重组的核糖核酸酶蛋白质的制作方法

专利名称：重组的核糖核酸酶蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及对所需细胞有毒性地核糖核酸酶分子的生产。
背景技术：
自1960和1970年完成的许多研究都详细地提供了核糖核酸酶如核糖核酸酶A(RNase A)和其对肿瘤细胞的细胞毒性资料，并在Roth,J.1963,癌症研究23:657-666中作了综述。还发现人血清含有数种以组织特异性方式表达的RNase(Reddi E.1975,Biochem.Biophys.Res.Commun.67:110-118,Blank等，人类体液核糖核酸酶检测，相互关系及意义1-203-209(IRL Press,London,1981))。与宿主嗜酸性粒细胞的防御活性有关的蛋白质与RNase同源并表现出RNase活性(Gleich等，1986,美国科学院学报83:3146-3150；Slifman等，1986，免疫学杂志137:2913-2917)。因此，认为人血清RNase也有宿主防御活性。
对这些早期研究的进一步研究发现来自美洲豹蛙卵母细胞的抗肿瘤蛋白质与RNase A同源(Ardelt等，1991,生物学及化学杂志256:245-251)。已将该蛋白质命名为ONCONASE,Alfacell Corporation,N.J.,也参见例如Darzynkiewicz等(1988)细胞组织动力学21,169-182；Mikulski等，(1990)细胞组织动力学23,237-246。在美国专利4888172中也描述了该蛋白质。最近已经完成了ONCONASE作为患各种固体瘤患者的单一治疗药物的临床试验(Mikulski等，(1993)癌症学国际杂志3,57-64)或在患前期胰腺癌的患者中与三苯氧胺联用的Ⅰ期和Ⅰ/Ⅱ期临床试验(Chun等(1995)Proc.Amer Soc.Clin.Oncol.14:No.157,210)。ONCONASE与细胞-型-特异性配体的结合提高了其抗肿瘤细胞的能力(Rybak等(1993)Drug Delivery 1,3-10)。综合考虑，这些结果表明ONCONASE具有有利于产生有效选择性细胞杀死试剂的特性。
但由于该蛋白质不是人源蛋白，因此当在人体中使用时，易刺激不想要的免疫反应。因此，需要既保持该分子的有效细胞毒性特性，而同时又降低其在人体中的免疫原性。此外，需要重组生产该分子的衍生物以便它能够更好地与其他分子化学结合或重组相连以导向特异性细胞。直到本文描述的本发明为止，已证明很难重组表达出与ONCONASE相关的活性细胞毒性分子。尽管认为所述重组分子的甲硫氨酸-谷氨酸氨基末端使所述分子难以具有显著的酶活性，但是直到本发明为止尚未提出解决该问题的方法。
另外，尽管在蛋白质设计技术方面的进步有希望降低与免疫毒素抗体部分相关的免疫原性(Bird等，1988,科学242:423；Huston等，1988,美国科学院学报85:5879；Ward等，1989,自然341:544)，但是除患者的免疫抑制外，还没有解决所述毒素部分免疫原性的方案(Khazaeli等，1988,Proceedings of AACR 29:418)。因此，仍然需要降低美洲豹蛙-衍生的毒性部分之免疫原性的方法和组合物。
已经表明，通过化学(Rybak等，(1991)生物学化学杂志266:1202-21207,Newton等(1992)生物学化学杂志267,19572-19578)或重组方法(Rybak等，美国科学院学报89,3165,Newton等，(1994)生物学化学杂志269,26739-26745)，与肿瘤相关性抗原相连的RNase A超家族的非细胞毒性的人源成员可以提供选择性杀死肿瘤细胞的策略，这种策略比目前使用植物和细菌毒素的策略(Rybak,S.M.&Youle,R.J.(1991)北美免疫学和过敏反应临床学11:2,359-380)的免疫原性低。所需的人源性核糖核酸酶包括嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(EDN)和血管生成素。
发明综述
我们发现了如何构建有高度细胞毒性并是天然ONCOASE(nOnc)修饰物的RNase。当重组表达nOnc时，发现它没有显著的细胞毒性。但我们的修饰产物(rOnc)是高细胞毒性的，并保持了天然ONCOASE分子的优点，而在某些情况下，它们的细胞毒特性还有所提高。rOnc分子可单独使用或方便地用于形成化学结合物，以及形成被导向的重组免疫融合物。可用这些rOnc分子降低肿瘤细胞的生长。nOnc的有效重组形式可有利地使所述重组分子与其他治疗药物或所需的导向分子重组融合。此外，如下文可见到的，可修饰rOnc分子以提高细胞毒性。我们的nOnc衍生的分子还是令人满意的，因为nOnc是一种特有的核糖核酸酶，即可将其单独直接施用给患者以降低并抑制肿瘤细胞的生长而不需施用导向试剂。
本发明还包括用与配体相连的rOnc以产生本发明的选择性细胞毒试剂从而选择性杀死细胞的方法。所述方法包括将待杀死的细胞与含有配体结合部分的本发明细胞毒性试剂接触，所述配体结合部分特异性地将所述试剂传递到待杀死的细胞。可将本发明的所述方法用于通过选择性杀死不想要的细胞类型(如在将骨髓移植到通过照射而部分切除骨髓的患者前杀死骨髓中不想要的细胞类型)而进行体外细胞分离，或用于杀死引起移植物抗宿主病的白血病细胞或T细胞。还可用所述毒素选择性杀死培养中的不想要的细胞。
还描述了我们rOnc分子的人源化产物，该产物将部分哺乳动物或人衍生的RNase如血管生成素或人嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(EDN)移植到rOnc衍生的分子中。本发明优选的实施方案是其中将EDN的氨基末端接到rOnc分子氨基末端上的一种分子。描述了这些杂种蛋白质在核糖核酸酶活性和体外抗肿瘤作用方面的令人惊奇的特性。
附图简要描述图注


图1描述的是Rana克隆9的推测氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，和nOnc氨基酸序列的序列排列(SEQ ID NO:1)。黑体表示nOnc和Rana克隆9之间相同的残基。点表示在PCR克隆中丢失的氨基酸。
图2A和2B是实施例中举证的DNA构建体的构型。将从美洲豹蛙DNA得到的PCR产物鉴定为Rana 9。将N-和C-末端合成补平，在编码EDN/Onc杂合N-末端的[Met-(-1)]rOnc或EDN的构建体中鉴定为Onc。在下面的各构建体中标明了相应的氨基酸残基。图2B表示nOnc(SEQ ID NO:3)、rEDN(SEQ ID NO:4)、在位置20含有Gly代替Asp的[Met-(-1)]rOnc(SEQ ID NO:5)、在氨基酸位置26含Asp的rEDN(1-21)rOnc(SEQ ID NO:6)和在氨基酸位置26含Gly的rEDN(1-21)rOncG26(SEQ ID NO:7)的N端序列的序列对比。黑体字母表示保守的残基，大写字母表示从Rana克隆9推测的序列。
图3A-3D说明nOnc、rEDN、[Met-(-1)]rOnc或杂种蛋白质抑制人肿瘤细胞中的蛋白质合成。将细胞(104)铺在各个96孔微滴定培养平板中，用不同浓度的各试剂处理48小时。按下文实施例中所述确定细胞生存力。将来自1个以上试验的结果结合起来得到平均值点。当平均值的标准误差大于标准记号时，显示了标准误差。细胞系ACHN,肾癌(图3A)；MDA-MB-231(图3B)；和HS 578T(图3D)，乳腺癌；SF-539(图3C)，CNS,癌。EDN(空心三角)；nOnc(空心方块)；[Met-(-1)]rOnc(实心三角)；rEDN(1-21)rOnc(空心圆)；rEDN(1-21)rOncG26(实心圆)。
图4表示RNase A超家族一些成员的序列对比蛙凝集素来自Ranacatesbeiana,ONCONASE、EDN、ECP(人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白)，Ang是牛血管生成素，Seminal是牛精液RNase，和RNaseA是牛胰腺RNaseA(分别为SEQ ID NO:8、1和9-13)。在所有成员中保守的氨基酸是大写字母，用星号标明了活性位点残基H12、K41和H119(RNaseA编号)。
