。在下面的部分5.4中提供了 MEV途径的其它示例性酶。
[0129]【5.3选择宿主细胞】
[0130]可用于实践本发明的宿主细胞包括古细菌(archae)、原核细胞或真核细胞。
[0131]合适的原核宿主包括、但不限于多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或革兰氏不定细菌中的任一种。例子包括、但不限于属于下述属的细胞:土壤杆菌属(Agrobacterium)λ 脂环酸芽抱杆菌属(AlicyclobaciIIus)Λ 鱼渥藻属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、定氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、产色菌属(Chromatium)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、大肠杆菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)Λ 甲基杆菌属(Methylobacterium)Λ 微杆菌属(Microbacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅列蓝细菌属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces )、聚球蓝细菌属(Synnecoccus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)0原核菌株的例子包括、但不限于:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、拜季林斯基梭菌(Clostridiumbeigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium 1ti)、铜绿假单抱菌(Pseudomonas aeru ginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudica)、荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
[0132]合适的古细菌宿主包括、但不限于属于下述属的细胞:气火菌属(Aeropyrum)、古球菌属(Archaeglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、甲焼球菌属(Methanococcus)、甲焼杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)。古细菌菌株的例子包括、但不限于:闪烁古球菌(Archaeoglobusfulgidus)、盐杆菌属(Halobacterium sp.)、詹氏甲焼球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲焼杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和敏捷气火菌(Aeropyrumpernix)。
[0133]合适的真核宿主包括、但不限于:真菌细胞、藻细胞、昆虫细胞和植物细胞。例子包括、但不限于属于下述属的细胞:曲霉菌属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、金孢属(Chrysosporium)、隐球菌属(Cryotococcus )、镰孢属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌属(Neotyphodium)、脉抱菌属(Neurospora)、青霉属(Penici 11 ium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces )、木霉属(Tricho derma)、子囊菌纲(Ascomycota)、担子菌纲(Basidiomycota)、座囊菌纲(Dothideomycetes)和法夫酵母属(Xanthophyl1myces,以前称作Phaffia)。真核菌株的例子包括、但不限于:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜毕赤酵母(Pichia salictaria)、栋树毕赤酵母(Pichia quercuum)、拍氏毕赤酵母(Pichiapijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属(Saccharomycessp.)、裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、拉氏金抱菌(Chrysosporium lucknowense)、键抱菌属(Fusarium sp.)、禾赤键抱(Fusariumgramineum)、键抱霉(Fusarium venenatum)、粗糖链抱霉(Neurospora crassa)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0134]在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在另一个具体实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是选自下述的酿酒酵母细胞:Baker 氏酵母、CBS7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Υ-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1。在某些实施方案中，所述宿主细胞是选自下述的酿酒酵母细胞:PE-2、CAT-1、VR-1、BG-UCR-1和SA-1。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母菌株PE-2。在另一个具体实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母菌株CAT-1。在另一个具体实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母菌株BG-1。
[0135]在某些实施方案中，所述宿主细胞是适合用于工业发酵(例如，生物乙醇发酵)的细胞。在具体实施方案中，调节宿主细胞以在高溶剂浓度、高温、扩大的底物利用、营养物限制、渗透性应激、酸度、亚硫酸盐和细菌污染或它们的组合(它们是工业发酵环境的公认应激条件)下存活。
[0136]【5.4升高的细胞内FPP水平的宿主细胞】
[0137]在某些实施方案中，与亲本细胞相比，宿主细胞包含升高的细胞内FPP水平，其中所述升高的细胞内FPP水平会降低宿主细胞的生存力。
[0138]在某些实施方案中，基于每单位体积的细胞培养物，所述宿主细胞包含的细胞内FPP水平比亲本细胞的细胞内FPP水平高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多。
[0139]在某些实施方案中， 基于每单位细胞干重，所述宿主细胞包含的细胞内FPP水平比亲本细胞的细胞内FPP水平高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多。
[0140]在某些实施方案中，基于酶单位时间内每单位体积的细胞培养物，所述宿主细胞包含的细胞内FPP水平比亲本细胞的细胞内FPP水平高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多。 [0141]在某些实施方案中，基于每单位时间内的每单位细胞干重，所述宿主细胞包含的细胞内FPP水平比亲本细胞的细胞内FPP水平高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多。
[0142]在大多数实施方案中，宿主细胞中升高的细胞内FPP水平可被诱导化合物诱导。在没有诱导化合物存在下，可以容易地操作这样的宿主细胞。然后加入诱导化合物以诱导宿主细胞中高水平的FPP。在其它实施方案中，宿主细胞中升高的细胞内FPP水平可通过改变培养条件(例如，生长温度)来诱导。可诱导的细胞内FPP水平的升高因而会提供宿主细胞的降低的生存力表型的开启和关闭分子开关。
[0143]通过宿主细胞的靶向基因工程，可以实现细胞内FPP水平的升高。已知许多酶在FPP及其前体的产生和利用中起作用，可以操纵这些酶中的任一种来改变宿主细胞中FPP的水平。
[0144]在某些实施方案中，通过增加宿主细胞中细胞乙酰辅酶A的产生，增加宿主细胞中FPP的产生。
