含反式剪接核糖酶及治癌基因的重组腺病毒及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种含作用于癌细胞特异基因的对反式剪接核糖酶(trans-splicing?ribozyme)-HSVtk复合体进行编码的多核苷酸(polynucleotide)及治癌基因的重组腺病毒，作为有效成分含所述重组腺病毒的防癌或治癌医药合成物，以及治癌方法，所述治癌方法包括把所述重组腺病毒或医药合成物投入所需个体的步骤。本发明的重组腺病毒通过作用于癌特异性基因的反式剪接核糖酶，对癌细胞表现选择性，还表现更高的抗癌活性，可以广泛应用于有效的防癌及抗癌治疗。
【专利说明】含反式剪接核糖酶及治癌基因的重组腺病毒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及含反式剪接核糖酶及治癌基因的重组腺病毒及其用途，尤其涉及一种含作用于癌细胞特异基因的对反式剪接核糖酶(trans-splicing ribozyme)-HSVtk复合体进行编码的多核苷酸(polynucleotide)及治癌基因的重组腺病毒，作为有效成分含所述重组腺病毒的防癌或治癌医药合成物，以及治癌方法，所述治癌方法包括把所述重组腺病毒或医药合成物投入所需个体的步骤。
【背景技术】
[0002]癌症是韩国死亡原因排名第一的重大疾病，为了征服癌症，目前为止人类做了很多研究，但还没有完全征服，是难以治疗的病症。癌症治疗方法有传统的手术、化学疗法及放射疗法等，但各种疗法局限性大。因此，目前研究之外的一些治疗方法，其中基因疗法可以说研究得特别多。
[0003]基因治疗(gene therapy)是指针对很难通过普通方法治疗的先天性或后天性基因异常，以基因工学方法进行治疗的方法。具体地，基因治疗为了防治先天或后天基因缺陷、病毒性疾病、癌症或心血管疾病等慢性疾病，向体内投入DNA及RNA等遗传物质，让治疗蛋白表达或抑制特定蛋白表达，对疾病的原因从基因层面解释，可以根治疾病，不仅可以克服疑难杂症，还可望成为替代现有医疗方式的有效手段。
[0004]癌症的基因治疗可再分为诱发人体内免疫反应的免疫学基因疗法及利用基因直接破坏癌细胞或诱导其灭亡的基因疗法。后者来说，把基因搬运到细胞内部并使之表达(expression)的载体(vector)作用非常重要,腺病毒的载体由于基因传达效率高、向未分化细胞传达基因的能力强 、可制造高值效价病毒储藏物的性能，被认为是最有希望的基因治疗载体之一。
[0005]通常使用的基因治疗腺病毒载体放入删除复制必需的一连串基因、启动子(promoter)活性水平高的巨细胞病毒(cytomegalovirus:CMV)或劳氏肉瘤病毒(Roussarcoma virus:RSV)启动子，在生物体内以很高的效率表达治疗目的蛋白。
[0006]然而用于基因治疗的标志基因很多在经常做细胞分裂的普通细胞上也会表达，产生副作用。为了降低这种副作用，目前试图尝试癌细胞特异性治疗(cancer tissuetargeted therapy) (Fukuzawa et al., Cancer Res64:363-369, 2004)。为此代替 CMV 或RSV,考虑使用组织特异性(tissue-specific)启动子,而该方法虽然可以提高特异性但会降低疗效，很难达到实用要求。
[0007]为了解决所述缺点，目前正在研究使用组织特异性启动子以外的因子，开发组织特异性治癌腺病毒，其中代表性的有使用反式剪接核糖酶等的方法。
[0008]所述利用反式剪接核糖酶的组织特异性治癌腺病毒开发相关研究，探明了嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的I组内含子(intron)核糖酶不仅在试验管内执行反式剪接反应，还在人体细胞内执行该反应，连接分别独立存在的两个转转录体，从而受到广泛瞩目。[0009]具体地，以这种I组内含子为基础的反式剪接核糖酶以只在与疾病相关的基因转录体或疾病细胞表达的特定RNA为目标，补正这些，使它们成为正常RNA，或者诱发重编、使它们置换为新的治疗用基因转录体，预计会成为兼具疾病特异性及安全的基因治疗技术。另外，反式剪接核糖酶去除疾病特意RNA的同时，可以诱导出我们需要的治疗用基因产物的表达，可以加大治疗效果。
[0010]特别是，随着最近研究成果发现可捕捉在癌组织起特异性作用的hTERT (humanTelomerase reverse transcriptase)为标志的反式剪接核糖酶,大家利用此开发癌治疗剂的研究越发活跃，但目前为止还没有显著的结果。
[0011]基因疗法中使用的治疗用基因有单纯疱疹病毒(HSV:herpes simplex virus)胸苷激酶(Thymidine kinase)(以下略称为HSVtk),大肠菌胞嘧唳脱氨酶(cytosinedeaminase) (CD)及大肠菌的嘌呤核苷憐酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase)(以下略称为PNP)基因等。利用这些的基因治疗称为基因定向酶前驱体治疗(gene-directedenzyme prodrug therapy,⑶EPT),全部带着使用前驱体的共同点。⑶EPT使用的前驱体为更昔洛韦(ganciclovir)、5_氟二氧嘧唳(5-fluorouracil) (5-FU)及6-甲基嘌呤-2-脱氧核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside) (6-MeP-dR),分别以 HSV-TK、CD 及 PNP 形式使用。没有细胞毒性的前驱体，在引入的基因作用下被转变成对细胞有毒性的药物，主要在磷酸化作用下产生活性。利用自杀基因的基因疗法的优点是，引入这些基因的细胞所激活的药物连邻近细胞也会凋亡，有旁观者效应。这是基因引入效率低时可以采取的最好战略技术。
[0012]这种基因治疗战略中，利用HSVtk的方法相当普遍。具体地HSVtk/GCV体系是自杀基因疗法中最广泛使用的方法之一，由W090/07936、US5，837，510、US5, 861,290、W098/04290、W097/37542及US5，631，236中公开。表达HSVtk基因的细胞可以磷酸化更昔洛韦(GCV)，结果妨碍DNA复制作用，可诱导细胞的凋亡。该方法目前用于人类各种癌症的30多种基因治疗临床试验中。但是，这只会让增殖的细胞凋亡，而旁观者相应并不显著，大量使用时，会引发细胞毒性问题。因此使用两种以上前驱体，征服癌症的相关研究正在进行。
[0013]另外F1D-1 (programmed death-Ι)为55kDa的第I型跨膜蛋白，形成Ig基因的一部分，是属于免疫球蛋白(immunoglobulin)分子群的T细胞辅助阻碍分子。及F1D-1是属于在活化B细胞、T细胞及骨髓细胞中表达的受体⑶28群(比如，包括⑶28、CTLA-4、ICOS及BTLA)的的抑制因子之一。I3D-1的配合基(ligand)有TO-Ll及TO-L2，这些与TO-1结合时向下调节τ细胞的活化。ro-1在正常状态下T细胞上不表达，在所述细胞活化时表达会增加。另外，PD-Ll发现于大多数人类癌中，PD-1与I3D-Ll之间的相互作用，向T细胞传达刺激或抑制信号。及ro-1与ro-Li的相互作用下，肿瘤的侵袭性淋巴球降低，τ细胞受体介导增殖会降低，癌细胞会产生免疫豁免现象。从而，目前正在进行通过切断ro-1或ro-Li的信号传达，有效诱导抗癌免疫反应，治疗癌症的研究。