图5说明MetSerOnc和MetSer-或MetGlu-OncFvs的蛋白质合成抑制作用。单链抗体rOnc融合蛋白的细胞毒性作用；通过确定在SF 539细胞中对蛋白质合成的抑制作用，对E6FB[Met-(-1)]SerrOnc(实心圆)，[Met-(-1)]SerrOncAngFBE6(空心方块)和[Met-(-1)]GlurOncFBE6(实心方块)与非靶向的重组蛋白质[Met-(-1)]SerrOnc进行比较。将细胞铺在96孔微滴定板中用10％热灭活胎牛血清补充的Dulbecco’s基本培养基中。使总体积达到10μl，然后将平板在37℃保温3天。在加入含0.1mci[14C]亮氨酸的磷酸缓冲液2-4小时后，用PHD细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤器上，用水洗涤，用乙醇干燥，然后计数。将结果表示为模拟品处理孔中的[14C]亮氨酸掺入的百分比。
图6A和6B在如图3A-3D说明的试验中，用细胞系SF539、人神经胶质瘤细胞和命名为MetLysTryrOnc的rOnc融合蛋白(空心圆，图6A)、MetAlaAlaTyrOnc(实心圆，图6A)和含信号肽的rOnc融合蛋白MetKDELSerrOnc(空心圆，图6B)以及MetNLSSerrOnc(实心圆图6B)说明蛋白质合成的抑制作用。
图7在如图3A-3D说明的试验中，用细胞系SF539、人神经胶质瘤细胞并比较对应于MetSerOnc(含有Met-Ser氨基末端的SEQ IDNO:39)的三种融合蛋白MetSerOnc(实心圆)、MetSerOncC4(在SEQ ID NO:39的氨基酸位置5为Cys的MetSerOnc，实心方块)和MetSerOncC72(SEQ ID NO:39的氨基酸位置72为Cys的MetSerOnc,空心圆)说明蛋白质合成的抑制作用。
发明详述
本发明提供了可用于选择性杀死靶细胞，特别是肿瘤细胞的有高活性和细胞毒性的核糖核酸酶分子。在某些实施方案中，设计使所述分子含有来自人衍生之核糖核酸酶的序列，所述序列也是有高活性和细胞毒性的，但它们还有其他优点，即在人体中的致免疫性较低。本发明的rOnc分子是nOnc衍生的重组的序列。
nOnc分子含有列于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。牛胰腺RNaseA的氨基酸序列列于SEQ ID NO:13。除非特别说明，本文描述的氨基酸序列的位置使用参考SEQ ID NO:13中牛胰腺RNaseA序列的框架，因为这是RNase领域常用的参考序列。应理解所述位置命名并不说明所要求分子本身中的氨基酸编号，而是说明当所要求的分子序列与牛RNase一起排列时，在所要求分子中出现的残基。
本文所述和要求的rOnc分子优选在对应于氨基酸位置26、40、58、84、95和110的氨基酸位置含有半胱氨酸残基；参考牛RNaseASEQ ID NO:13，在位置41是赖氨酸，在位置119是组氨酸(所述位置分别对应于在SEQ ID NO:1列出的nOnc序列的氨基酸位置19、30、48、68、75和90，以及87和104)。
本发明的rOnc分子是具有如下所定义的可测量的核糖核酸酶活性的分子。核糖核酸酶还含有(a)从甲硫氨酸开始的氨基末端，在所述甲硫氨酸后可以是除谷氨酸(Glu)以外的任何氨基酸；(b)在氨基酸位置26、40、58、84、95和110含有半胱氨酸，在位置41是赖氨酸，在位置119是组氨酸，所述位置参考牛RNaseA(SEQ ID NO:13)氨基酸序列中的位置来确定的；和(c)nOnc衍生的氨基酸序列。
优选rOnc分子含有选自下列的氨基末端
Met-Ala
Met-Ala-Ala-Ser
Met-Arg
Met-(J)
Met-Lys-(J)
Met-Arg-(J)
Met-Lys
Met-Lys-Pro
Met-Lys-(J)-Pro(SEQ ID NO:14)
Met-Lys-Pro-(J)(SEQ ID NO:15)
Met-Asn
Met-Gln
Met-Asn-(J)
Met-Gln-(J)
Met-Asn-(J)-Pro(SEQ ID NO:16)
Met-(J)-Lys
Met-(J)-Lys-Pro(SEQ ID NO:17)和
Met-(J)-Pro-Lys(SEQ ID NO:18)
其中(J)是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。
此外，优选修饰rOnc分子以便将nOnc氨基酸位置2的天冬氨酸(对应于牛RNaseA序列的位置4)缺失或使之被丙氨酸或天冬酰胺取代。
在另一种形式的rOnc分子中，所述分子具有由衍生于EDN氨基末端的序列编码的氨基末端，其后是来自rOnc的序列。在所述形式中，优选所述氨基酸序列选自由基本上与下式相同的氨基酸序列组成的序列
Met(-1)EDN(1-m)Onc(n-104)
其中Met(-1)指氨基末端残基Met；其中EDN(1-m)指从EDN(SEQID NO:9)的氨基酸位置1开始，延续至并包括EDN氨基酸位置m的连续氨基酸序列；其中Onc(n-104)指从SEQ ID NO:1的氨基酸位置n开始，延续至并包括氨基酸位置104的连续氨基酸序列；以便
当m是21时，n是16或17；
当m是22时，n是17；
当m是20时，n是16；
当m是19时，n是15；
当m是18时，n是14；
当m是17时，n是12或13；
当m是16时，n是11、12、13或14；
当m是15时，n是10；
当m是14时，n是9；
当m是13时，n是8；和
当m是5时，n是1。
在其他实施方案中，将rOnc分子在羧基末端与来自血管生成素的序列，如在SEQ ID NO:11中所列的序列或SEQ ID NO:20的氨基酸位置101-107的序列相融合。人血管生成素的核酸序列是已知的并列在美国专利申请08/125,462中。
优选的rOnc核酸序列是编码优选的rOnc氨基酸序列的那些，所述氨基酸序列基本上等同于SEQ ID NO:20、22、24、26、28和30(分别对应于SEQ ID NO:19、21、23、25、27和29所列的核酸序列)所列的。最优选的rOnc氨基酸序列基本上等同于SEQ ID NO:20、22、24和26所列的氨基酸序列。其相应的核酸序列也是优选的，并列于SEQ ID NO:19、21、23和25中，包括其保守修饰的变异体。最佳序列包括SEQ ID NO:22，它具有移植到nOnc序列的16-104位氨基酸上的EDN的氨基末端1-21(通常21)氨基酸的氨基末端，而且nOnc中的氨基酸残基20(Asp)被Gly取代。相对于SEQ ID NO:39，优选的rOnc序列还可在相对于氨基酸位置5或73上含有半胱氨酸，或在氨基酸位置88丙氨酸代替半胱氨酸。
将本文所提供的rOnc序列与胰腺RNaseA超家族中的序列进行比较。所述成员中的许多是已知的，包括(但不限于)来自Rana catesbeiana的蛙凝集素(Titani等，生物化学26:2189(1987))；ONCONASE(Ardelt,W.等，生物化学杂志266:245(1991))；嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(EDN)(Rosenberg等，同上文)；人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)(Rosenberg等，实验医学杂志170:163(1989))；血管生成素(Ang)(Fett,J.W.等生物化学24:5480(1985))；牛精液RNase(Preuss等，校酸研究18:1057(1990))；以及牛胰腺RNase(Beintama等，生物物理学及分子生物学进展51:165(1988))；有关所有所述蛋白质的参考文献均引入本文作为参考。所述RNase的氨基酸序列已对比列于图4和Youle等，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Systems 10:1-28(1993)以及美国专利申请No.08/125,462(引入本文作为参考)中。定义
除非本文特别说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属的本领域普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton等(1994)微生物和分子生物学字典，第二版，John Wiley and Sons(New York)和Hale andMarham(1991)The Harper Collins Dictionary of Biology,HarperPerennial,NY给技术人员提供了本发明所用的许多术语的字典。尽管在实施或实验本发明的过程中，可以使用与本文所述的相似或相当的任何方法和材料，但本文描述了优选的方法和材料。对于本发明目的而言，下列术语定义如下。