[0145]在某些实施方案中，通过增加宿主细胞中IPP和/或DMAPP的产生，增加宿主细胞中FPP的产生。在某些这样的实施方案中，通过增加MEV途径的一种或多种酶的活性，增加宿主细胞中IPP和DMAPP的产生。在图15中描述了 MEV途径的示意图。一般而言，该途径包括六个步骤。
[0146]在第一步中，两分子的乙酰辅酶A经酶催化结合形成乙酰乙酰辅酶A。已知催化该步骤的酶是，例如，乙酰辅酶A硫解酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于以下GenBank登录号以及该序列所源自的生物:(NC_000913 REGION:2324131..2325315 ;大肠杆菌)、(D49362 ;脱氮副球菌)和(L20428 ;酿酒酵母)。
[0147]在MEV途径的第二步中，乙酰乙酰辅酶A与另一分子的乙酰辅酶A经酶催化缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(NCJ)Ol 145.补体19061..20536 ;酿酒酵母)、(X96617 ;酿酒酵母)、(X83882 ;拟南芥)、(AB037907 ;浅灰北里孢菌)、(BT007302 ;智人)和(NC_002758，基因座标签SAV2546、GeneIDl 122571 ;金黄色葡萄球菌)。
[0148]在第三步中，HMG-CoA经酶催化转化成甲羟戊酸。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(NM_206548 ;黑腹果蝇)、(NC_002758，基因座标签 SAV2545、GeneID 1122570 ;金黄色葡萄球菌)、(NM_204485 ；原鸡)、(AB015627 ;链霉菌属KO 3988)、(AF542543 ;渐尖烟草)、(AB037907 ;浅灰北里孢菌)、(AX128213，其提供的序列编码截短的HMGR;酿酒酵母)和(NC_001145:补体(115734..118898 ;酿酒酵母)。
[0149]在第四步中，甲羟戊酸被酶催化磷酸化，形成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(L77688 ;拟南芥)和(X55875 ;酿酒酵母)。
[0150]在第五步中，第二个磷酸基团经酶催化添加到甲羟戊酸5-磷酸上，形成甲羟戊酸5-焦磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AF429385 ;巴西橡胶树)、(NM_006556 ;智人)和(NC_001145.补体712315..713670 ;酿酒酵母)。[0151]在第六步中，甲羟戊酸5-焦磷酸被酶催化转化成IPP。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(X97557 ;酿酒酵母)、(AF290095 ;屎肠球菌)和(U49260 ;智人)。
[0152]在其它这样的实施方案中，通过增加DXP途径的一种或多种酶的活性，增加宿主细胞中IPP和DMAPP的产生。在图16中描述了 DXP途径的示意图。一般而言，DXP途径包括七个步骤。
[0153]在第一步中，丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AF035440 ;大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0527 ;恶臭假单胞菌KT2440)、(CP000026，基因座标签SPA2301 ;肠道副伤寒沙门氏菌、参见ATCC9150)、(NC_007493，基因座标签 RSP_0254 ;球形红杆菌 2.4.1)、(NC_005296，基因座标签 RPA0952 ；沼泽红假单胞菌CGA009)、(NCJKM556，基因座标签TO1293 ;蒂梅丘拉苛养木杆菌I)和(NC_003076，基因座标签AT5G11380 ;拟南芥)。
[0154]在第二步中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化成2C-甲基-D-赤藓醇_4_磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(ABO13300 ;大肠杆菌)、(AF148852 ;拟南芥)、(NC_002947,基因座标签PP1597 ;恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，基因座标签SC05694 ;天蓝色链霉菌A3⑵)、(NC_007493，基因座标签RSP_2709 ;球形红杆菌2.4.1)和(NC_007492，基因座标签Pfl_1107 ;荧光假单胞菌PfO-1)。
[0155]在第三步中，2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合成酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AF230736 ;大肠杆菌)、(NC_007493，基因座_标签RSP_2835 ;球形红杆菌2.4.1)、(NC_003071，基因座_标签AT2G02500 ;拟南芥)和(NC_002947，基因座_标签PP1614 ;恶臭假单胞菌KT2440)。
[0156]在第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇被转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AF216300 ;大肠杆菌)和(NC_007493，基因座_标签RSP_1779 ;球形红杆菌2.4.1)。
[0157]在第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸被转化成2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AF230738 ;大肠杆菌)、(NC_007493，基因座_标签RSP_6071 ;球形红杆菌2.4.1)和(NC_002947，基因座_标签PP1618 ;恶臭假单胞菌KT2440)。
[0158]在第六步中，2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸被转化成1-羟基_2_甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸合酶。核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AY033515 ;大肠杆菌)、(NC_002947，基因座_标签PP0853 ;恶臭假单胞菌KT2440)和(NC_007493，基因座_标签RSP_2982 ;球形红杆菌 2.4.1)。
[0159]在第七步中，1-羟基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸被转化成IPP或它的异构体DMAPP。已知催化该步骤的酶是，例如，异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合酶.核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(AY062212 ;大肠杆菌)和(NC_002947，基因座_标签PP0606 ；恶臭假单胞菌KT2440)。
[0160]在某些实施方案中，通过增加IPP向DMAPP的异构化，增加宿主细胞中FPP的产生。在某些这样的实施方案中，通过增加IPP异构酶的活性，增加所述IPP向DMAPP的异构化。编码IPP异构酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(NC_000913、3031087..3031635 ;大 肠杆菌)和(AF082326 ;雨生红球藻)。