【发明内容】
[0014]发明的课题
[0015]本发明的各发明人为了开发同时提高组织特异性和治疗效能的治癌基因治疗方案，努力研究的结果，发现含癌组织特异性对反式剪接核糖酶HSVtk (Herpes SimplexVirus Thymidine Kinase)复合体进行编码的多核苷酸及治癌基因sPD_l基因的重组腺病毒对癌组织有优秀治疗效果，还可以显著降低基因治疗带来的副作用，完成了本发明。
[0016]实施方案
[0017]本发明的目的在于提供一种含作用于癌特异性基因的对反式剪接核糖酶-HSVtk复合体进行编码的多核苷酸及治癌基因的重组腺病毒。
[0018]本发明的另一目的为提供一种作为有效成分含所述重组腺病毒的的防治癌症的治疗用药学合成物。
[0019]本发明的又一目的为提供一种包括把所述重组腺病毒或药学合成物投入到需治疗个体的步骤的除人类之外的治疗动物癌的方法。
[0020]发明效果
[0021]由于重组腺病毒含作用于癌特异性基因的反式剪接核糖酶，对癌细胞表现选择性，而且含治癌基因，表现较高的抗癌活性，可以有效防治癌症。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为以老鼠TERT为标志的反式剪接核糖酶(mTERT-TR)-HSVtk概略示意图。老鼠TERT(mTERT)转录物的标志部位以剪接部位周围的序列表示。反式剪接核糖酶利用抗转录(antisense) mTERT RNA 序列，特异认知 mTERT RNA,在 IGS( internal-guided-sequence)的3’末端，切断mTERT RNA。反式剪接核糖酶的HSVtk编码RNA部分的5’末端，连接在mTERT RNA切断的末端。mTERT标志mRNA及核糖酶之间的有可能的碱基结合通过竖线表示。
[0023]图2为老鼠TERT-TR的腺病毒HSVtk基因表达调节效果示意图。(a)表示缺乏El/E3的腺病毒Ad5mTR在老鼠的TERT-TR调节下让HSVtk表达的结果示意图。Ad5M0CK是缺乏E1/E3的腺病毒的对比群。(b)是把CT26细胞(3X IO3)接种于96-孔板后，以100 μ M GCV条件下，暴露在多种MOI的Ad5M0CK或Ad5mTR的结果示意图。使用细胞增殖分析工具检测的感染3天细胞毒性结果示意图。资料为分三次进行的分析实验平均土标准偏差结果值。(c)向 BALB/c 老鼠注射 5 X IO8PFU 的 Ad5M0CK 或 Ad5mTR 后，每天腹腔注射 GCV (75mg/kg)两次，在其两侧面皮下接种CT26细胞(IX IO6)的结果示意图。资料以平均土SEM (n=5)表
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[0024]图3为通过HSVtk诱导，效果得到提高的DC-介导性(mediated)抗原提呈(Antigen presenting)效果示意图。(a)向C57/BL6老鼠的E.G7肿瘤注射Ad5M0CK或Ad5mTR。四天后收取肿瘤，通过H&E染色，进行组织学分析。(b)注射腺病毒2日后，通过使用抗-⑶IIc微珠的MACS色层分析(chromatography),从E.G7肿瘤周围的吸收性淋巴结收取DCs (5X IO4)后，通过OT-1形质转换老鼠共同培养OVA特异性⑶8T细胞。在72小时候，收取培养上层液，检测了 IFN- Y量。DC-Ad5M0CK表示从注射Ad5M0CK的老鼠收取的DCs，⑶-Ad5mTR表示从注射Ad5mTR的老鼠获取的DCs。资料以平均值土标准偏差值表示。
[0025]图4为让mTERT-TR-调节性HSVtk及sH)l-1g表达的双重-模块腺病毒制造方法示意图。(a)Ad5mTR.sPDl在El领域的CMV启动子调节下对mTERT-TR-HSVtk进行编码，在E3领域的EFla启动子调节下对sPDl_Ig进行编码。(b)向HEK293细胞(4X IO5)感染48小时2M0I腺病毒，使用RIPA缓冲液进行破碎后，进行免疫印迹(Immunoblot)分析。通过Ad5mTR.sPDl (每道蛋白80 μ g)进行的sPDl_Ig表达，使用抗-PDl抗体确认。(c)磷酸化GCV中HSVtk酶活性通过检测以放射性同位素标记的PCV (I μ Ci/ml)的累积量，通过CT26细胞评价。资料对3次分析实验结果以平均土标准偏差值表示。(d)从感染IOMOI腺细胞的细胞收取培养上层液，向其混合从OT-1老鼠提纯的OVA-特异性⑶8T细胞(I X IO6)及1^38/0￥4细胞(1父104)共同培养物。在72小时候收取培养上层液，检测了 IFN-Y水平。资料以平均土标准偏差值表示。[0026]图5是在老鼠CT26大肠癌细胞表面，表达I3D-Ll的示意图。a.总RNA由各细胞制造，PD-Ll转录体通过RT-PCR检测。把肝癌细胞(Ifepa-1)作为对比群使用，进行分析。b.通过流式细胞术分析了各细胞表面的ro-Li蛋白。
[0027]图6为Ad5mTR.sPDl的生物体外及生物体内抗-肿瘤活性示意图。(a)与100 μ MGCV—起，以多种MOI的Ad5M0CK，Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl感染CT26细胞。3日后，以图1d方法检测了细胞毒性。资料对3次分析实验结果以平均土标准偏差值表示。(b)在BALB/c老鼠的两边，皮下接种CT26细胞(I X IO6)。对所述肿瘤，以5 X IO8PFUDE Ad5M0CK、Ad5EFl α.sPDl、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl处理。每天腹腔注射2次GCV (75mg/kg)。肿瘤皮肤在指定的时间检测并表示。资料以平均土SEM (n=10)表示。
[0028]图7表示sPDl-1g依存肿瘤成长抑制由CD8T细胞介导。(a)向BALB/c老鼠的皮下CT26肿瘤注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl (左侧板)。sPDl-1g的抗-肿瘤活性中，为了决定⑶8T细胞相关性，想C57/BL6老鼠的皮下CT26肿瘤注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl(右侧板)。处理病毒2日前及处理后的每5日，向老鼠静脉注射2.43 α抗-⑶8抗体(50(^8)，枯竭0081'细胞(右侧板)。箭头表示抗体注射时间。肿瘤皮肤在指定的时间测试并表示。(b)2.43a抗-CD8抗体存在或不存在时，对肿瘤抑制情况，在第12日以对Ad5M0CK的相对值进行计算。资料以平均土 SEM表示。