本文中氨基酸用其熟知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号表示。同样，核苷酸用通常接受的单字母密码子来表示。
术语“可测量的核糖核酸酶活性”或“显著的核糖核酸酶活性”指当分子加到蛋白质合成受到抑制的兔网状细胞溶解产物试验中时，所述抑制以[35S]甲硫氨酸掺入到酸可沉淀的蛋白质中进行测量，IC50(ng/ml)低于40的分子。IC50是试验中对蛋白质合成的抑制达到50％所需的蛋白质浓度。还可按可从Promega Corpation,Madison,WI购买的Promega溶解产物试剂盒的所述完成溶解产物试验。按照公开的方法(Newton D.L.等，(1996)生物化学，35:545-553)，用高分子量RNA和tRNA,在37℃通过高氯酸可溶性核苷酸的形成来确定核糖核酸酶活性。用poly(A,C)UpG和polyU，按照Deprisco等和Libonati and Floridi(Deprisco等，(1984)Biochimica et Biophysica Acta 788:356-363；Libonati,M.等，(1969)欧洲生物化学杂志8:81-87)所述检测核糖核酸酶活性。通过测量在260nm吸收值随时间的增加来检测活性。保温混合物在25℃(1ml10mM咪唑，0.1M NaCl,pH6.5或pH7)含有底物和适宜量的酶溶液。按前述(Pearson J.W.等，(1991)J.Natl.Cancer Inst.83:1386-1391)用(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑嗡溴化物；噻唑基兰)(MMT)(Mossman,T.(1983)免疫学方法杂志65:55-63)完成体外翻译试验(St.Clair,D.K.等(1987)美国科学院学报84:8330-8334)和细胞生存力试验。
“nOnc衍生的”氨基酸序列是至少含一串6个连续氨基酸的氨基酸序列，所述6个连续氨基酸与选自从nOnc氨基酸序列(SEQ ID NO:1)位置1(用Glu代替pyroGlu)、2、3、4、5、6、7、8、11、12、13、14、15、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、41、42、43、44、45、46、47、50、52、54、56、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、80、81、82、84、85、86、87、91、92、93、95或96开始的连续6个氨基酸的序列相同。
特定核酸序列的“保守修饰的变异体”指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或若所述核酸不编码氨基酸序列，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何特定的多肽。例如密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸。因此，在用密码子限定是丙氨酸的每个位置时，可将密码子变成任何所述的相应密码子而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的各核酸序列还描述了各种可能的核酸的沉默变异。专业人员可以认识到，可修饰核酸中的各密码子(除AUG外，通常它是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽之核酸的各沉默变异是各所述序列中内含的。此外，专业人员可以认识到改变、增加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的各个取代、缺失或增加也是“保守修饰的变异”，所述改变会导致用化学相似的氨基酸进行氨基酸的取代。提供功能相似氨基酸的保守取代是本领域熟知的。下列6组含有彼此是保守取代的氨基酸
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
还可参见Creighton(1984)Proteins W.H,Freeman and Company
术语“分离的”或“生物学纯的”指基本上不含天然环境中通常与其相伴之组分的物质。分离的物质还可含有在天然环境中与所述物质非同时发现的物质。本文所述的rOnc是分离的和生物学纯的，因为它们是在不含美洲豹蛙无关蛋白质的情况下重组产生的。但是，它们可包括异源细胞组分、配体结合部分、标记等。
术语“核酸”指单或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非特别限定，包括以天然核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非特别说明，特定的核酸序列包括其互补序列。核酸编码与特定核酸相同或与特定核酸互补的另一核酸。
“表达载体”包括核酸的重组表达盒，所述核酸编码可由细胞转录和翻译的rOnc多肽。重组表达盒是重组或合成的核酸构建体，含有一系列可使特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸和启动子。
术语“重组”与相应的蛋白质一起使用时，指细胞表达由对所述细胞而言是外源的核酸编码的肽或蛋白质。重组细胞可表达在所述细胞天然(非重组体)形式中未发现的基因。重组细胞还可表达在所述细胞天然形式中发现的基因，其中将所述基因通过人工方法，如在异源启动子的控制下，重新导入到所述细胞中。
本文中术语特定核酸或多肽序列的“亚序列”指等于或小于所述特定核酸或多肽的核酸或多肽区域。
在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交中的“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，而且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，I部分，第2章“杂交原理和核酸探针试验的综述”，Elsevier,New York。通常，选择高度严格的洗涤条件是在特定的离子强度和pH下，比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是靶序列与精确匹配的探针杂交达到50％时的温度(在特定的离子强度和pH)。极严格条件选择为等于特定探针的Tm点。在严格条件下，彼此不杂交的核酸如果它们所编码的多肽基本相同，则它们也是基本相同的。例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一拷贝的核酸时，就会发生这种情况。
本文中术语两个核酸或多肽序列的“相同”指在规定的比较窗口进行最大一致性的序列比较时，两个序列中的残基相同。在提到蛋白质或肽使用序列一致性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常以保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变所述分子的功能特性。若序列的差别在于保守取代，可根据所述取代的保守性，将序列一致性百分比向上调整到正确值。进行所述调整的方法是本领域专业人员熟知的。这通常包括将保守取代记分为部分而不是全错配，由此提高序列一致性百分比。因此例如，若将一个相同氨基酸记分为1时，就将非保守取代记分为0，保守取代在0-1之间。例如按照Meyers和Miller，计算机应用与生物科学4:11-17(1988)的算法，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中包含的算法计算保守取代的值。
用于比较的序列对比的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列对比可通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)分子生物学杂志48:443的同源序列对比算法；Pearson和Lipman(1988)美国科学院学报85:2444的相似性方法检索；这些算法的计算机化工具(包括但不限于在PC/GENE程序中的CLUSTAL(Intelligenetics,Mountain View,California),在Wisconsin Genetics软件包(Genetics计算机集团GCG,575 Science Dr.Madison,wisconsin,USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)来完成；CLUSTAL程序在Higgins和Sharp(1988)，基因，73:237-244和Higgins和Sharp(1989)，生物科学中的计算机应用5:151-153；Corpet等(1988)，核酸研究16,1088-90；Huang等(1992)，生物科学中的计算机应用8,155-65和Pearson等(1994)，分子生物学方法24,307-31中作了详细描述。还常常通过检查和手工序列对比完成序列对比。