[0161]在某些实施方案中，通过增加生成FPP的IPP和DMAPP的缩合，增加宿主细胞中FPP的产生。在某些这样的实施方案中，通过增加FPP合酶的活性，增加生成FPP的IPP和DMAPP的缩合或者IPP和香叶基焦磷酸(“GPP”)的缩合。编码FPP合酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于:(ATU80605 ;拟南芥)、(ATHFPS2R ;拟南芥)、(AAU36376 ;黄花蒿)、(AF461050 ;欧洲牛)、(D00694 ;大肠杆菌 K-12)、(AE009951，基因座 AAL95523 ;具核梭杆菌具核亚种ATCC25586)、(GFFPPSGEN ;藤仓赤霉菌)、(CP000009，基因座AAW60034 ；氧化葡糖杆菌621H)、(AF019892 ;向日葵)、(HUMFAPS ;智人)、(KLPFPSQCR ;乳酸克鲁维酵母)、(LAU15777 ;白羽扇豆)、(LAU2O77I ;白羽扇豆)、(AF3O95O8 ;小家鼠)、(NCFPPSGEN ；粗糙链孢霉)、(PAFPS1 ;银胶菊)、(PAFPS2 ;银胶菊)、(RATFAPS ;褐家鼠)、(YSCFPP ;酿酒酵母)、0)89104 ;粟酒裂殖酵母)、(CP000003，基因座AAT87386 ;酿脓链球菌)、(CP000017,基因座AAZ51849 ;酿脓链球菌)、(NC_008022，基因座YP_598856 ;酿脓链球菌MGAS10270)、(NC_008023,基因座 YP_600845 ;酿脓链球菌 MGAS2096)、(NC_008024,基因座 YP_602832 ；酿脓链球菌 MGAS10750)、(MZEFPS ;玉米)、(ΑΕ000657，基因座 AAC06913 ;风产液菌 VF5)、(ΝΜ_202836 ;拟南芥)、(D84432，基因座ΒΑΑ12575 ;枯草芽孢杆菌)、(U12678，基因座AAC28894 ;大豆慢生根瘤菌USDA110)、(BACFDPS ;嗜热脂肪土芽孢杆菌)、(NC_002940，基因座NP_873754 ;杜克雷嗜血杆菌35000HP)、(L42023，基因座AAC23087 ;流感嗜血杆菌Rd KW20)、(J05262;智人)、(YP_395294 ;清酒乳杆菌清酒亚种 23K)、(NC_005823，基因座YP_000273 ；问号钩端螺旋体哥本哈根血清型Fiocruz株Ll-130)、(ΑΒ003187 ;藤黄微球菌)、(NC_002946，基因座 YP_208768 ;淋病奈瑟球菌 FA 1090)、(U00090，基因座 ΑΑΒ91752 ；根瘤菌属NGR234)、(J05091 ;酿酒酵母)、(CP000031，基因座AAV93568 ;波氏硅杆菌DSS-3)、(ΑΕ008481，基因座 ΑΑΚ99890 ;肺炎链球菌 R6)和(NC_004556，基因座 NP 779706 ；
蒂梅丘拉苛养木杆菌I)。
[0162]在某些实施方案中，通过抑制使中间体从产生步骤转向FPP形成的反应，增加宿主细胞中FPP的产生。这样的反应包括、但不限于TCA循环的导致下述结果的副反应:脂肪酸生物合成、丙氨酸生物合成、天冬氨酸超途径、糖原异生、血红素生物合成、谷氨酸生物合成、以及乙酰辅酶A通过磷酸乙酰基转移酶的作用向乙酸的转化。
[0163]在某些实施方案中，通过减少宿主细胞中FPP的消耗，得到包含升高的细胞内FPP水平的宿主细胞。在某些这样的实施方案中，通过降低可以将FPP转化成角鲨烯的法呢基-二磷酸法呢基转移酶或角鲨烯合酶的活性，减少宿主细胞中FPP的消耗。在其它这样的实施方案中，通过降低宿主细胞中倍半萜合酶的活性，减少宿主细胞中FPP的消耗。
[0164]通过使用基因工程技术(即，重组技术)、经典的微生物学技术或这类技术的组合遗传修饰亲本细胞，可以产生包含升高的细胞内FPP水平的宿主细胞。所述宿主细胞也可以是天然存在的遗传变体，其由于升高的细胞内FPP水平而在某些生长条件下是不可存活的。
[0165]通过将宿主细胞在固体培养基上的生长与不包含升高的细胞内FPP水平的亲本细胞的生长进行对比，可以鉴别出包含这样的升高的细胞内FPP水平的宿主细胞，其具有减少细胞生存力。与它的亲本细胞相比，包含高水平的细胞内FPP的宿主细胞将在固体琼脂培养基上产生更少的或更小的菌落。可以如下鉴别出仅在某些生长条件下生长的包含升高的细胞内FPP水平的宿主细胞:首先在特定条件下培养宿主细胞，在该条件下，所述宿主细胞不包含升高的细胞内 FPP水平，并且在该条件下，所述宿主细胞具有与它的亲本细胞相同的生存力(“允许性生长条件”)，然后将所述宿主细胞影印平板，并在特定条件下进行培养，在该条件下，所述宿主细胞不包含升高的细胞内FPP水平(“限制性生长条件”)，以鉴别仅在限制性生长条件下具有降低的生存力、但是在允许性生长条件下不具有降低的生存力的宿主细胞。这样的限制性生长条件可以包括、但不限于:特定营养物在培养基中的存在，特定水平的特定营养物在培养基中的存在，诱导化合物在培养基中的存在，抑制化合物在培养基中的存在，和特定生长温度。
[0166]【5.5職烯合酶】
[0167]本文提供的方法聚焦于开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体。
[0168]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体是天然存在的萜烯合酶的变体。在其它实施方案中，所述職烯合酶变体是天然地不存在的職烯合酶的变体。
[0169]在某些这样的实施方案中，所述萜烯合酶变体与天然存在的萜烯合酶或与天然地不存在的萜烯合酶的差别在于一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加。在某些实施方案中，所述萜烯合酶与天然存在的萜烯合酶或与天然地不存在的萜烯合酶的差别在于，包含
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个额外氨基酸。在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体与天然存在的萜烯合酶或与天然地不存在的萜烯合酶的差别在于，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体与天然存在的萜烯合酶或与天然地不存在的萜烯合酶的差别在于，缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。
[0170]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体与天然存在的萜烯合酶或天然地不存在的萜烯合酶的氨基酸序列具有约50%至约55%、约55%至约60%、约60%至约65%、约65%至约70%、约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、或约95%_99%氨基酸序列同一性。
[0171]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体包含共有氨基酸序列。如下衍生出共有氨基酸序列:对比3个或更多个氨基酸序列，并鉴别被所述序列中的至少2个共有的氨基酸。在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体包含源自2个或更多个天然存在的萜烯合酶的共有序列。
[0172]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体是杂种萜烯合酶。杂种萜烯合酶包含得自2种或更多种不同萜烯合酶的连续氨基酸段。使用任意已知方法，包括、但不限于外显子改组、结构域切换等(例如，Nixon等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:1069-1073;Fisch 等人.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93 (15):7761-7766)，可以制备杂种萜烯合酶。
[0173]在某些实施方案中，包含编码萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸在严谨杂交条件下与编码天然存在的萜烯合酶的核酸杂交。在另一个实施方案中，包含编码萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸在中等杂交条件下与编码天然存在的萜烯合酶的核酸杂交。在另一个实施方案中，包含编码萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸在低严谨性杂交条件下与编码天然存在的萜烯合酶的核酸杂交。
[0174]在某些实施方案中，从编码天然存在的萜烯合酶的核苷酸序列改造编码萜烯合酶变体的核苷酸序列，以反映特定宿主细胞的密码子偏好(即，为在特定宿主细胞中的表达进行了密码子优化)。特定宿主细胞的优选密码子的使用通常会增加核苷酸序列的翻译可能性，并因此增加其表达`可能性。可以得到许多生物的密码子选择表，其总结了特定生物使用特定密码子来编码特定氨基酸的次数的百分比，并且可以在设计合适的核苷酸序列时用作参照。在某些实施方案中，改变编码萜烯合酶的核苷酸序列，以反映酿酒酵母的密码子偏好(参见，例如，Bennetzen和 Hall (1982) J.Biol.Chem.257(6): 3026-3031)。在某些实施方案中，改变编码萜烯合酶的核苷酸序列，以反映大肠杆菌的密码子偏好(参见，例如，Gouy和 Gautier(1982)Nucleic Acids Res.10(22):7055-7074;Eyre-ffalker (1996)Mol.Biol.Evol.13(6):864-872; Nakamura 等人.(2000) Nucleic Acids Res.28(1):292) ?