[0029]图8为缺乏T及B细胞的Ragl-/-老鼠中sPDl_Ig肿瘤增殖抑制效果示意图。Ca)向 C57/BL6 皮下注射的 E.G7 肿瘤，注射 Ad5M0CK、Ad5mTR 或 Ad5mTR.sPDl (左侧板)。sPDl-1g的抗-肿瘤活性中，为了检测淋巴球相关性，向Ragl-/-老鼠皮下注射的E.G7肿瘤，注射Ad5M0CK、Ad5mTR或Ad5mTR.sPDl (右侧板)。肿瘤的成长按指定的时间计算并表示。(b) Ragl-/-老鼠或野生型老鼠的肿瘤成长调节，在第12日相对于Ad5M0CK进行相对计算。(c)对 Ragl-/-老鼠的 E.G7 肿瘤(I X IO6 细胞)，以 5 X IO8PFU 的 Ad5M0CK、Ad5mTR、Ad5mTR.sPDl，每隔7日注射并注射2次。向OT-1老鼠最初进行腺病毒注射时同时静脉注射⑶8T细胞(1X104)。肿瘤的成长按指定时间计算并表示。资料以平均土SEM (n=6)表示。(d)为了进行免疫细胞的生物体外分析，把Ragl-/-老鼠的E.G7肿瘤与来自OT-1老鼠的CD8T细胞及适当的腺病毒共同培养。最初注射腺病毒8日后，从老鼠的眼球静脉收取PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)。通过流式细胞分析，从整体生存细胞算出0T-1CD8T细胞数，算出了 TCR Va2+，νβ+，Τ细胞(0T-1细胞)的比例。
[0030]图9为通过Ad5mTR.sPDl处理时的2次肿瘤抑制效果示意图。(a)把CT26肿瘤皮下移植到BALB/c老鼠，每隔3日注射I次，共3次注射5 X IO8PFU的Ad5mTR.sPDl0最初处理2周后，在想反侧接种I X IO6个肿瘤细胞。最初注射病毒I周后，开始腹腔注射GCV (75mg/kg)，注射共12日。每三天检测一次肿瘤大小。(b)向C57/BL6老鼠皮下移植E.G7肿瘤肿瘤，执行与所述(a)相同的方法。(c)接种2次肿瘤7日后，以事先用Ad5mTR.sPDl处理的老鼠和未处理的老鼠，检测了接种部位肿瘤大小。资料以平均土标准偏差值表示。
【具体实施方式】
[0031]为了达到上述目的，本发明提供一种重组腺病毒，包括作用于癌特异性基因TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA (序列号 I)的对反式剪接核糖酶-HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)复合体进行编码的多核苷酸及治癌基因。
[0032]本发明的单词“癌特异性基因”是指只有癌细胞特异表达或显著过表达的基因。所述癌特异性基因形成让本发明的核糖酶对癌特异反应的基础。这种癌特异性基因包括但不限于 TERT (Telomerase reverse transcriptase)的 mRNA、AFP(alphafetoprotein)mRNA、CEA(carcinoembryonic antigen)mRNA、PSA (Prostate-specific antigen)mRNA、或CKAP2(Cytoskeleton-associated protein2) mRNA 等。 [0033]本发明的单词“TERT(Telomerase reverse transcriptase)”是调节癌细胞的永续性(immortality)及增殖(proliferation)能力的最重要的酶之一,在染色体上形成端粒(telomere)结构,通过保护染色体末端、抑制细胞的老化。正常细胞的机理来看，分裂时端粒的长度逐渐变短，最终遗传物质损失，细胞死亡。而癌细胞由于该酶让端粒持续延长，直接作用于癌细胞的不灭性，是治癌的重大障碍因素。这种端粒酶(telomerase)在无限复制的生殖细胞、造血细胞及癌细胞中，有80至90%有端粒酶活性，而癌细胞周围的正常细胞不具有这种活性。从本发明的目的来看，所述TERT可以作为本发明提供的治癌基因直接标志使用，但不受限于此。
[0034]本发明的单词“核糖酶”是指表现反式剪接活性及自我剪接(self-splicing)活性的具有酶活性的RNA分子。本发明的目的来看，所述核糖酶通过反式剪接反应，阻碍癌特异性基因的活性，最终不仅可以表现出选择性的抗癌效果，还可以以与治癌基因结合的形式表达，活化治癌基因，只要可以让癌特异性基因失活、让治癌基因得到激活的话，可以使用任何形式。最好是使用认知对癌症有特异性的TERT (Telomerase reversetranscriptase)的mRNA,反式剪接能力得到验证的hTERT标志反式剪接I组核糖酶Rib67核糖酶或由具有序列号2的碱基序列的多核苷酸编码的核糖酶，但不限于此。
[0035]本发明的单词“HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)” 是指来自单纯疱疫病毒(HSV:herpes simplex virus)的胸苷激酶(thymidine kinase)。该酶把没有毒性的前驱体转变成毒性物质，让吸入该基因的细胞凋亡，是典型的药敏化基因(drug-sensitizing gene)之一。本发明的目的来说,所述HSVtk基因可以与核糖酶结合的形式表达，作为表现抗癌活性的治癌基因。这种HSVtk基因最好是具有以序列号3表示的碱基序列，可以是但不限于基因库(genbank)注册号AAP13943、P03176、AAA45811、P04407、Q9QNF7、KIBET3、P17402、P06478、P06479、AAB30917、P08333、BAB84107、AAP13885、AAL73990、AAG40842、BABl 1942、NP_044624、NP_044492、CAB06747 等记载的。
[0036]本发明的单词“治癌基因(ant1-cancer therapeutic gene)”是指对多肽(polypeptide)进行编码的多核苷酸(polynucleotide)序列,所述多肽在癌细胞内表达时表现治疗效果。本发明中，所述治癌基因以与所述核糖酶结合的形式表达或独立表达，表现抗癌活性。本发明的目的来看，所述治癌基因包括但不限于药敏化基因、抑制细胞增殖基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制因子基因、抗原性基因、细胞因子基因、抗血管生成基因等。本发明中，可以单独使用或组合两种以上使用所述治癌基因。
[0037]本发明的“药敏化基因(drug-sensitizing gene) ”是指把没有毒性的前驱体(prodrug)转换成毒性物质的酶相关基因，由于吸入基因的细胞会死亡，又称自杀基因(suicide gene)。即，把在正常细胞中没有毒性的前驱体投入全身时，前驱体只在癌细胞中转变成毒性代谢产物(toxic metabolite),改变对药剂的敏感性，破坏癌细胞。本发明的目的来看，所述药敏化基因包括但不限于HSVtk(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase)基因、更昔洛韦(ganciclovir)、大肠菌的胞嘧唳脱氨酶(cytosine deaminase,⑶)基因、5-氟胞嘧唳(5-fluorocytosine, 5-FC)等。
[0038]本发明的单词“细胞凋亡基因(proapoptotic gene)”是指表达后诱导程序化细胞凋亡的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述细胞凋亡基因包括但不限于P53、腺病毒E3-11.6k (来自Ad2及Ad5)或腺病毒E3-10.5k (来自Ad)、腺病毒E4基因、p53路径基因、编码胱天蛋白酶(Caspase)的基因等。