在提及多肽时术语“基本上相同”或“基本上相似”指在约10-20个氨基酸残基的比较窗口上，多肽含有与参考序列有至少70％序列一致性的序列，与参考序列相比优选有80％或更优选85％的序列一致性，更优选90％的序列一致性。两个多肽序列基本相同的指标是指一个肽与抗第二个肽的抗体有免疫反应性。因此，例如若两个肽的差别仅在保守取代，则一多肽与第二多肽基本相同。
两个核酸序列基本相同的指标是指第一个核酸所编码的多肽与第二个核酸所编码的多肽有免疫交叉反应性。
两个核酸序列基本相同的另一指标是指两个分子在严格条件下彼此杂交。严格条件是序列依赖性的，而且在不同的环境参数下是不同的。通常，严格条件选择为在限定的离子强度和pH下，比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃-20℃。Tm是50％的靶序列与精确匹配的探针杂交时的温度(在特定的离子强度和pH下)。但是，在严格条件下，彼此不杂交的核酸如果它们所编码的多肽基本相同，则它们也是基本相同的。例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一拷贝的核酸时，就会发生这种情况。
本文所用的术语“特异性的传递者”，指分子与携带特定靶分子或标记的细胞或组织优先结合而不与不含靶分子的细胞或组织优先结合。当然，应认识到在分子和非靶细胞或组织之间可以发生一定程度的非特异性相互作用。然而，可将特异性传递明确为通过靶分子的特异性识别介导的。典型的特异性传递会导致被传递分子与携带靶分子的细胞之间的结合强于被传递分子与不含靶分子的细胞之间的结合。与不含靶分子或标记的细胞或组织相比，特异性传递会导致传递到携带靶分子或组织中的被传递分子的量高2倍，优选高5倍，更优选高10倍，最优选高100倍。
本文所用的术语“残基”指掺入到多肽中的氨基酸。所述氨基酸可以是天然氨基酸，除非特别说明，可包括以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物。
“融合蛋白”或当一个分子与另一个分子“相连”时指通过一个多肽氨基末端和另一多肽羧基末端之间形成的肽键，而连接两个或多个多肽而形成的嵌合分子。所述融合蛋白或连接的分子可以通过组成分子的化学结合而形成，或者可从编码连续融合蛋白的核酸序列以单个多肽的形成表达出来。单链融合蛋白是含有单一连续多肽骨架的融合蛋白。
本文所用的“配体”或“配体结合部分”通常指能够特异性传递分子，与靶细胞上的受体反应或识别或结合的所有分子。具体地说，配体的例子包括但不限于抗体、淋巴因子、细胞因子、受体蛋白如CD4和CD8，溶解的受体蛋白如可溶性CD4，激素、生长因子以及特异性结合所需靶细胞的那些配体。制备rOnc-衍生的核酸和多肽
本文描述了一些编码rOnc-衍生的多肽的具体核酸。这些核酸可用标准重组或合成技术制备。在给定本发明核酸的情况下，专业人员可以构建各种含功能等同核酸如编码相同多肽之核酸的克隆。达到这些目的的克隆方法以及确定核酸序列的测序方法是本领域熟知的。适宜的克隆和测序技术的例子，以及足以指导专业人员进行许多克隆试验的说明见于Berger和Kimmel,分子克隆技术指南，酶学方法152卷，学术出版公司San Diego,CA(Berger)；Sambrook等(1989)分子克隆-实验室手册(第2版)1-3卷；以及分子生物学常用方法F.M.Ausubel等，编，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1994增补版)(Ausubel)。来自生物学试剂和实验仪器制造商的产品说明提供了用于已知生物学方法的信息。所述制造商包括SIGMA化学公司(Saint Louis,MO)，R&D systems(Minneapolis,MN)，Pharmacia LKB Biotechnology(Pescataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(PAlo Alto,CA),Chem Genes Corp.,Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),Glen Research,Inc.,GIBCOBRL Life Technologies,Inc.,(Gaithersberg,MD),Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen,San Diego,CA和Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及专业人员已知的许多其他商业来源。
本发明的核酸组合物，RNA、cDNA、基因组DNA或各种组合的杂种可从生物源中分离或体外合成。本发明的核酸存在于转化的或转染的细胞、转化或转染的细胞溶解产物中，或以部分纯化或基本纯的形式存在。
用于扩增用作分子探针或产生用于随后亚克隆的核酸片段的体外扩增技术是已知的。足以指导专业人员完成所述体外扩增方法的技术的例子，包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增以及其他RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)见于Berger、Sambrook等(1989)分子克隆-实验室手册(第二版)1-3卷；和Ausubel以及Mullis等(1987)美国专利4683202；PCR方案，方法和应用指南(Innis等编)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)(Innis)；Amheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；NIH研究杂志(1991)3,81-94；(Kwoh等(1990)美国科学院学报86,1173；Guatelli等(1990)美国科学院学报87,1874；Lomell等(1989)临床化学杂志35,1826；Landegren等(1988)科学241,1077-1080；Van Brunt(1990)生物技术8,291-294；Wuand Wallace(1989)基因4,560；Barringer等(1990)基因89,117,andSooknanan和Malek(1995)生物技术13:563-564。在Wallace等的美国专利5426039中描述了体外克隆扩增核酸的改进方法。
用作探针的寡核苷酸如在体外rOnc核酸扩增方法中用作探针或用作核酸探针以检测rOnc核酸的寡核苷酸，通常是按照Beaucage和Caruthers(1981)(Tetrahedron Letts.,22(20):1859-1862,)描述的固相亚磷酰胺三酯法，如用Needham-Vandevanter等(1984)核酸研究12:6159-6168描述的自动合成仪化学合成的。还可常规制备寡核苷酸并从技术人员已知的许多商业来源订购。如果需要的话，寡核苷酸的纯化通常是通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过Pearson和Regnier(1983)染色体杂志255:137-149所述的阴离子交换HPLC完成的。合成的寡核苷酸序列可以用Maxam和Gilbert(1980)(在Grossman and Moldave(eds.)Academic Press,New York,酶学方法65:499-560)中的化学降解法来确定。
本领域专业人员可以了解在给定核酸序列中产生所需改变的许多方法。所述熟知的方法包括定点诱变，使用简并寡核苷酸的PCR扩增，将含所述核酸的细胞与诱变剂接触或使之暴露于照射中，所需的寡核苷酸的化学合成(如与连接和/或克隆相结合以产生大核酸)以及其他熟知的技术。参见，Giliman和Smith(1979)基因8:81-97；Roberts等(1987)自然328:731-734和Sambrook等(1989)分子克隆-实验室手册(第二版)1-3卷；Innis Ausbel,Berger,Needham VanDevanter和Mullis(所有均同上文)。