[0175]使用多种已知的重组技术中的任一种和合成操作，可以得到包含编码萜烯合酶的核苷酸序列的核酸。所述核酸可以从基因组DNA、cDNA或RNA (它们都可以从细胞直接提取)制备，或者可以通过不同的扩增方法(包括、但不限于PCR和rt-PCR)重组产生。直接化学合成方法也是本领域众所周知的。
[0176]使用多种已知方法中的任一种，可以得到包含编码萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸。例如，核酸可以分离自用化学诱变剂或辐射处理过的细胞，或者分离自具有DNA修复缺陷的细胞。合适的化学诱变剂包括、但不限于:甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、二乙基硫酸盐、苯并芘、环磷酰胺、博来霉素、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、二环氧烷烃(例如，二环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、盐酸丙卡巴肼、环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7，12 二甲基苯并蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酰胺、白消安(bisulfan)和Π丫唳染料(参见,例如Thomas
D.Brock, Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第 2 版(1989)Sinauer Associates,Inc., Sunderland, Mass.,或 Deshpande Mukund V., Appl.Biochem.Biotechnol.36，227(1992))。合适的辐射暴露包括、但不限于:紫外辐射(任选地与化学剂(例如，三甲基补骨脂素)暴露相组合)、Y-辐照、X-射线和快速中子轰击。适用于将DNA修复缺陷引入细胞中的方法包括、但不限于突变型DNA修复酶的表达，该酶会在细胞的基因组中产生高频突变(在约I个突变/100个基因至约I个突变/10，000个基因的量级)。编码DNA修复酶的基因的例子包括、但不限于:Mut H、Mut S、Mut L和Mut U以及它们在其它物种中的同系物(例如，MSH1-6、PMS 1-2、MLH 1、GTBP和ERCC-1)。用于得到包含编码萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸的其它方法包括:无细胞的体外系统的操作(例如，使用用于扩增核酸的易出错的PCR)，易变DNA元件(例如，转座元件)在细胞基因组中的随机或靶向插入，或体外DNA改组(例如，外显子改组、结构域切换等；参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley 和 Sons, New York(最近版)；和 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001))。
[0177]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体是选自下述的倍半萜合酶的变体:β -金合欢烯合酶、α -金合欢烯合酶、曲古二烯合酶、广藿香醇合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶和努特卡酮合酶。
[0178]在某些实施方案中，所述萜烯合酶变体是金合欢烯合酶变体。在某些这样的实施方案中，所述β_金合欢烯合酶变体源自黄花蒿的β_金合欢烯合酶。以前已经描述了黄花蒿的β_金合欢烯合酶的序列(Picaud,等人，(2005)Phytochemistry66(9):961-967)。黄花蒿的β -金合欢烯合酶的核苷酸序列在GenBank登录号AY835398和如本文提供的SEQ ID NO: 112下保藏。黄花蒿的β -金合欢烯合酶的氨基酸序列在GenBank登录号ΑΑΧ39387和如本文提供的SEQ ID NO: 111下保藏。
[0179]在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID Ν0:111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置2处的从丝氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换(S2D突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置3处的从苏氨酸至天冬酰胺的氨基酸置换(Τ3Ν突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置4处的从亮氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(L4S突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置6处的从异亮氨酸至苏氨酸的氨基酸置换(Ι6Τ突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置9处的从缬氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换(V9D突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置11处的从苯丙氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(Fl IS突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置20处的从缬氨酸至谷氨酸的氨基酸置换(V20E突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置24处的从缬氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换(V24D突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置35处的从蛋氨酸至苏氨酸的氨基酸置换(Μ35Τ突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置38处的从天冬酰胺至丝氨酸的氨基酸置换(N38S突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置50处的从天冬氨酸至天冬酰胺的氨基酸置换(D50N突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置61处的从亮氨酸至谷氨酰胺的氨基酸置换(L61Q突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置72处的从谷氨酸至赖氨酸的氨基酸置换(Ε72Κ突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置72处的从谷氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(E72V突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置80处的从天冬酰胺至天冬氨酸的氨基酸置换(N80D突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置89处的从异亮氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(I89V突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置105处的从谷氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换(ElOro突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置115处的从异亮氨酸至蛋氨酸的氨基酸置换(Ι115Μ突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置115处的从异亮氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(I115V突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ IDNO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置144处的从苯丙氨酸至酪氨酸的氨基酸置换(F144Y突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID Ν0:111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置196处的从苏氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(T196S突变)。