[0039]本发明的单词“细胞增殖抑制基因(cytostatic gene)”是指在细胞内表达，在细胞周期中间停止细胞周期的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述细胞增殖抑制基因包括但不限于p21、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)基因、E2F-Rb结合蛋白基因、对循环-从属性激酶(kinase)抑制因子进行编码的基因(比如、pl6、pl5、pl8及pl9)、停止生长特异性同源框(growth arrest specific homeobox, GAX)基因。
[0040]本发明的单词“细胞毒性基因(Cytotoxic gene)”是指在细胞内表达，表现毒性效果的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述细胞毒性基因包括但不限于对假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)进行编码的核苷酸序列等。
[0041]本发明的单词“肿瘤抑制因子基因(tumor suppressor gene)”是指在细胞内表达，可抑制肿瘤表现型或可诱导细胞凋亡的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述肿瘤抑制因子包括但不限于肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor- α , TNF- α )、ρ53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、视网膜母细胞瘤基因、MMAC-1基因、腺瘤息肉病线圈蛋白质(adenomatous polyposis coil protein)、缺损的结肠肿瘤(DCC)基因、丽SC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3的鼻咽喉肿瘤抑制基因、MTSl基因、CDK4 基因、NF-1 基因、NF-2 基因、VHL 基因、sPD-1 (soluble programmed death-1)等。
[0042]本发明的单词“sFOl (soluble programmed death-1)”是指属于免疫球蛋白(immunoglobulin)分子群的作为T细胞辅助阻碍分子(coinhibitory molecule)广为认知的55kDa的第I型跨膜蛋白F1D-1 (programmed death-1)的细胞外区域。通常F1D-1与PD-Ll之间的相互作用下，肿瘤侵袭性淋巴球减少，T细胞受体介导增殖降低，癌细胞出现免疫豁免现象。但据最近的研究报告，PD-1的游离态sPDl与ro-1及ro-Li相互作用，抑制免疫豁免现象，可以有效诱导抗癌免疫反应。本发明的目的来看，所述sro1-1g基因可在本发明的核糖酶反式剪接活性作用下，与癌特异性基因结合，作为癌细胞的治疗基因使用，最好是但不限于具有以序列号4表示的碱基序列。
[0043]本发明的单词“抗原性基因(antigenic gene)”是指在目标细胞内表达，生产可让免疫体系认知的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述抗原性基因包括但不限于癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、p53 等。[0044]本发明的单词“细胞因子基因(cytokine gene)”是指在细胞内表达，生成细胞因子的核苷酸序列。本发明的目的来看，所述细胞因子基因包括但不限于GM-CSF、白介素(interleukin) (IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20)、干扰素 α、β、Y (interferon a -2b)、干扰素 α -2 α -1 等融合体。
[0045]本发明的单词“抗血管生成基因(ant1-angiogenic gene) ”是指通过表达把抗-血管生成因子释放到细胞外的核苷酸序列。本发明的目的来看，抗血管生成基因包括但不限于血管稳定因子(Angiostatin)、血管内皮生长因子(VEGF)的抑制因子、内皮他丁(Endostatin)等。
[0046]本发明的单词“腺病毒”与腺病毒载体有相同的含义，是指属于腺病毒科(adenoviridae)的病毒。所述腺病毒科包括哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属所有动物性腺病毒。特别是人类腺病毒有A-F亚属(subgenera)及其各个血清型，A-F亚属包括但不限于人类的腺病毒第I型、第2型、第3型、第4型、第4a型、第5型、第6型、第7型、第8型、第9型、第10型、第11型(AdllA及AdllP)、第12型、第13型、第14型、第15型、第16型、第17型、第18型、第19型、第19a型、第20型、第21型、第22型、第23型、第24型、第25型、第26型、第27型、第28型、第29型、第30型、第31型、第32型、第33型、第34型、第34a型、第35型、第35p型、第36型、第37型、第38型、第39型、第40型、第41型、第42型、第43型、第44型、第45型、第46型、第47型、第48型、第91型。
[0047]作为本发明的另一实施形态，本发明提供一种作为有效成分含所述腺病毒的防治癌症药学合成物。
[0048]本发明提供的所述重组腺病毒包括作用于癌特异性基因TERT的对反式剪接核糖酶-HSVtk复合体进行编码的多核苷酸及治癌基因，当把TERT投入到可以表达的癌细胞时，在TERT的作用下，HSVtk从反式剪接核糖酶-HSVtk复合体解离，解离的HSVtk不仅会呈现细胞毒性，还可以在癌治疗基因的作用下，诱导对免疫细胞的攻击，执行癌治疗剂的作用。与此相反，TERT投入到不表达的正常细胞时，HSVtk不会从反式剪接核糖酶-HSVtk解离，不表现细胞毒性。因此本发明的重组腺病毒对癌细胞表现优秀的选择性，可以用于更加安全的癌症治疗。
[0049]本发明的单词“癌”是指细胞的正常分裂、分化及凋亡的调节功能发生问题，非正常过多增殖，侵袭周围的组织及脏器，形成块，破坏或变形原有结构的细胞或组织，包括但不限于胰腺癌、乳房癌、前例腺癌、脑肿瘤、头颈部癌肿、黑瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、结肠癌、骨癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食道癌、小肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌肿、子宫颈部癌肿、阴道癌、阴门癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾骨盆癌及中枢神经系肿瘤。