可用各种熟知的方法合成本发明的多肽。通常按照常规技术在溶液或固体支持物上合成相当短的多肽。参见例如Merrifield(1963)美国化学协会杂志85:2149-2154。可以购买到各种自动合成仪和测序仪并可按照已知的方法使用。参见如Stewart和Young(1984)固相肽合成，第二版，Pierce Chemical Co.。还可通过重组表达编码所述多肽的核酸，然后用标准技术纯化来生产多肽。制备本发明的核酸和多肽的保守修饰物
本领域专业人员可预料到公开的所述序列的许多保守变异会产生基本相同的rOnc。例如由于遗传密码的简并性，“沉默取代”(即不改变所编码的多肽的核酸序列的取代)是编码氨基酸的各核酸序列的不言而喻的特征。同样，在氨基酸序列中的一个或少数氨基酸上发生的保守氨基酸取代是用具有高度相似特性的不同氨基酸进行取代(参见上文定义部分)，并很容易鉴定为与公开的氨基酸序列或编码氨基酸的公开的核酸序列高度相似。各清楚公开的序列的所述保守取代(或修饰)变异是本发明的一个特征。
本领域专业人员了解在给定的核酸序列中产生改变的许多方法。所述熟知的方法包括定点诱变，使用简并寡核苷酸的PCR扩增，将含所述核酸的细胞与诱变剂接触或暴露于照射中，化学合成所需的寡核苷酸(如与连接和/或克隆相结合以产生大核酸)以及其他熟知的技术。参见，Giliman和Smith(1979)基因8:81-97；Roberts等(1987)自然328:731-734和Sambrook、Innis Ausbel,Berger,Needham VanDevanter andMullis(所有均同上文)。
最常见的是，通过改变相应的核酸序列并表达所述多肽来改变多肽序列。但是还可用市售的肽合成仪来合成多肽序列以产生任何所需的多肽(参见Merrfield,and Stewart and Young,同上文)。
本领域专业人员可以以所提供的序列和本领域有关核糖核酸酶的一般性知识为基础来选择本发明所需的核酸或多肽。RNase的物理特征和一般特性是本领域专业人员熟知的。RNase中一些突变的特定效果是已知的。此外，有关蛋白质和核酸特性的一般性知识可以使本领域专业人员选择与本文序列表中所公开的核酸和多肽相似或等同的适宜序列。本文定义部分描述了举例性的保守氨基酸取代。
最后，用适宜的试验，通过常规筛选技术，可以对核酸和多肽的大部分修饰进行所需特征的评估。例如，通过适宜的免疫实验可检测多肽免疫特征方面的改变。按照标准技术还可以检测其他特性的修饰，如与靶核酸的核酸杂交、蛋白质的氧化还原或热稳定性、热histeresis、疏水性、对蛋白水解的敏感性。rOnc融合蛋白和其他治疗部分
rOnc分子还包括药理试剂或含各种药理试剂的微囊剂。它们通常包括作为导向分子的配体以便将rOnc导向所需的细胞。可将rOnc直接与配体或有助于传递rOnc的反义分子相连。参见，例如SEQ IDNO:40-61。还可将rOnc工程化以便其含有如SEQ ID NO:32(和SEQ IDNO:31)氨基酸位置1-7的核定位信号(NLS)，以指导细胞内的rOnc。或者，位置8的甲硫氨酸和SEQ ID NO:31位置22-24的相应核酸已被删除且可被删除。NLS的核酸序列是SEQ ID NO:31的核酸1-21。信号肽是例如SEQ ID NO:63的氨基酸位置1-25。
根据基因治疗应用特定地改变rOnc分子。可将其与其他治疗药物融合，如将其与抗B细胞淋巴瘤抗体融合。例如，如下文详细解释的，与抗运铁蛋白受体抗体或抗结肠癌抗体重组融合的rOnc分子是有活性的。如上所述，nOnc有体内抗肿瘤作用，而且优先杀死由血清或生长促进因子如ras刺激的快速分裂的细胞。所述分子在细胞内很容易内部化。通过将其与核定位信号等相连以便重新将所述分子再导向细胞内，可进一步增强其活性。在肿瘤细胞中特别有用的是导向靶端粒酶，一种由RNase降解的一种酶。
在微注射研究中，我们发现Onc与ras有协同作用。这意味着Onc与ras都在细胞内。当Onc经其自身途径进入细胞时，它与ras没有协同作用。需要CAAX(SEQ ID NO:33)基元以将ras定位在质膜上(C=Cys，A=脂肪族氨基酸，X=S、M、C、A或Q，例子是Cys-Val-Ile-Met(SEQ ID NO:34))。重要的是已经表明这种类型的序列可将异源蛋白质导向质膜(Hancock.J.,Cadwallader,K.,Paterson,H.and C.Marshall(1991)EMBO J.10:4033)。需要将rOnc基因与编码实施例中所给出的CAAX(SEQ ID NO:33)信号或下文所述的KDEL的DNA相连。
端粒酶正作为“通用的癌靶”被研究(G.B.Morin,JNCL(1995)87:859)。它是一种定位在核中的RNA蛋白。已经表明端粒酶RNA的反义序列可抑制该酶的功能并阻断癌细胞的生长(J.Feng等，科学(1995)269:1236)。RNase还破坏了该酶的活性。当与含端粒酶的细胞提取物一起保温时，Onc也可破坏该酶的活性。可制备NLS/Onc分子(如在SEQ ID NO:32中所列的)以便指导Onc到达核，从而使其降解端粒酶。已经表明我们所用的NLS可将蛋白质再导向核以达到干扰核抗原功能的目的(S.Biocca,M.S.Neuberger and A.Cattaneo(1990)9:101)。我们的NLS/Onc分子在杀死细胞的过程中是有效的。
在需要将重组分子运输到靶细胞细胞溶胶的情况下，所述重组分子的氨基末端序列是优选的。通常在所述蛋白质的氨基末端插入所述信号肽。例如，本文所述重组分子的前数个氨基酸(Met之后的)可以是KDEL(SEQ ID NO:64)，并可发出信号将所述分子导向内质网。可以使用本文称为“内质滞留序列”的包括KDEL、KDEL重复区的氨基酸序列，或发挥功能使蛋白质保持在内质网中或再循环到内质网中的其他序列。
与配体相连的rOnc分子可选择性地包括微囊系统，如脂质体或微团，它们含其他治疗组合物如药物、核酸(如反义核酸)或优选避免直接与循环系统接触的另一治疗部分。制备与抗体相连的脂质体的方法是本领域专业人员熟知的。参见例如美国专利4957735,Connor等，药物治疗，28:341-365(1985)。
本领域专业人员可预料到可将配体分子或其他治疗组分和rOnc分子以任何顺序连接在一起。因此，若配体是多肽，可将rOnc分子与配体的氨基或羧基末端连接，或可将其与两种分子的任一内部区相连只要所述连接不会干扰所述分子的相应活性。
所述分子可通过本领域专业人员熟知的任何方法连接。通常可将rOnc直接或通过接头(间隔基)与配体结合。但是，若rOnc和配体或其他治疗药物都是多肽，优选重组表达作为单链融合蛋白的嵌合分子。
在一实施方案中，将rOnc分子与另一分子(如细胞毒素、标记、配体或药物或脂质体)化学结合。化学结合分子的方法是本领域专业人员熟知的。
将药物与抗体或其他多肽导向分子相连的方法随所述药物的化学结构而不同。通常多肽含有各种功能基团；如羧基(COOH)或游离胺基团(-NH2)；它们可与rOnc分子上的适宜官能团反应以便将其他分子结合到其上。
或者，可将配体和/或rOnc分子衍生以便与其他反应性官能接触或与其相连。衍生作用涉及连接许多接头分子中的任何一个，如可从PierceChemical Company,Rockford Illinois得到的接头分子。
本文所用的“接头”是用于连接两个分子的分子。所述接头能够在两个分子间形成共价键。适宜的接头是本领域专业人员熟知的，包括(但不限于)直链或支链碳接头、杂环碳接头，或肽接头。若两个分子都是多肽，可将所述接头通过其侧翼基团(如通过连接半胱氨酸的二硫键连接)与组成型氨基酸相连。但是，在优选的实施方案中，可将所述接头与末端氨基酸的α碳氨基和羧基相连。
可以使用双功能接头以形成所需的免疫结合物，所述双功能接头含有一个与特定试剂上的基团反应的功能基团，和与抗体反应的另一基团。或者，衍生作用涉及配体的化学处理，如用高碘酸盐进行糖蛋白抗体糖部分的乙二醇裂解以产生游离的醛基。可将抗体上的游离醛基与试剂上的游离胺或肼基团反应以便将所述试剂结合到其上。(参见美国专利4671958)。在多肽如抗体或抗体片段上产生游离巯基的方法是熟知的(参见美国专利4659839)。