在某些实施方案中，所述 β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置211处的从丝氨酸至苏氨酸的氨基酸置换(S211T突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置251处的从亮氨酸至蛋氨酸的氨基酸置换(L251M突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置280处的从亮氨酸至谷氨酰胺的氨基酸置换(L280Q突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置288处的从酪氨酸至苯丙氨酸的氨基酸置换(Y288F突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置319处的从苏氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(T319S突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQID NOilll中给出的氨基酸序列，但是包含在位置357处的从谷氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(E357V突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置359处的从谷氨酸至苏氨酸的氨基酸置换(Ε359Τ突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置369处的从缬氨酸至亮氨酸的氨基酸置换(V369L突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置371处的从亮氨酸至蛋氨酸的氨基酸置换(L371M突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置385处的从苏氨酸至丙氨酸的氨基酸置换(Τ385Α突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置398处的从异亮氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(I398V突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置423处的从缬氨酸至异亮氨酸的氨基酸置换(V423I突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置433处的从蛋氨酸至异亮氨酸的氨基酸置换(Μ433Ι突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ IDNO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置434处的从异亮氨酸至苏氨酸的氨基酸置换(Ι434Τ突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID Ν0:111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置442处的从甘氨酸至丙氨酸的氨基酸置换(G442A突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置442处的从甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换(G442D突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置444处的从异亮氨酸至亮氨酸的氨基酸置换(I444L突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置446处的从苏氨酸至天冬酰胺的氨基酸置换(Τ446Ν突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置460处的从异亮氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(I460V突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置467处的从缬氨酸至异亮氨酸的氨基酸置换(V467I突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置488处的从丝氨酸至苯丙氨酸的氨基酸置换(S488F突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQID NOilll中给出的氨基酸序列，但是包含在位置495处的从谷氨酸至甘氨酸的氨基酸置换(E495G突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置505处的从谷氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(E505V突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置526处的从苏氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(T526S突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置531处的从脯氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(P531S突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置556处的从丙氨酸至缬氨酸的氨基酸置换(A556V突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置572处的从蛋氨酸至赖氨酸的氨基酸置换(Μ572Κ突变)。在某些实施方案中，所述金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置575处的从终止密码子至赖氨酸的氨基酸置换(stop575K突变)。在某些实施方案中，所述β-金合欢烯合酶变体具有在SEQ ID NO: 111中给出的氨基酸序列，但是包含在位置348处的从精氨酸至赖氨酸的氨基酸置换(R348K突变)。在某些实施方案中，所述β -金合欢烯合酶变体具有在SEQID NOilll中给出的氨基酸序列，但是包含在位置18处的从亮氨酸至异亮氨酸的氨基酸置换(L18I突变)。
[0180]【5.6遗传工程改造宿主细胞】
[0181]本文提供的方法包括获得宿主细胞，所述宿主细胞被遗传工程改造成包含升高的细胞内FPP水平或表达萜烯合酶或萜烯合酶变体。这样的遗传工程改造的宿主细胞可以以特定方式包含核苷酸的插入、缺失或修饰，从而提供升高细胞内FPP水平或表达萜烯合酶或萜烯合酶变体的期望效应。这样的遗传修饰可以导致特定酶的拷贝数或活性的下降或增加或改变。
[0182]例如，通过改变编码酶的基因的转录，可以改变宿主细胞中酶的拷贝数。这可以如下实现:例如，通过改变编码酶的核苷酸序列的拷贝数(例如，通过使用更高或更低拷贝数的包含核苷酸序列的表达 载体，或通过将额外的核苷酸序列拷贝引入宿主细胞基因组中，或通过删除或破坏宿主细胞基因组中的核苷酸序列)，通过改变操纵子的多顺反子mRNA上的编码序列的次序或将操纵子分解成各自具有它自己的控制元件的单个基因，或通过增加核苷酸序列与其可操作地连接的启动子或操纵基因的强度。可替换地或另外，通过改变编码酶的mRNA的翻译水平，可以改变宿主细胞中酶的拷贝数。这可以如下实现:例如，通过改变mRNA的稳定性，改变核糖体结合位点的序列，改变核糖体结合位点和酶编码序列的起始密码子之间的距离或序列，改变位于酶编码区的起始密码子的“上游”或5’侧附近的整个顺反子间区域，使用发夹和专门序列稳定化mRNA转录物的3’-末端，改变酶的密码子选择，改变在酶的生物合成中使用的稀有密码子tRNA的表达，和/或增加酶的稳定性，例如，通过它的编码序列的突变。
[0183]可以以许多方法改变宿主细胞中酶的活性，所述方法包括、但不限于:表达在宿主细胞中表现出增加的或降低的溶解度的改变形式的酶，表达缺少用于抑制酶活性的结构域的改变形式的酶，表达对底物具有更高或更低Kcat或更低或更高Km的改变形式的酶，或表达或多或少受该途径中的其它分子的反馈或前馈调节的改变形式的酶。
[0184]本文提供的方法进一步包括下述步骤:在不天然地表达这样的職烯合酶或職烯合酶变体的宿主细胞中，表达萜烯合酶或萜烯合酶变体。可以如下实现萜烯合酶或萜烯合酶变体在宿主细胞中的表达:向所述宿主细胞中引入包含编码萜烯合酶或萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸，其处于允许在宿主细胞中表达的调节元件的控制下。在某些实施方案中，所述核酸是染色体外质粒。在其它实施方案中，所述核酸是染色体整合载体，其可以将所述核苷酸序列整合进宿主细胞的染色体中。
[0185]在某些实施方案中，萜烯合酶或萜烯合酶变体在2个或更多个宿主细胞中的表达水平必须是类似的。这可以使用在相同调节元件控制下的包含编码萜烯合酶或萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸来实现。这样的核酸可以用作染色体外表达载体，或者用于将编码萜烯合酶或萜烯合酶变体的核苷酸序列和调节元件整合进宿主细胞的染色体中。可比较的表达水平还可以如下实现:将包含编码萜烯合酶或萜烯合酶变体的核苷酸序列的核酸靶向2个或更多个宿主细胞中的相同位置，从而将所述核苷酸序列置于相同内源调节元件控制下。除了使用类似的调节元件以外，可比较的表达水平还可以取决于2个或更多个宿主细胞中的类似拷贝数的核苷酸序列。可以如下控制拷贝数:通过在染色体外表达载体中使用类似的或相同的复制起点，或者通过使用类似类型和数目的染色体整合构建体将所述核苷酸序列整合进2个或更多个宿主细胞的染色体中。核酸的许多其它特征可以影响编码的萜烯合酶或職烯合酶变体的表达水平(例如，蛋白或mRNA稳定性,核糖体结合位点序列，核糖体结合位点和起始密码子之间的距离，上游和下游序列、发夹和其它专门序列的性质，以及密码子选择)，并且可以改变所有这些以确保类似的表达水平(当在提供的方法中需要时)。[0186]通过本领域技术人员已知的任意方法(但不限于此)，可以将核酸引入微生物中(参见，例如，Hinnen 等人.(1978) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1292-3; Cregg等人.(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385;Goeddel 等人.，编,1990, Methods in Enzymology,第185 卷,Academic Press, Inc.，CA;Krieger, 1990，Gene Transfer and Expression—ALaboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook 等人.，1989, Molecular Cloning—ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY ;和 Ausubel 等人.，编，最近版,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates andWiley Interscience, NY) ?示例性的技术包括、但不限于:原生质球化(spheroplasting)、电穿孔、PEG 1000介导的转化、以及醋酸锂或氯化锂介导的转化。