[0050]本发明的单词“预防”是指通过投入办发明的重组腺病毒或合成物，抑制或延迟癌症发病的一切行为。
[0051]本发明的单词“治疗”是指通过投入重组腺病毒或合成物，让癌症好转或使之向有利方向转变的一切行为。
[0052]另外，本发明的治疗或预防癌症的药学合成物可以追加包括可在药学层面使用的载体、赋形剂或稀释剂。
[0053]本发明的药学合成`物包括的可在药学层面使用的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、赤藓糖醇(Erythritol)、麦芽糖醇(Maltitol)、淀粉、阿拉伯树胶(acacia gum)、藻酸盐(Alginat)、明胶(gelatin)、憐酸钙(Calcium Phosphate)、娃酸钙(calcium silicate)、碳酸?丐(Calcium Carbonate)、纤维素(cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、聚乙烯吡咯烧酮(polyvinyl pyrrolidone)、水、轻苯甲酯(methyl hydroxybenzoate)、轻苯丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸续(magnesium stearate)、矿物油。
[0054]本发明的药学合成物可以按通常的方法以散剂、颗粒剂、片齐?、胶囊齐?、悬浊液、乳齐?、糖浆、气凝胶形式，制造成口服剂、外敷剂、坐药、及灭菌注射溶液使用。制剂化时，通常使用填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等稀释剂或赋形剂制造。口服用固态制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固态制剂可以向所述从姜黄或郁金萃取物，从其分离的芳樟醇(Iinalool)化合物或其可在药学层面使用的盐，混合至少一种以上赋形剂，比如、淀粉、碳酸1丐(Calcium Carbonate)、鹿糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明胶制造。除了单纯的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁(magnesium stearate)、滑石等润滑剂。口服用液态制剂包括悬浊液、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了可以包括通常使用的单纯
稀释剂-/K、液状石腊(liquid paraffin)外,还可使用各种赋形剂，比如、湿润剂、甘甜
剂、芳香基、保存剂等。非口服制剂包括灭菌水溶液、非水性溶剂、悬着剂、乳剂、冻结干燥制剂、做药。非水性溶剂、悬池液可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙基乙二醇(Polyethyl glycol)、橄榄油(olive oil)等植物油，油酸乙酯(ethyl oleate)等可注射的酯(ester)等。作为坐药(suppository)的基剂可以使用威特普索(音)(Witepsol)、聚乙二醇(Macrogol)Ji^jiIi (tween) 61、可可脂(cocoa butter)、亮叶肉实(Iaurinum)、甘油胶冻(glycerogelatin)等。
[0055]作为本发明的另一实施形式，本发明提供一种癌症治疗方法，其包括把含所述重组腺病毒或药学合成物，以药学层面有效的量，投入到需要治疗的个体的步骤。
[0056]本发明的单词“药学层面有效的量”是指可在医学治疗层面适用的合理受惠/危险比例，可充分治疗疾病的量，有效用量水平可以按患者的性别、年龄、疾病的种类、症状轻重、药物的活性、对药物的敏感程度、投入时间、投入路径及排出比例、治疗期间、同时使用的其他药物，结合其他医学领域公知的因素决定。本发明的药学合成物可单独使用或者与其他治疗剂并用投入，即可与现有的治疗剂前后分别投入、也可同时投入。另外，本发明的药学合成物可通过单一的方式或多种方式投入。重要的是考虑上面的所有因素，避免副作用，以最少的量获得最大效果，可以由本行业人员容易决定。具体地，本发明的合成物口服或静脉注射为宜。
[0057]本发明的单词“投入”是指，通过某种适当方法，向动物体内输入特定物质，本发明的治疗合成物的投入路径，可以采用能够到达目的组织的任何普通路径，做经口投入或非经口投入。另外，本发明的治疗合成物，可通过能让其有效成分到达目标细胞的任意装置投入。
[0058]本发明 的治疗合成物的最佳投入量按患者的状态及体重、疾病程度、药物形式、投入路径及期间有所不同，可由本行业人员适当选择。为了获得最佳效果，本发明的药学合成物每天以I至10mg/kg投入为好，最好是以I至5mg/kg投入为宜。投入次数方面，即可以每天投入一次、也可以每天分数次投入。
[0059]本发明的治疗合成物即可以单独使用，也可以与外科手术疗法等辅助治疗方法并用。可以与本发明的合成物一起使用的化学治疗剂(chemotherapeutic agent)包括但不限于钼化合物(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、甲基节肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环憐酸胺(cyclophosphamide)、异环憐酸胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、碧苏尔蕃(音)(bisulfan)、亚硝基服(nitrosourea)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普利考麻星(音)(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、丝裂霉素(tamoxifen)、紫杉酌.(taxol)、反式钼(trans platinum)、5_ 氟二氧嘧唳(5_fIuorouracil)、长春新碱(vincristin)、长春花碱(vinblastin)、甲氨蝶呤(methotrexate)。另外,可与本发明的合成物一起使用的放射疗法包括但不限于X射线疗法及Y射线疗法。
[0060]本发明的一实施例中，为了让辨认并切断人类TERT (hTERT)的核糖酶与HSVtkmRNA连接，hTERT mRNA的3’末端发生切断，本发明的各发明人设计反式剪接核糖酶(图1)，并为了通过老鼠确认所述反式剪接核糖酶效果，设计了使用以老鼠的TERT mRNA(mTERT-TR)为目标的反式剪接核糖酶的类似体系，把此插入到缺乏E1/E3的腺病毒基因组，制作了含mTERT-TR-调节性HSVtk(mTERT-TR-HSVtk)的腺病毒(Ad5mTR)(图2)，用词感染来自BALB/c老鼠的大肠癌细胞株CT26细胞株的结果，以2.5M0I感染时，可以坏死大部分细胞(图2b)，在体外环境下，与细胞毒性类似，向BALB/c老鼠皮下CT26肿瘤注射Ad5mTR时，肿瘤的生长明显得到抑制(图2c)。另外，本发明的发明人测试同系列B6老鼠皮下注射E.G7肿瘤，确认Ad5mTR细胞凋亡能力的结果，感染病毒后肿瘤抗原被释放(图3a)，来自以Ad5mTR处理的老鼠的D Cs以充分水平提供OVA抗原，刺激OVA特异性T细胞。(图3b)