将各种化合物包括放射性核素金属螯合剂、毒素和药物与蛋白质如抗体相连的许多方法和接头分子是已知的。参见例如，欧洲专利申请188,256；美国专利4671958、4659839、4414148、4699784；4680338；4569789和4589071；以及Borlinghaus等癌症研究47:4071-4075(1987)(所述文献引入本文作为参考)。具体地说，各种免疫毒素的生产方法是本领域熟知的，并可见于例如“单克隆抗体.毒素连接物瞄准奇异的子弹”Thorpe等，临床医学中的单克隆抗体，学术出版社，pp.168-190(1982)；Waldmann,科学，252:1657(1991)；美国专利4545985和4894443(所述文献引入本文作为参考)。
在某些情况下，当嵌合分子已到达其靶位点时，需要使rOnc与配体分离。因此，可以使用含有在靶位点附近可裂解之键的嵌合结合物，以便在靶位点释放效应物。通过酶促活性或免疫结合物在靶细胞内或靶位点附近所处的条件来促进所述键的裂解，以从配体中释放所述试剂。当靶位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点存在的条件下(如当与肿瘤相关酶或酸性pH接触时)可裂解的接头。
许多不同的可裂解接头是本领域专业人员已知的。参见美国专利4619492；4542225和4625014。从这些接头基团中释放试剂的机制包括例如照射光敏感的键和酸摧毁的水解作用。例如美国专利4671958中描述了免疫结合物，所述结合物含有在体内靶位点通过患者补体系统的蛋白水解酶可裂解的接头。就大量已经报道的用于将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、药物、毒素和其他的试剂与抗体相连的方法而言，本领域专业人员能够确定用于将给定试剂与抗体或其他多肽相连的适宜方法。rOnc分子或融合蛋白的生产
若所需的分子相对较短(即不到约50个氨基酸)，则可以用标准化学肽合成技术合成它们。若所需的两个分子相对短，则可将嵌合分子合成为单个连续多肽。或者，将所述分子分别合成，然后通过将一个分子的氨基末端与另一分子的羧基末端缩合形成肽键而将其融合。或者，可将所述分子与肽间隔基分子的一端缩合，由此形成连续的融合蛋白。
固相合成法是用于化学合成本发明多肽的优选方法，在所述固相合成法中，所述序列的C末端氨基酸与不可溶的支持物相连，然后依次加入序列中的剩余氨基酸。用于固相合成法的技术由Barany和Merrifield,固相肽合成；pp3-284肽合成，生物学，Vol.2肽合成的具体方法，A部分，Merrifiels等，美国化学协会杂志，85:2149-2156(1963)和Stewart等，固相肽合成，第二版Pierce Chem.Co.,Rockford,Ull.(1984)(所述文献引入本文作为参考)。
在优选的实施方案中，用重组DNA方法合成本发明的嵌合融合蛋白。这通常涉及产生编码融合蛋白的DNA序列，将所述DNA放在表达盒中并置于特定启动子的控制下，在宿主中表达所述蛋白质，分离表达的蛋白质，然后如果需要将所述蛋白质复性。
编码本发明融合蛋白的DNA以及rOnc分子本身可通过任何适宜的方法制备，包括如适宜的序列的克隆和限制性消化，或通过Narang等(酶学方法68:90-99(1979)；)的磷酸三酯法、Brown等(酶学方法68:109-151(1979)；)的磷酸二酯法；Beaucage等(Tetra.Lett.,22:1859-1862(1981)；)的二乙基亚磷酰胺法以及美国专利4458066中的固体支持法直接化学合成(所有文献均引入本文作为参考)。
以化学合成法生产单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交，或通过用所述单链作为模板，用DNA聚合酶通过聚合反应将其转变成双链DNA。本领域专业人员应认识到尽管DNA的化学合成法限于约100个碱基的序列，但通过连接较短的序列可以获得较长的序列。
或者，克隆亚序列，然后用适宜的限制酶裂解所述适宜的亚序列。然后连接所述片段以产生所需的DNA序列。
在一优选的实施方案中，可用DNA扩增法如聚合酶链反应(PCR)克隆编码本发明的融合蛋白的DNA或rOnc分子。如果将两个分子连在一起，本领域专业人员可以预料到所述分子可以通过由一个或多个氨基酸组成的肽间隔基分开。通常所述间隔基除连接蛋白质或保持某种最小距离或在它们之间的其它空间关系外，没有特定的生物活性。但是，可以选择间隔基的氨基酸组成以影响所述分子的某些特性如折叠、净电荷或疏水性。
编码rOnc分子或融合蛋白的核酸序列可以在各种宿主细胞，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞如COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系中表达。将重组蛋白基因与用于各宿主的适宜的表达控制序列可操作相连。对于大肠杆菌而言，包括启动子如T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点并优选包括转录终止信号。对于真核细胞而言，控制序列包括启动子并优选包括衍生于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒的增强子等，以及聚腺苷酸化序列，并可包括剪接供体和受体序列。
通过熟知的方法如用于大肠杆菌的氯化钙转化和用于哺乳动物细胞的磷酸钙处理和电穿孔，可将本发明的表达载体或质粒转移到所选的宿主细胞中。可通过质粒所含的基因如amp,gpt,neo和hyg基因所赋予的抗生素抗性筛选用质粒转化的细胞。
表达后，按照本领域的标准方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱层析、柱色谱纯化、凝胶电泳等(参见R.Scopes,蛋白质纯化，Springer-Verlag,N.Y.(1982),Deutscher,酶学方法Vol.182蛋白质纯化指南，AcademicPress,Inc.N,Y,(1990))纯化重组rOnc或融合蛋白。对于药物用途来说，具至少约90-95％均一性的基本纯组合物是优选的，98-99％或更高均一性的组合物是最优选的。在按照需要部分纯化或达到均一后，在治疗中可使用所述多肽。
因此，本发明还提供了含上述所述核酸序列的宿主细胞和表达载体。
此外，本发明包括用与配体相连的rOnc以产生本发明的选择性细胞毒性试剂，从而选择性杀死细胞的方法。所述方法包括将所述待杀死的细胞与本发明含配体结合部分的细胞毒性试剂接触，所述配体结合部分特异性地将所述试剂传递到待杀死的细胞。可将本发明的所述方法用于通过选择性杀死不想要的细胞类型(如在将骨髓移植到通过照射而部分切除骨髓的患者前杀死骨髓中不想要的细胞类型)而进行体外细胞分离，或用于杀死引起移植物抗宿主病的白血病细胞或T细胞。
对于体内使用方法而言，优选在该方法中所用试剂的哺乳动物蛋白对于所述试剂所打算应用的种来说是内源的。对用于人体的来说，所述细胞毒性试剂优选是含人源化嵌合抗体和人源化rOnc的融合蛋白。本发明的具体体内方法包括用于化疗减轻哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括施用细胞毒性量的本发明的选择性细胞毒性试剂。所述方法特别适用于治疗对细胞毒性试剂敏感的肿瘤。特别适用的肿瘤包括胰腺、结肠、乳腺和肾肿瘤。药物组合物
本发明的rOnc分子和含有它们的融合蛋白可用于胃肠外、局部、口服或局部给药，如通过气溶胶或经皮以用于预防和/或治疗。根据给药方法，可将药物组合物以各种单位剂量形式给药。例如，适用于口服给药的单位剂量形式包括粉剂、片剂、粒剂、胶囊和锭剂。应认识到当口服给药时，必须要使本发明的主体分子和融合蛋白以及药物组合物不被消化。这通常是通过将所述蛋白质与一组分复合以使其对酸和酶促水解产生抗性，或通过将所述蛋白质包装在有适宜抗性的载体如脂质体中而做到的。保护蛋白质不被消化的方法是本领域熟知的。
本发明的药物组合物特别适用于胃肠外给药，如静脉内给药或施用到体腔或器官的腔内。用于给药的组合物通常含有溶解在可药用载体，优选含水载体中的嵌合分子的溶液。可以使用各种含水载体如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并通常不含不想要的物质。可通过常规的熟知的灭菌技术将这些组合物灭菌。按接近生理条件的需要，所述组合物可含有药用上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。治疗分子在这些制剂中的浓度可以有很大的变化，并主要以液体体积、粘度、体重等为基础，根据所选的特定给药方式和患者的需要来选择。