[0187]在某些实施方案中，用于遗传修饰宿主细胞的核酸包含一个或多个选择标记，所述选择标记可用于选择转化的宿主细胞和用于将选择压力施加于宿主细胞以维持外源DNA。
[0188]在某些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性标志物。抗生素抗性标志物的示例性例子包括、但不限于:BLA、NATl、PAT、AUR1-C、PDR4、SMRl、CAT、小鼠 dhfr、HPH、DSDA,KANe和SH BLE基因产物。得自大肠杆菌的BLA基因产物会赋予对β -内酰胺抗生素(例如，窄谱头孢菌素类、头霉素类和碳青霉烯类(厄他培南)、头孢孟多和头孢哌酮)的抗性和对除了替莫西林以外的所有抗革兰氏阴性细菌青霉素的抗性；得自诺尔斯氏链霉菌的NATl基因产物会赋予对诺尔丝菌素的抗性；得自绿色产色链霉菌Tu94的PAT基因产物会赋予对双丙氨膦(bialophos)的抗性；得自酿酒酵母的AURl-C基因产物会赋予对短梗霉素A(AbA)的抗性；H)R4基因产物会赋予对变蓝菌素的抗性；SMR1基因产物会赋予对甲嘧磺隆的抗性；得自Tn9转座子的CAT基因产物会赋予对氯霉素的抗性；小鼠dhfr基因产物会赋予对甲氨蝶呤的抗性；肺炎克雷伯菌的HPH基因产物会赋予对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在含有D-丝氨酸作为唯一氮源的平板上生长；Tn903转座子的KANe基因会赋予对G418的抗性；并且得自印度斯坦链异壁菌的SH BLE基因产物会赋予对Zeocin(博来霉素)的抗性。在某些实施方案中，在分离本文公开的遗传修饰的宿主细胞以后，删除抗生素抗性标志物。
[0189]在某些实施方案中，所述选择标记会解救遗传修饰的微生物中的营养缺陷体(例如，营养的营养缺陷体)。在这样的实施方案中，亲本微生物包含一种或多种基因产物的功能破坏，所述基因产物在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用，并且当无功能时会使亲本细胞不能在没有添加一种或多种营养物的培养基中生长。这样的基因产物包括、但不限于:酵母中的HIS3、LEU2、LYSl、LYS2、MET15、TRPl、ADE2和URA3基因产物。然后可以通过用编码被破坏的基因产物的功能拷贝的表达载体或染色体整合构建体转化亲本细胞来解救营养缺陷型表型，并且可以基于亲本细胞的营养缺陷型表型的丧失来选择产生的遗传修饰的宿主细胞。URA3、TRP1和LYS2基因作为选择标记的应用具有显著的优点，因为阳性和阴性选择是可能的。阳性选择通过URA3、TRP1和LYS2突变的营养缺陷型互补进行，而阴性选择是基于特异性的抑制剂，即，分别为5-氟-乳清酸(FOA)、5-氟邻氨基苯甲酸和α-氨基己二酸(aAA)，它们会阻止原营养型菌株的生长，但是分别允许URA3、TRPl和LYS2突变体的生长。
[0190]在其它实施方案中，所述选择标记会解救通过已知选择方法可鉴别的其它非致命缺陷或表型。
[0191]【5.7培养宿主细胞】
[0192]本发明提供了用于开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法和用于生产萜类的方法。所述方法通常包括:在合适的条件下在合适的包含碳源的培养基中培养宿主细胞。
[0193]用于培养微生物的合适条件和合适培养基是本领域众所周知的。在某些实施方案中，所述合适培养基补充了一种或多种其它试剂，例如，诱导化合物(例如，当一个或多个编码基因产物的核苷酸序列处于诱导型启动子控制下时)、抑制化合物(例如，当一个或多个编码基因产物的核苷酸序列处于可抑制型启动子控制下时)、或选择剂(例如，用于选择包含遗传修饰的微生物的抗生素)。
[0194]在某些实施方案中，所述碳源是单糖(monosaccharide, simple sugar)、二糖、多糖、不可发酵的碳源、或其中的一种或多种的组合。合适的单糖的非限制性例子包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖和它们的组合。合适的二糖的非限制性例子包括:蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖和它们的组合。合适的多糖的非限制性例子包括:淀粉、糖原、纤维素、甲壳质和它们的组合。合适的不可发酵的碳源的非限制性例子包括乙酸盐和甘油。
[0195]在一个方面，本发明提供了基于包含试验萜烯合酶的宿主细胞的生长速率来鉴别具有提高的体内性能的萜烯合`酶的方法。可以如下确定宿主细胞的生长速率:例如，在液体培养基中培养宿主细胞确定的时间段，然后将全部培养物或培养物的等分试样铺在琼脂平板上，最后对在琼脂平板上形成的菌落数评分。可替换地，通过在确定的时间段以后测量培养物的生物量来确定宿主细胞的生长速率。可以如下测量生物量:通过确定液体培养物的密度，例如通过紫外光谱测定法，或通过定量生物量指标分子诸如己糖胺和麦角固醇(Frey等人.(1992)Biol.Fertil.Soils 13:229-234;Newell (1992)第 521 - 561 页.G.C.Carroll和 D.T.Wicklow(编),The fungal community:1ts organization and role in theecosystem,第 2 版Marcel Dekker Inc., New York)。
[0196]【5.8生产萜类】
[0197]本发明提供了用于生产萜类的方法。
[0198]在某些实施方案中，以大于约10克/升发酵培养基的量生产萜烯。在某些这样的实施方案中，以每升细胞培养物约10至约50克、超过约15克、超过约20克、超过约25克、或超过约30克的量生产職烯。
[0199]在某些实施方案中，以大于约50毫克/克细胞干重的量生产萜烯。在某些这样的实施方案中，以每克细胞干重约50至约1500毫克、超过约100毫克、超过约150毫克、超过约200毫克、超过约250毫克、超过约500毫克、超过约750毫克、或超过约1000毫克的量
生产職烯。
[0200]在某些实施方案中，基于每单位体积的细胞培养物，以与不包含第一个异源核苷酸序列的宿主细胞生产的萜烯量相比高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多的量生产萜烯。
[0201]在某些实施方案中，基于每单位细胞干重，以与不包含第一个异源核苷酸序列的宿主细胞生产的萜烯量相比高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多的量生产萜烯。
[0202]在某些实施方案中，基于酶单位时间内每单位体积的细胞培养物，以与不包含第一个异源核苷酸序列的宿主细胞生产的萜烯量相比高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多的量生产職烯。
[0203]在某些实施方案中，基于每单位时间内的每单位细胞干重，以与不包含第一个异源核苷酸序列的宿主细胞生产的萜烯量相比高了至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约4 00倍、至少约500倍、或至少约1，000倍或更多的量生产萜烯。
[0204]【5.9提取和定量萜类】
[0205]使用本领域已知的任意合适的分离和纯化方法，可以从发酵液中分离由本发明的遗传修饰的宿主细胞生产的萜烯。
[0206]在某些实施方案中，通过离心从发酵液中分离出包含萜烯的有机相。在其它实施方案中，包含萜烯的有机相自发地从发酵液中分离出。在其它实施方案中，通过向发酵反应物中加入破乳剂和/或成核剂，使包含萜烯的有机相从发酵液中分离出。破乳剂的示例性例子包括絮凝剂和促凝剂。成核剂的示例性例子包括職烯自身和有机溶剂(诸如十二烧、肉豆蘧酸异丙酯和油酸甲酯)的微滴。
[0207]在某些实施方案中，使萜烯与可能存在于有机相中的其它产物分离。在某些实施方案中，使用吸附、蒸馏、气液萃取(汽提)、液-液萃取(溶剂萃取)、超滤和标准色谱技术实现分离。
[0208]在某些实施方案中，所述萜烯是纯的，例如，至少约40%纯、至少约50%纯、至少约60%纯、至少约70%纯、至少约80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、至少约98%纯或超过98%纯，其中在萜烯的背景下使用的“纯的”表示不含有其它萜类或污染物的萜烯。
[0209]使用本领域已知的众所周知的方法，可以容易地定量萜烯产生，所述方法包括、但不限于:气相色谱法(GC)、气相色谱法-质谱法(GC/MS)、核磁共振(匪R)、拉曼光谱法、光吸收(UV/VIS)、红外光谱法(IR)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法-质谱法(LC/MS)、离子色谱法-质谱法、薄层色谱法、脉冲电流计检测和紫外-可见光光谱测定法。
[0210]使用多种方法中的任一种，可以回收由宿主细胞产生的萜类，所述方法包括、但不限于色谱法、萃取、溶剂萃取、膜分离、电渗析、反渗透、蒸馏、化学衍生化和结晶。
[0211]改善萜烯定量或分离的其它处理步骤包括、但不限于:破碎宿主细胞。合适的方法包括、但不限于:涡旋、声处理和使用玻璃珠。其它处理步骤可以包括离心，以从上清液中除去不希望的细胞碎片。
[0212]【实施例】
[0213]下述具体实施例意图例证本公开内容，且不应解释为限制权利要求的范围。
[0214]【实施例1】[0215]本实施例描述了制备DNA构建体的方法，所述DNA构建体可用于制备和表征萜烯合酶变体。