[0061]另外，本发明的各发明人制作包括腺病毒基因组EI领域中被mTERT-TR调节的HSVtk及位于E3领域的sPDl-1g的双重-模块腺病毒(Ad5mTR.sPDl)(图4a)，对其活性做了测试。其结果，反应于肿瘤细胞的攻击，在含sPDl-1g的上层液作用下，由抗原-特异性T细胞分泌IFN Y得到提高(图4d)。同时，通过流式细胞术，测试出肿瘤细胞表面的I3D-Ll发生表达(图5)。另外，以Ad5mTR.sPDl感染的CT26细胞显示与以Ad5mTR感染的情况类似水平的生物体外细胞毒性(图6a)，Ad5mTR.sPDl与Ad5mTR比较明显促进了肿瘤衰退，实际上发生几乎完全的肿瘤衰退(图6b)。正如本发明预计，HSVtk在DCs作用下促进了抗原-特异性⑶8T细胞反应(图3b)，sHH-1g在细胞外促进了抗-肿瘤⑶8T细胞反应性(图4d)。
[0062]这种由双重-模块Ad5mTR.sPDl提高的肿瘤生长抑制效果在⑶8T细胞枯竭的老鼠中，几乎完全消失(图7a)，对抗-肿瘤活性产生影响的⑶8的枯竭，相对于Ad5mTR，在Ad5mTR.sPDl中效果更加明显(1.9倍对4.76倍)(图7b)，在CT26模型中，相对于Ad5mTR,对Ad5mTR.sPDl呈现更强的效果(1.61倍对6.58倍)(图8b)，向携带E.G7的Ragl-/-老鼠静脉注射的OT-1 T细胞作用下，产生抗原-特异性T细胞反应时，投入腺病毒时的所述抗-肿瘤效果恢复，所述效果相对于投入Ad5mTR，在投入Ad5mTR.sPDl时大幅增加(图8d)。
[0063]对这种腺病毒 效果，在生物体内做了确认。其结果，投入Ad5mTR.sPDl的老鼠第一次肿瘤以最小规模增殖，没有生长2次肿瘤(图9a及9c)，在含E.G7肿瘤模型的B6老鼠身上也看到了同样的结果(图％及9c)。[0064]本发明的重组腺病毒的效果通过老鼠得到了确认，但是诱发所述腺病毒效果的TERT不仅在老鼠体内表达，而且还会在人类的肿瘤表达。因此本发明提供的重组腺病毒可以用于人类的癌症治疗。
[0065]发明的实施形式
[0066]下面，为了更好地理解本发明，提示最佳实施例。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
_7] 实施例1:材料及方法
[0068]实施例1-1:细朐及老鼠
[0069]所有细胞通过含10%FBS (fetal bovine serum)与 l%penicillin/streptomycin的RPMI培养基培养。6周龄雌性BALB/c老鼠及C57/BL6老鼠从SLC(Japan)采购。OT-1老鼠(B6background)及 Ragl-/-老鼠(B6background)从 Jackson laboratory 米购。所有动物实验遵守了韩国国立癌中心(National Cancer Center, Korea)的实验动物使用与管理相关规定(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)。
[0070]实施例1-2:腺病毒的制作
[0071]为了在CMV启动子的调解下，生成含老鼠的TERT-TR-HSVtk基因的Ad5mTR，使用了 AdenoZAPTM 及 AdenoQuickTM 体系。Pavq-CMViTERT ASlOORib (+67)TK 中，处理 SpeI/SacII，获得了包括CMV.mTR.HSVtk的DNA片段，把所述片段插入pZAPl.1的Spel/EcoRV切断部位，制作了 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk0 把 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk 以 Pacl/Dralll 切断，连接在RightZAPl.2后，引入到HEK293细胞。为了制作sPDl_Ig，通过使用下述处理剂(primer)的PCR方法增幅了 F1D-1的细胞外区域。
[0072]正方向处理剂:5’-CCGCTC GAG CTC ACC ATG TGG GTC CGG CAG GTA CCC TGG-3’(序列号5)
[0073]反方向处理剂:5’AGATCT TCC TCC TCC TCC TTG AAA CCG GCC TTC TGG TTTGGG-3’ (序列号6)
[0074]把所述增幅产物插入pFUSE-migG2A.Fcl 载体(Invitrogen, San Diego, CA)的 XhoI/BgHI 左位，制作 7 pFUSE-migG2A.Fcl.EFl.sPD_l。把来自 pFUSE_migG2A.Fcl.EFl.sPDl-1g 的 EFl.sPDl-1g 插入到载体(0D260)的 EcoRI/Swal 左位，只做了pE3.1.EFl.sPDl-1g。把 pZAPl.1.CMV.mTR.HSVtk 的 CMV.mTR.HSVtk 片段插入 pEl.2 载体(0D260)的 BamHI/Spel 左位，制作了 pEl.2.CMV.mTR.HSVtk0 为了制作 Ad5mTR.sPDl,把 pEl.2.CMV.mTR.HSVtk 和 pE3.1.EFl.sPDl-1g 通过限制酶 Dralll/PflMI 进行切断，连接到 AdenoQuickl3.1 后，引入到 HEK293 细胞。为了制作 Ad5EFl.sPDl,以与 Ad5mTR.sPDl相同的方式，以限制酶Dralll/PflMI切断ρΕ3.1.EFl.sPDl-1g和pE1.2载体后，连接在AdenoQuickl3.1，引入到 HEK293 细胞。
[0075]实施例1-3:细胞外环境中的GCV吸收剂细胞毒性分析
[0076]HSVtk酶活性，通过检测细胞中磷酸化的GCV累积量，做了估算。细胞增殖分析(cell proliferation assay,Dojindo Laboratories,Rockville,MD),通过标准方法，以平价腺病毒细胞毒性的方式执行`。概括的话，把细胞(3X 103)接种到96-孔板，在37°C条件下培养一天晚上。向培养的细胞感染多种MOI (multiplicity of infection)的腺病毒。I日后，添加GCV，使最终浓度达到200μΜ，在3日间检测了细胞增殖。所有测试反复进行了3次。
[0077]实施例1-4杭体及施药
[0078]为了确认Ad5CMV.mTR.sPDl 的 sPDl-1g 蛋白质表达情况，向 HEK293 细胞(4X 105)感染了 2M0I的腺病毒。感染24小时后的时间点上，对培养上层液和细胞残留物(80 μ g)，利用抗-Pdcd-1 抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA),以免疫印迹方式进行了分析。为了让⑶8T细胞凋亡，在感染腺病毒2日之前腹腔注射500 μ g2.43 α抗-⑶8抗体,之后的15天内，每5天进行腹腔注射。