因此，用于静脉内给药的典型药物组合物是大约0.1-10mg/患者/天。可以使用从0.1-100mg/患者/天的剂量，特别是当将药物施用到隔离的位点，而不是到血液中，如施用到体腔或器官腔内时。制备胃肠外可给药的组合物的实际方法是本领域已知的或对本领域专业人员来说是显而易见的，详细地描述于诸如Remington’s Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1990)这样的文献中。
可施用含本发明rOnc分子或融合蛋白或其混合物(即含有其他蛋白质)的组合物以用于治疗。在治疗应用中，将组合物以细胞毒性量、足以杀死特定细胞的量施用给患病的患者。将足以达到该目的的量定义为“治疗有效量”。对于所述用途有效的量取决于疾病的严重程度和患者的一般健康状况。
根据患者的需要和可耐受的剂量和频率，可将所述组合物单次或多次给药。在任何情况下，所述组合物应提供足量的本发明蛋白质以有效治疗患者。
本文引用的所有专利、申请和文献均引入本文作为参考。提供下列实施例仅仅是为了说明的目的，而不以任何方式对本发明构成限制。实施例
实施例Ⅰ克隆并表达rOnc和含EDN的Onc结合物
A材料按所述，天然ONCONASE(nOnc)(SEQ ID NO:1)Ardelt等(1991)生物学化学杂志256,245-251和重组人EDN(rEDN)(SEQ ID NO:9)Newton等(1994)生物学化学杂志269,26739-26745是分别从美洲豹蛙卵母细胞，NASCO,Fort Atkinson,WI和大肠杆菌中纯化的。由Assay Research,Inc.,college Park,MD制备抗所述变性蛋白质的抗体。完成PCR和直接克隆PCR产物的试剂是分别从Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT和Invitrogen,San diego,CA得到的。用于核糖核酸酶实验的底物是从Sigma,St.Louis,MO和BoehringerMannheim,Indianapolis,IN购买的。Newton等(生物化学35:545(1996))描述了重组蛋白的构建和表达中所用的材料和其来源以及兔网织红细胞裂解物。
B．PCR克隆Onconase按标准方法用蛋白酶K(Maniatis,T,Fritsch,E.F.&Sambrook,J.分子克隆，实验室手册(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982))分离美洲豹蛙基因组DNA。设计一系列简并引物以对应于公开的nOnc序列(Ardelt等(1991)生物学化学杂志256,245-251)各区域中的氨基酸。用15μg在100μl中的基因组DNA，按制造商的说明完成PCR反应。除DNA外，将所有试剂混合，然后在95℃保温8分钟以便在加入Taq DNA聚合酶前时任何残留的蛋白酶K失活。完成40个循环的PCR，每个循环94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，然后在72℃引物延伸2分钟。数对引物产生预期大小的产物。用编码氨基酸残基15-23的前向引物(AG(GA)GATGT(GT)GATTG(TC)GATAA(CT)ATCATG)(SEQ ID NO:35)和编码氨基酸残基90-98的反向引物(TGTGA(AG)AA(CT)CAGGC(AC)CC(TA)GT(GT)CA(CT)TTT)(SEQ ID NO:36)得到最大的产物(252bp)。通过TA克隆将该片段亚克隆到PCTTMⅡ中，然后直接将携带适宜大小插入片段的克隆测序，发现编码nOnc的16-98氨基酸残基(Rana 9)(SEQID NO:2)。将相应的核酸序列列在SEQ ID NO:37中。
C．质粒构建、表达、蛋白质纯化和体外实验在N末端用nOnc的氨基酸残基1-15或EDN的氨基酸残基-1-21，在C末端用nOnc的氨基酸残基99-104，通过重叠延伸(Horten等(1990)生物技术8,528-532)，用剪接PCR技术重构建nOnc的N和C末端。将组装的基因插入细菌表达载体pET-11d(Novagen Madison,WI)中的XbaI和BamHI位点之间。所有过程均基本按Newton等((1994)生物学化学杂志269,26739-26745)所述完成。按供应商(Novagen Madison,WI)的说明在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中表达所述质粒。在应用到CM-Sephadex C-50柱(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)前，按Newton等((1994)生物学化学杂志269,26739-26745)所述将融合蛋白从包函体中分离，变性、复性并透析。用在20mM Tris-Cl,pH7.5中含10％甘油的NaCl梯度(0-0.5M)洗脱蛋白质。在用5％甲酸平衡并洗脱的Sephadex-100上通过大小排阻色谱使最终的纯度＞95％。收集蛋白质，用YM3膜(或冻干)(Amicon,Beverly,MA)通过amicon超滤浓缩，然后在分析前，用含10％甘油的20mM Tris-Cl,pH7.5透析。
按公开的方法(Newton等(1996)生物化学35:545-553)，通过在37℃形成高氯酸可溶的核苷酸，按照公开的方法(Newton等(1994)神经科学杂志14,538-544)用高分子量RNA和tRNA确定核糖核酸酶活性。用poly(A,C)UpG和polyU，按照Deprisco等和Libonati和FloridaDeprisco等，(1984)Biochimica et Biophysica Acta 788:356-363；Libonati,M.和Floridi,A.(1969)欧洲生物化学杂志.8:81-87所述经分光光度法检测核糖核酸酶活性。简单地说，通过测量在260nm光吸收值的增加来检测活性。保温混合物在25℃(1ml 10mM 咪唑，0.1M NaCl,pH6.5或pH7)含有底物和适宜量的酶溶液。按前述进行体外翻译试验(St.Clair等(1987)美国科学院学报84,8330-8334和细胞活性试验(Pearson等，(1991)J.Natl.Cancer Inst.83:1386-1391，使用(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑嗡溴化物；噻唑基兰)(MMT)(Mossman,T.(1983)免疫学方法杂志65:55-63))。
D．[Met-(-1)]rOnc和rOnc嵌合体的克隆和表达设计8个不同的寡核苷酸引物以对应于nOnc主要氨基酸结构中的特定区域(Ardelt等(1991)生物学化学杂志256,245-251)，然后按上述用热循环仪完成美洲豹蛙基因组DNA的扩增。分别对应于nOnc的氨基酸残基15-23和90-98的引物对产生252bp的片段。将代表Rana克隆9的PCR产物克隆到PCRTMⅡ中，序列分析证明所述PCR产物编码从氨基酸残基16-98(图1)的Onc(共104个氨基酸)。
将完整的重组体Onc(rOnc)基因(SEQ ID NO:38)通过PCR延伸构建，然后用前述方法(Newton等(1994)生物学化学杂志269,26739-26745)克隆到表达载体中。通过分别插入nOnc的前15个和后16个氨基酸残基得到rOnc的氨基和羧基末端。在图2A的上部描述了半合成rOnc基因的构型。设计引物以便与Rana克隆9PCR产物的DNA序列重叠。在BL21(DE3)大肠杆菌中表达质粒，在应用到CM SephadexC-50柱前按Newton等(1994)生物学化学杂志269,26739-26745所述从包函体中分离重组蛋白质。通过大小排阻色谱使最终的纯度＞95％。在该表达系统中，从所述细菌中得到的rOnc在氨基末端[Met-(-1)]含有额外的甲硫氨酸(SEQ ID NO:39)，与天然蛋白质(SEQ ID NO:1)真正的焦谷氨酰基氨基酸残基(＜Glu-1)相反。
为了人源化[Met-(-1)]rOnc而同时保持活性位点残基的排列(图2B)，用编码人嗜酸性粒细胞RNase、EDN(图2B,rEDN(1-21)Onc)前21个氨基酸残基的寡核苷酸再构建Rana克隆9的N末端。PCR克隆会导致序列错误。的确，编码EDN(1-21)Onc基因的DNA序列含有A到G的取代，在所述嵌合体的位置26(nOnc中的残基20)导致从Asp到Gly的改变，并在图2B中命名为rEDN(1-21)rOncG26。将含编码rEDN(1-21)Onc的另一质粒测序，发现其含有正确的DNA序列。由于突变导致用小的中性残基取代了带电荷的氨基酸，所以还表达了突变嵌合体并鉴定了其活性。另外，突变[Met-(-1)]rOnc使其位置20的Asp改变为Gly(rOncGly20，图2A和B)。