[0216]通过将MevT66操纵子插入载体pAM36中，制备了表达质粒pAM36_MevT66。通过从PACYC184载体(GenBank登录号X06403)中除去tet抗性基因并向其中加入含有Asc1-Sfil-AsiS1-Xho1-Pac1-FsIl-Pmel 限制位点的寡核苷酸盒，制备了载体 pAM36。MevT66操纵子编码MEV途径酶集合，所述酶一起将普遍存在的前体乙酰辅酶A转化成(R)-甲羟戊酸，即乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶。合成地制备了MevT66操纵子，且其包含:为在大肠杆菌中表达经过密码子优化的大肠杆菌的atoB基因(GenBank登录号NC_000913REG10N: 2324131..2325315 ;编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶)，为在大肠杆菌中表达经过密码子优化的酿酒酵母的ERG13基因的编码序列(GenBank登录号X96617, REGION: 220..1695 ;编码HMG-CoA合酶)，和为在大肠杆菌中表达经过密码子优化的酿酒酵母的HGMl基因的截短编码序列(GenBank登录号M22002，REGION: 1777..3285 ;编码截短的HMG-CoA还原酶)。将合成地制备的MevT66操纵子克隆进克隆载体(诸如标准的PUC或pACYC起源载体)中，再从它用侧接SfiI和AsiSI限制位点进行PCR扩增，使用SfiI和AsiSI限制性内切核酸酶消化扩增的DNA片段，对包含MevT66操纵子的大约4.2kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段插入pAM36载体的SfiI和AsiSI限制位点中，从而产生表达质粒pAM36-MevT66。
[0217]通过将MevB操纵子插入pBBRlMCS-Ι载体中，制备表达质粒pMevB-Cm。MevB操纵子编码一起将(R)-甲羟戊酸转化成IPP的酶集合，即甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸羧化酶。从酿酒酵母基因组DNA，PCR扩增:ERG12基因的编码序列(GenBank登录号X55875，REGION:580..1911 ;编码甲羟戊酸激酶)、ERG8基因的编码序列(GenBank登录号Z49939，REG10N:3363..4718 ;编码磷酸甲羟戊酸激酶)和MVDl基因的编码序列(GenBank登录号X97557，REGION: 544..1734 ;编码甲羟戊酸焦磷酸羧化酶)。通过选择适当的引物序列，在PCR扩增过程中将ERG12和ERG8编码序列的终止密码子从TAA变成TAG，以引入核糖体结合位点。通过序列重叠延伸(S0E;Ho，等人，1989)，将PCR产物一起剪接进MevB操纵子中。在添加3’ A突出端后，将MevB操纵子连接进TA克隆载体pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。通过用PstI限制性内切核酸酶消化克隆构建体，再次切离MevB操纵子，并对包含MevB操纵子的大约4.2kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段连接进载体pBBRlMCS-Ι的PstI限制位点中(Kovach等人，Gene166 (I): 175-176 (1995))，从而产生表达质粒 pMevB-Cm。
[0218]通过将MBI操纵子插入pBBRlMCS-3载体中，制备表达质粒pMBI。MBI操纵子编码与MevB操纵子相同的酶，以及催化IPP向DMAPP的转化的异戊烯基焦磷酸酶异构酶。通过使用含有在它们的5'末端处的XmaI限制位点的引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增idi基因的编码序列(GenBank登录号AF119715)，制备MBI操纵子。使用XmaI限制性内切核酸酶消化PCR产物，对包含idi编码序列的0.5kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段插入表达质粒pMevB-Cm的XmaI限制位点中，将idi置于MevB操纵子的3丨末端处。然后将MBI操纵子亚克隆进载体pBBRlMCS-3的SalI和SacI限制位点中(Kovach等人，Gene 166 (I): 175-176 (1995))，从而产生表达质粒 pMBI。
[0219]通过将ispA基因插入表达质粒pMBI中，制备表达质粒pMBIS。ispA基因编码法呢基焦磷酸合酶，该酶催化IPP和DMAPP缩合成FPP。使用具有SacII限制位点的正向引物和具有SacI限制位点的反向引物，从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增ispA基因的编码序列(GenBank登录号D00694，REGION: 484..1383)。使用SacII和SacI限制性内切核酸酶消化扩增的PCR产物，对包含ispA编码序列的0.9kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段连接进pMBI的SacII和SacI限制位点中，将ispA编码序列置于idi和MevB操纵子的3’侧，从而产生表达质粒pMBIS。
[0220]通过将MevT66操纵子插入pAM29载体中，制备表达质粒pAM25。通过将pl5A复制起点和得自PZS24-MCS1载体的赋予卡那霉素抗性的基因(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25:1203-1210)与寡核苷酸制备的lacUV5启动子一起装配，制备pAM29载体。使用EcoRI和Hind III限制性内切核酸酶消化包含MevT66操纵子的DNA合成构建体(参见上面关于pAM36-MevT66的描述)，对包含MevT66操纵子的大约4.2kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段连 接进pAM29的EcoRI和HindIII限制位点，从而产生表达质粒pAM250
[0221]通过用mvaA基因的编码序列(其编码金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶)(GenBank登录号BA000017, REGION: 2688925..2687648)替换表达质粒pAM25中的HMGl基因的截短编码序列(其编码截短形式的酿酒酵母HMG-CoA还原酶)，制备表达质粒pAM41。使用包含SpeI限制位点的引物，从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC 70069)基因组DNA中PCR扩增mvaA基因的编码序列，使用SpeI限制性内切核酸酶消化PCR产物，并对包含mvaA编码序列的大约1.3kb DNA片段进行凝胶纯化。使用HindIII限制性内切核酸酶消化表达质粒PAM25，使用T4 DNA聚合酶将末端突出端钝化，使用SpeI限制性内切核酸酶部分地消化线性载体骨架，并对缺少截短的HMGl编码序列的大约4.8kb DNA片段进行凝胶纯化。连接纯化的DNA片段，从而产生表达质粒pAM41。
[0222]通过将MBIS操纵子插入表达质粒pAM36_MevT66中，制备表达质粒pAM43。使用包含5’XhoI限制位点和3’PacI限制位点的引物，从pMBIS PCR扩增MBIS操纵子，使用XhoI和PacI限制性内切核酸酶消化扩增的PCR产物，对包含MBIS操纵子的大约5.4kb DNA片段进行凝胶纯化，并将纯化的DNA片段连接进表达质粒pAM36-MevT66的XhoI PacI限制位点中，从而产生表达质粒PAM43。
[0223]通过将lacUV5启动子插入在表达质粒pAM43的MBIS和MevT66操纵子的前面，制备表达质粒PAM45。从寡核苷酸合成包含编码lacUV5启动子的核苷酸序列的DNA片段，并插入PAM43的AscI SfiI和AsiSI XhoI限制位点中，从而产生表达质粒pAM45。
[0224]通过用mvaS基因的编码序列(其编码金黄色葡萄球菌HMG-CoA合酶)(GenBank登录号BA000017, REGION: 2689180..2690346)替换表达质粒pAM41中ERG13基因的编码序列(其编码酿酒酵母HMG-CoA合酶)，制备表达质粒pAM52。从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC 70069)基因组DNA PCR扩增mvaS基因的编码序列，并根据Geiser等人的方法(BioTechniques 31:88-92(2001))将扩增的DNA片段用作PCR引物来替换pAM41中的HMGl基因的编码序列，从而产生表达质粒PAM52。
[0225]通过用表达质粒pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操纵子替换表达质粒pAM45中的MevT66操纵子，制备表达质粒pAM97。使用AsiSI和SfiI限制性内切核酸酶消化表达质粒pAM45，并对缺乏MevT66操纵子的大约8.3kb DNA片段进行凝胶纯化。使用包含SfiI和AsiSI限制位点的引物PCR扩增pAM52的(atoB(opt):mvaS:mvaA)操纵子，使用SfiI和AsiSI限制性内切核酸酶消化PCR产物，并对包含(atoB(opt):mvaS:mvaA)操纵子的大约3.8kb DNA片段进行凝胶纯化。连接纯化的DNA片段，从而产生表达质粒pAM97。
[0226]通过用mvaKl基因的编码序列(其编码金黄色葡萄球菌甲羟戊酸激酶)(GenBank登录号AAG02424)替换表达质粒pAM97中的ERG12基因的编码序列(其编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶)，制备表达质粒PAM765。金黄色葡萄球菌甲羟戊酸激酶对FPP的反馈抑制不太敏感(Voynova等人.(2004) J.Bacteriol.186:61-67),所以与表达质粒pAM97相比,表达质粒pAM765可以在宿主细胞中造成FPP的更大量产生。从表达质粒PCR扩增mvaKl基因的编码序列，并对大约0.9kb PCR产物进行凝胶纯化。从pAM97 PCR扩增PMK-PMD-1di_ispA操纵子，并对大约4.1kb PCR产物进行凝胶纯化。将纯化的PCR产物连接到一起，并对连接产物进行凝胶纯化。使用XhoI和SacI限制性内切核酸酶消化纯化的连接产物和pAM97，对消化的DNA片段进行凝胶纯化，并连接纯化的DNA片段，从而产生表达质粒pAM765 (SEQ IDNO:1)。