[0079]实施例1-5 =IFN Y生产暈分析所需CD8T细胞/DC共同培养分析
[0080]把来自吸收性淋巴结的DCs (DLN-DCs),使用17.5%Nycodenze gradient增幅，通过使用抗-⑶IIc微珠(Micenyi Biotec, Auburn, CA)的MACS分析柱进行提纯。使用抗-⑶8微珠，分离了来自OT-1老鼠的纯粹⑶8T细胞。把DLN-DCs(5X IO4)与⑶8T细胞(I X IO5)，在96-孔板培养72小时。72小时后，收取上层液，以ELISA (eBioscience, San Diego7CA)检测了 IFNy含量。
[0081]实施例1-6:细胞外环境0T-1T细胞活化分析
[0082]通过6-孔板培养了稳定表达卵清蛋白(ovalbumin) (OVA)的老鼠大肠癌细胞
MC38, B6background)-MC38/0VA细胞。从24小时感染10M0I腺病毒的HEK293培养上
层液，收取 sPDl-1g 后 ，加 0T-1CD8T 淋巴球(I X 106)的 MC38/0VA 细胞(I X 104)，培养了 72小时。把来自0T-1老鼠纯粹CD8+T淋巴球，通过上述方法，使用MACS分析柱进行分离。⑶8T淋巴球生产的IFNy生成量，通过老鼠IFN Y CBA assay工具(BD bioscience, San Jose,CA)，做了检测。
[0083]实施例1-7:牛物体内动物研究及牛物体外分析
[0084]向6周龄雌性BALB/c老鼠皮下接种IX IO6个CT26细胞。检测到肿瘤时(经过7天)，向肿瘤内注射5X IO8PFU腺病毒，每日注射两侧GCV(75mg/kg)、共14日。间隔7天，投入2次腺病毒。肿瘤体积通过如下公式计算。
[0085]长度X 宽度 2 X 0.5236
[0086]在⑶8T细胞凋亡试验中执行皮下肿瘤形成与病毒注射所需类似过程。把E.G7细胞(C57/BL6backgound ; I X IO6)向Ragl-/-老鼠或C57/BL6老鼠注射，以上述方法处理腺病毒和GCV。为了执行生物体外分析，向Ragl-/-老鼠老鼠的E.G7肿瘤，以从0T-1老鼠分离的⑶8T细胞的静脉投入方法，处理了 Ad5mTR.sPDl。感染刚经过8日时，从血液收取PBMCs(peripheral blood mononuclear cells),执行流式细胞术。
[0087]实施例2:结果
[0088]实施例2-1:含老鼠TERT-TR-HSVtk的腺病毒的制作
[0089]本发明的各发明人使用肿瘤标记TERT，利用肿瘤特异性腺病毒，开发了新HSVtk表达策略。在所述策略中，把认知人类TERT (hTERT)并切断的核糖酶，利用重组腺病毒传达到肿瘤细胞。另外，所述核糖酶与HSVtk mRNA连接，在hTERT mRNA的3’末端切断，这引发了肿瘤细胞中的HSVtk mRNA的新毒性。这种核糖酶定义为反式剪接核糖酶(图1)。理论上，通过反式剪接核糖酶调节的HSVtk的表达，只局限于包括肿瘤细胞在内的以较高水平表达hTERT mRNA的细胞。从而，这种体系不影响以较低水平表达hTERT的周围正常组织的细胞，可向肿瘤细胞有效传达HSVtk。实际上，这种策略在异体移植老鼠模型中，对移植的人类大肠癌细胞表现出较高效果。免疫学层面分析时，这种体系的一个问题是利用人类肿瘤细胞的试验，在异体移植条件下，排斥反应被抑制的老鼠体内执行。从而，这种体系不适合准确评价HSVtk对抗-肿瘤免疫化的效果。为了解决这种局限性，本发明的各发明人设计出使用以老鼠TERT mRNA (mTERT-TR)为目标的反式剪接核糖酶的类似系统，使用同系列老鼠肿瘤模型，评价了 TERT-TR-调节的HSVtk的免疫学层面效果。所述TERT辨认序列位于HSVtk编码序列附近，HSVtk的表达依存于mTERT转录体的存在(图1)。把被CMV启动子调节的这种整体型表达框，插入到缺乏E1/E3的腺病毒基因组内，制造了含mTERT-TR-调节性HSVtk (mTERT-TR-HSVtk)的腺病毒(Ad5mTR)(图 2a)。
[0090]另外，作为对比群，制造了除去所述表达框的腺病毒(Ad5M0CK)。为了确认Ad5mTR作用下的HSVtk表达是否对老鼠的肿瘤细胞产生细胞毒性，本发明使用了来自BALB/c老鼠的大肠癌细胞株CT26细胞，所述细胞株可以较高水平表达mTERT mRNA。在GCV存在的条件下，把CT26细胞暴露在多种MOI的Ad5mTR中。2.5M0I条件下，可以充分杀死大部分细胞，而Ad5M0CK在50M0I条件下也未呈现细胞毒性(图2b)。与体外环境的细胞毒性类似，在BALB/c老鼠皮下CT26肿瘤中注射Ad5mTR时，肿瘤的生长明显得到了抑制(图2c)。
[0091]从而，Ad5mTR对包括人类TERT-TR-HSVtk在内，呈现与腺病毒抗-肿瘤效果类似的效果，可知这适合使用于老鼠的抗-肿瘤免疫性研究。
[0092]实施例2-2:提示在HSVtk作用下效能提高的DC-介导性肿瘤抗原
[0093]据知，通过引入DNA或感染腺病毒，诱发HSVtk的表达，可以提高细胞毒性⑶8T细胞的抗原反应。存在生物体GCV的条件下，HSVtk的表达即便不在整个肿瘤范围内发生，也可以在明显的水平层面诱导细胞凋亡，从凋亡的细胞诱导的抗原，可通过诸如DCs等APCs检测，而这些细胞移动到 与肿瘤抗原特异性T细胞反应的淋巴结。虽然这种模型已经在有关文献提示，但本发明的各发明人决定使用所定义的抗原特异性T细胞进行实验，验证这种可能性。为了进行这种实验，本发明的各发明人作为模型肿瘤抗原使用了老鼠的肿瘤细胞株E.G7(稳定表达卵清蛋白的EL4细胞的诱导体)，从模型肿瘤-抗原(OVA)-特异性CD8T细胞群使用过的OVA特异性T细胞受体形质转换的老鼠，提取了 T细胞。从OT-1老鼠提取的所有CD8T细胞是OVA特异性细胞毒性T细胞。首先，本发明通过皮下注射E.G7肿瘤的同系列B6老鼠，测试了 Ad5mTR的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。分离肿瘤，投入Ad5mTR后，以组织学层面评价的过程中，观察了明显的细胞凋亡。这意味着感染病毒后，释放出肿瘤抗原(图3a)。接下来，本发明从肿瘤-吸收淋巴结提取DCs，利用DC/CD8T细胞共同培养分析方法，评估了是否IFNy的生成是否受到OVA的影响。使用以Ad5mTR处理过的含肿瘤老鼠、通过来自该老鼠的DCs培养出的OT-1 T细胞，与使用以对比群病毒处理的老鼠、通过来自该老鼠的DCs培养出的OT-1 T细胞相比，产生了大量IFNy。这种结果表明，来自以Ad5mTR处理的老鼠的DCs充分提供OVA抗原，刺激OVA特异性T细胞(图3b)。从而，肿瘤中HSVtk的表达及与之相关的GCV诱导性细胞凋亡是肿瘤抗原的释放结果，这些抗原在可刺激肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞的DCs的作用下，有效得到捕捉。
[0094]可知，HSVtk的肿瘤特异性表达，不仅可以通过DCs有效刺激抗-肿瘤T细胞活性，还能直接诱导肿瘤细胞的细胞毒性。
[0095]实施例2-3:同时包括mTERT-TR-HSVtk及sPDl_Ig的腺病毒的制作
[0096]已知，Ad5mTR可以刺激抗-肿瘤⑶8T细胞的反应性。本发明的另一策略是让肿瘤-诱导的免疫抵抗性失活。这些方案的组合可以额外提高抗-肿瘤T细胞的细胞反应性。PD-Ll是从肿瘤细胞表面表达的公知的免疫抑制剂。本发明只做了可中和ro-Ll，具有PD-Ll受体受容性形式的SPD1，去除了 ro-Ll的介导性T细胞抑制作用。在生物体内，为了提高SPDl的稳定性，把SPDl融合在IgG2a的Fe领域，制作了 sPDl-1g。本发明制造了一种双重-模块腺病毒(Ad5mTR.sPDl)，其包括在腺病毒基因组El区域被mTERT_TR调节的HSVtk及位于E3区域的sPDl-1g (图4a)。通过所述Ad5mTR.sPDl感染HEK293细胞，在细胞外环境中表达分泌sPDl-1g，并通过免疫印迹分析法加以确认(图4b)。把Ad5mTR.sPDl感染细胞中的HSVtk表达水平与通过酶活性检测的Ad5mTR感染细胞做了比较(图4c)。另外，本发明通过实验检测了生物体外环境中分泌的sPDl-1g是否可以中和肿瘤细胞表面的H)-L1，提高抗-肿瘤T细胞的反应性。向感染Ad5mTR.sPDl后的293HEK细胞的培养上层液，添加表达OVA的肿瘤细胞与OVA特异性OT-1 T细胞的共同培养物，根据IFN Y分泌量，测定了 T细胞的反应性。正如期盼，反应于肿瘤细胞的攻击，抗原-特异性T细胞的IFNy分泌，在含sPDl-1g的上层液中有所提高(图4d)。通过流式细胞术测出了肿瘤细胞表面的PD-Ll的表达(图5)。这些结果表明，所述双重-模块腺病毒可以在生物体内的肿瘤微环境中提高抗-肿瘤T细胞的反应性。
[0097]实施例2-4:Ad5mTR.sPDl对肿瘤牛长的有效抑制
[0098]为了确认sHH-1g是否在生物体内提高HSVtk的抗-肿瘤活性，使用了 CT26大肠癌模型(图2c)。CT26细胞在这些细胞表面以较高水平表达H)-L1，因此选择了该模型(图5)。被Ad5mTR.sPDl感染的CT26细胞，与被Ad5mTR感染的情况相比，表现出类似的生物体外细胞毒性，预计sPDl-1g依靠HSVtk的细胞毒性不会成为直接原因(图6a)。与之相比，Ad5mTR.sPDl相对于Ad5mTR，明显促进了肿瘤的衰退，实际上让肿瘤完全衰退(图6b)。单独包括SH)1-1g的对比群腺病毒(Ad5EFl a.sPDl)在这些模型中不表现出任何抗-肿瘤效果，这表明，肿瘤组织中，sHH-1g的表达无法充分诱导肿瘤衰退，为了 sPDl-1g的效果提高，需要依靠HSVtk进行抗原反应。
[0099]实施例2-5 =SPD1-1r的肿瘤生长抑制效果受CD8T细胞的介导
[0100]HSVtk依靠DCs促进抗原-特异性CD8T细胞的反应(图3b)，sPDl-1g在细胞外促进抗-肿瘤CD8T细胞的反应性(图4d)。这种结果表明，在生物体内得到提高的CD8T细胞反应性，受益于Ad5mTR.sPDl的抗-肿瘤效果的提高。为了确认这一可能性，向携带CT26肿瘤的老鼠投入抗-⑶8抗体，让⑶8T细胞凋亡。通过双重-模块Ad5mTR.sPDl提高的肿瘤生长抑制效果，在CD8T细胞枯竭的老鼠体内，基本全部消失(图7a)。值得注意的是，Ad5mTR的抗-肿瘤活性同样降低，这表明CT26老鼠肿瘤模型中，Ad5mTR的效果依存于由⑶8T细胞介导的抗-肿瘤免疫反应。但是影响抗-肿瘤活性的⑶8的枯竭，与Ad5mTR相比，Ad5mTR.sPDl的效果更加明显(1.9倍对4.76倍)(图7b)。为了更直接评价肿瘤-特异性⑶8T细胞的作用，使用了 E.G7肿瘤模型和OVA-特异性OT-1 T细胞。投入Ad5mTR.sPDl的同系列B6老鼠的E.G7肿瘤肿瘤皮下注射，与CT26模型类似，显示出提高的肿瘤衰退结果。与之相比，同样的试验进行在同系列淋巴球-缺乏Ragl-/-老鼠时，两种病毒的抗-肿瘤效果显著减少(图8a)。CT26模型中，与⑶8T细胞的枯竭效果一直，减少的程度Ad5mTR.sPDl比Ad5mTR更大(6.58倍对1.61倍)(图8b)。向含E.G7的Ragl-/-老鼠静脉注射的OT-1T细胞的作用下，抗原-特异性T细胞反应形成时，投入腺病毒的所述抗-肿瘤效果得到恢复，所述效果与投入Ad5mTR的情况相比，投入Ad5mTR.sPDl时更加明显(图8c)。特别是，血液中的OT-1 T细胞数量，投入Ad5mTR.sPDl时比投入Ad5mTR增加更多(图8d)。结果表明，Ad5mTR.sPDl直接提高肿瘤特异性⑶8T细胞的功能，促进肿瘤的衰退。
[0101]实施例2-6:Ad5mTR.sPDl处理的杭癌效果 [0102]向第1次肿瘤部位注射病毒，在老鼠的远位部，投入抑制2次肿瘤可能性更高的Ad5mTR.sPDl的老鼠血液内，增加了癌特异性T细胞。向发生在BALB/c老鼠体内的CT26肿瘤，以3天间隔投入3次Ad5mTR.sPDl0从最初投入日计，14日后在同一老鼠的相反侧部位，试图引发2次CT26肿瘤。这时，投入Ad5mTR.sPDl的老鼠的I次肿瘤以最小限度增殖，而投入Ad5mTR的老鼠出现了很大(>600mm3)的I次肿瘤。吧正常BALB/c老鼠新集团作为2次肿瘤发生对比群使用。对比群顺利生长了 2次肿瘤，但投入Ad5mTR.sPDl的老鼠没有生长2次肿瘤(图9a及9c)。同一结果在含E.G7肿瘤模型的B6老鼠身上同样得到确认(图9b及图9c)。可知，双重模块腺病毒的注射提高抗癌免疫性，可得到抗癌效果。
【权利要求】
1.一种重组腺病毒，其特征在于:包括作用于癌特异性基因TERT(Telomerase reversetranscriptase)mRNA (序列号 I)的对反式剪接核糖酶-HSVtk (Herpes Simplex VirusThymidine Kinase)复合体进行编码的多核苷酸及治癌基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于: 所述对复合体进行编码的多核苷酸包括对Rib67核糖酶进行编码的序列号2的碱基序列和对HSVtk进行编码的序列号为3的多核苷酸。
3.—种重组腺病毒，其特征在于: 所述治癌基因选自药敏化基因、细胞凋亡基因、抑制细胞增殖基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制因子基因、抗原性基因、细胞因子基因、抗血管生成基因。
4.根据权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于: 所述治癌基因是多核苷酸，该多核苷酸含对sPD-1 (soluble programmed death-1)进行编码的序列号为4的喊基序列。
5.一种预防或治疗癌症的药学合成物，其特征在于: 包括权利要求1至4中的某一项所述重组腺病毒。
6.根据权利要求5所述的药学合成物，其特征在于: 追加包括可在医药学层面使用的载体、赋形剂、或稀释剂。
7.一种治疗癌症的方法，其特征在于: 包括把权利要求1至4中的某一项所述重组腺病毒，以药学层面有效的量投入到需要治疗的个体的步骤。
【文档编号】A61K35/76GK103732739SQ201280040192
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年8月20日 优先权日:2011年8月19日
【发明者】李相辰 申请人:国立癌中心