[0227]通过将载体pAM471的P^fERGZCU^u-tHMGR插入片段插入载体pAM466中，制备质粒 PAM489。通过将 DNA 片段 PucrERGZCU^u-tHMGR 插入 Τ0Ρ0 Zero Blunt II 克隆载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)中来制备载体 pAM471，所述 DNA 片段 PGAU(l-ERG20_PGAU-tHMGR包含:酿酒酵母的ERG20基因的编码序列(ERG20核苷酸位置I至1208 ；ATG起始密码子的A是核苷酸I) (ERG20)、含有酿酒酵母的趋异GALl和GALlO启动子的基因组基因座(GAL1核苷酸位置-1至-668) (Pgal)和酿酒酵母的HMGl基因的截短的编码序列(HMG1核苷酸位置 1586 至 3323) (tHMGR)。通过将 DNA 片段 TRPr856 5+548 插入 Τ0Ρ0 TA pCR2.1 克隆载体(Invitrogen, q Carlsbad, CA)中来制备载体 pAM466,所述 DNA 片段 TRPl 856 5+548 包含酿酒酵母的野生型TRPl基因座的一段，该段从核苷酸位置-856延伸至位置548并携带在碱基-226和-225之间的非天然内部XmaI限制位点。通过如表1所描绘的PCR扩增，制备 DNA 片段 PucrERGZiU^u-tHMGR 和 TRP1-856 5+548。为了构建 pAM489，使用 XmaI 限制性酶(New England Biolabs, Ipswich, MA)完全消化 400ng pAM471 和 IOOng pAM466,对与PGAL10-ERG20_PGAL1-tHMGR插入片段相对应的DNA片段和线性化的pAM466载体进行凝胶纯化，并将4摩尔当量的纯化的插入片段与I摩尔当量的纯化的线性化载体连接，从而产生PAM489。图1R 显示了 pAM489 的 TRPlP^crERGZiU^u-tHMGRJ'RP 插入片段的图谱，SEQID NO:2显示了其核苷酸序列。
[0228]
【权利要求】
1.一种试验萜烯合酶变体的提高的体内性能的方法，所述方法包括下述步骤:Ca)将宿主细胞群分成对照群和试验群；(b)在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；(c)在所述试验群中表达试验職烯合酶和所述对比職烯合酶，其中所述试验職烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在所述试验群中和在所述对照群中以类似的水平表达；和(d)在所述试验群中和在所述对照群中测量所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述试验群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比相对于所述对照群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比的增加，将所述试验群鉴别为包含萜烯合酶变体，所述萜烯合酶变体具有比所述对照萜烯合酶提高的体内性能。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是倍半萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是法呢基二磷酸(FPP)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述对比萜烯合酶是曲古二烯合酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和试验萜烯合酶是具有金合欢烯合酶活性的合酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是单萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是香叶基二磷酸(GPP)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞包含MEV途径的一种或多种异源酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEV途径的一种或多种异源酶选自:ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19 和 HMGl。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验萜烯合酶与所述对照萜烯合酶相差1-10个氨基酸。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一萜烯与所述第二萜烯之比是至少1.3。
11.根据权利要求1所述的方法，其中试验萜烯合酶在所述试验群中的表达水平与所述对照萜烯合酶在所述对照群中的表达水平类似。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是相同的，但是在所述对照群和所述试验群中以不同的水平表达。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞群是酵母细胞群。
14.一种包含2个细胞亚群的组合物，所述2个细胞亚群源自共同的宿主细胞群，其中:(a)所述第一亚群包含对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中对比倍半萜合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；(b)所述第二亚群包含试验萜烯合酶和所述对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成所述第一萜烯，且其中所述试验萜烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中在所述第二亚群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比大于在所述第一亚群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。
16.—种鉴别具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体的方法，所述方法包括下述步骤:(a)将表达对照倍半萜合酶的宿主细胞工程改造成包含高水平的FPP，其中与不包含所述高水平的FPP的亲本细胞相比，所述高水平的FPP降低所述宿主细胞的生存力；(b)在所述宿主细胞中表达试验倍半萜合酶而不是对照倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是所述对照倍半萜合酶的变体；和(C)通过与表达所述对照倍半萜合酶的宿主细胞相比表达所述试验倍半萜合酶的宿主细胞的生存力增加，将所述试验倍半萜合酶鉴别为具有与所述对照倍半萜合酶相比提高的体内性能。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)至(c)在至少2个循环中进行，其中每个循环包括步骤(a)至(C)，且其中在第一个循环以后的每个循环的步骤(a)中，所述对照倍半萜合酶是在前一个循环中鉴别出的具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述高水平的FPP是可诱导的。
19.根据权利要求16所述的方法，其中表达所述试验倍半萜合酶而不表达所述对照倍半萜合酶的宿主细胞的生存力是表达所述对照倍半萜合酶的宿主细胞的生存力的至少2倍。
20.根据权利要求16所 述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞包含MEV途径的一种或多种异源酶。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述MEV途径的一种或多种异源酶选自:ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19 和 HMGl。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述宿主细胞包含异源IPP异构酶。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述宿主细胞包含异源FPP合酶。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞生长在琼脂平板上。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述对照倍半萜合酶是金合欢烯合酶。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述试验倍半萜合酶与所述对照倍半萜合酶相差ι-?ο个氨基酸。
29.—种包含2个细胞亚群的组合物，所述2个细胞亚群分自包含高水平的FPP的宿主细胞群，其中:Ca)所述第一亚群包含对照倍半萜合酶，其中与不包含所述高水平的FPP的亲本细胞的生存力相比，所述高水平的FPP降低所述第一亚群的细胞的生存力；和(b)所述第二亚群包含试验倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是所述对照倍半萜合酶的变体。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述第二亚群的细胞的生存力大于所述第一亚群的细胞的生存力。
【文档编号】C12N9/88GK103608454SQ201280011458
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年2月1日 优先权日:2011年2月2日
【发明者】赵立山, 徐岚, P·韦斯特法尔, A·迈恩 申请人:阿迈瑞斯公司