E．Onc、EDN、[Met-(-1)]rOnc和杂种rOnc蛋白质的核糖核酸酶活性nOnc(Lin,J.J.等(1994)生物化学和生物物理研究通讯204,156-162)和EDN(Saxena等(1992)生物学化学杂志267,21982-21986)均是在兔网织红细胞裂解产物中，通过依赖于其相应的溶核活性的机制的有效的体外翻译抑制剂。如表1所述，如通过[35S]甲硫氨酸掺入到酸可沉淀的蛋白质中所测量的，将nOnc或EDN加入兔网织红细胞裂解物中会引起蛋白质合成的抑制。而nOnc和EDN均会抑制蛋白质合成，IC50s分别为0.2和1.3ng/nl。[Met-(-1)]rOnc、[Met-(-1)]rOncG20和rEDN(1-21)rOncG26的效力相当低(IC50s分别为98、28和28ng/ml)。在该实验中，活性最差的RNase是rEDN(1-21)rOnc,IC50为1600ng/ml。胎盘核糖核酸酶抑制剂(PRI)与EDN紧密结合并抑制其酶活性Sorrentino等((1992)生物学化学杂志267,14859-14865)，而nOnc活性几乎不受PRI的影响(Wu,Y.N.等(1993)生物学化学杂志268,10686-10693)，表1描述了其与EDN和胰腺RNase超家族其他成员的同源性。就此而言，令人感兴趣的是，rEDN(1-21)rOnc的活性，与nOnc一样几乎不受PPI的影响，而含有Gly突变的杂种RNase现在的行为更象EDN，即其活性显著受PRI的抑制(21倍)。
用高和低分子量底物，用实验评估这些蛋白质的核糖核酸酶活性。如表2所示，EDN和nOnc有不同的底物特异性，与以前公开的结果一致(Ardelt等(1991)生物学化学杂志256,245-251,Sorrentino等(1992)生物学化学杂志267,14859-14865,Ardelt等(1994)蛋白质科学3，增刊1,137)。与表1的结果一致，[Met-(-1)]rOnc(SEQ ID NO:39)和rEDN(1-21)rOnc对所有底物的活性很差(在所用的实验条件下检测不到活性或活性极低)。令人惊奇的是，含Gly的杂种蛋白质特别是在EDN酶活性的最佳条件下，显示有显著的核糖核酸酶活性。EDN在中性pH的活性更高(Sorrentino等(1992)生物学化学杂志267,14859-14865)如表2所见，在pH7.5时，与pH6时相比，tRNA的EDN降解显著提高(42.3倍)。同样，与EDN的行为类似，含Gly的杂种蛋白质随pH从6变化到7.5，其活性提高(21.7倍)，而nOnc在pH7.5时失去活性，这与其6-6.5的最佳pH相一致(Ardelt等(1991)生物学化学杂志256,245-251,Ardelt等(1994)蛋白质科学3，增刊1,137)。含Gly的杂种蛋白质具有提高的类似EDN的活性的迹象还通过其与EDN的优秀底物poly(A,C)的行为而得到证实。如表2所示，仅rEDN(1-21)rOncG26表达与该底物几乎50％的EDN酶活性，而其他RNase的活性几乎可以忽略。用poly(U)可以观察到相似的结果。相反，rEDN或rEDN(1-21)rOncG26与UpG(最佳的Oncanase底物)(Ardelt等(1994)蛋白质科学3，增刊1.1,137)检测不到活性。总之，[Met-(-1)]rOnc和rEDN(1-21)rOnc的酶活性比nOnc或rEDN低。当用EDN的特定底物和最佳条件检测时，尽管rEDN(1-21)rOncG26表达显著的EDN-类似酶活性，但在任何实验中，它的活性都不如EDN。这可能是由于受损的酶底物相互作用或使用了该杂种酶的次最佳检测条件而导致的。
表1与rEDN或nOnc相比，在存在或不存在PRI的条件下，[Met-(-1)]rOnc和杂种蛋白质在兔网织红细胞裂解物中的活性
IC50a(ng/ml)
(-)PRI (+)PRI 差异倍数
nOnc 0.2 0.24 1.2
rEDN 1.3 ＞40 ＞30.7[Met-(-1)]rOnc 96140 1.4[Met-(-1)]rOncG202824 0.9 rEDN(1-21)rOnc 1600 3200 2 rEDN(1-21)rOncG26 28600 21
aIC50是在兔网织红细胞裂解产物中抑制蛋白质合成达到50％所需的蛋白质浓度。数据点是至少3个实验的平均值。
表2 RNase对不同底物的活性
RNase(活性单位/mg蛋白质) 底物 测量pH rEDN nOnc [Met-(-1)rOnc] rEND1-21rOnc rEND1-21rOncG26酵母RNAa6.06000560 0.01 8 120 tRNAa,c6.01100390 12 4 340 tRNAa,c7.546000 6050 130 7400 poly(A,C)b 7.080000.04 54.5 3900 UpGb 6.50.050.18＜0.01 ＜0.01＜0.01 poly Ub7.016.50.15 0.20 0.35 4.5
a通过高氯酸可溶性核苷酸的形成定量RNase活性。将单位定义为从实验的线性部分的斜率计算的每分钟A260的改变。各值是不同实验中的2-3个检测的平均值。
b如在材料和方法部分所述，按Deprisco等(1984)和Libonati和Floridi(1969)所述的方法完成分光光度检测。将单位定义为从实验的线性部分的斜率计算的每分钟A260的改变。各值是2或多个结果的平均值。
c[Met-(-1)]rOncG20没有可检测的活性。
F在4种人肿瘤细胞系中用Rnase抑制蛋白质合成用MTT实验，通过确定细胞生存力，将[Met-(-1)]rOnc和两种杂种Rnase的细胞毒性作用与rEDN和nOnc进行比较。如图3所示，在所有4种人类肿瘤细胞系中nOnc降低了肿瘤细胞的生存力。在所示浓度，rEDN对任何细胞系的生存力均没有影响。与nOnc相反，在所有4种细胞系中[Met-(-1)]rOnc和[Met-(-1)]rOncG20的细胞毒性始终很低。然而，在ACHN、人肾癌细胞中，rEDN(1-21)rOncG26的细胞毒性比nOnc高，在MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中的细胞毒性与nOnc相同。尽管分别在SF-539和HS 578T人神经胶质瘤和乳腺癌细胞系中，rEDN(1-21)rOncG26的活性比nOnc低，但是仍比[Met-(-1)]rOnc或在位置26含Asn的rEDN(1-21)rOnc蛋白质的活性高。
G杂种Rnase的结构分析以对Onc(Mosiann S.C.,Ardelt W.,James M.N.g.,(1994),P-30蛋白质，一种具有抗肿瘤活性的两栖动物核糖核酸酶的精细1.7A X-射线晶体学结构，(分子生物学杂志236,1141-1153))和EDN(Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,重组的嗜酸性粒细胞产生的神经毒素在1183A分辨率下的X-射线晶体学结构，分子生物学杂志)的结构的序列对比为基础，建造杂种Rnase的模型。用ALIGN(Satow Y.,Cohen G.H.,Padlan E.A.,Davies D.R.,(1986),分子生物学杂志190,593-604)完成这点以及随后的序列对比。
H建造杂种Rnase的结构模型以Cα痕迹排列为基础，叠加Onc和EDN的坐标。当比较两种结构(90Cα原子对1.44A的球形r.m.s.d.)时，在保守区特别是活性位点中的残基几乎没有移位。人工重建杂种蛋白质的模型并用TOM(Cambillau C.,Horjales E.,(1987),J.Mol Graph 5,174-177)几何规则化。随后，确定rEDN(1-21)rOnc和rEDN(1-21)rOncG26模型的所有非氢原子的总15A2的B因子，然后用程序XPLOR(BrungerA(1992)XPLOR用于X射线晶体学和NMR的系统，New Haven:YaleUniversity Press)分别进行300循环的位置能量最小化。在这两种情况下，最小产生实际相同的结构，以Cα痕迹排列为基础，对于突变残基26的Cα来说，最高距离0.44。用PROCHECK(Laskowshi R.A.,MacArthur M.W.,Moss D.S.,Thornton J.M.,(1993),应用晶体学杂志26,283-291)评估最终模型的几何性质。
由于残基26距活性位点远，从中性蛋白质的模型中，在含Gly和Asp的杂种RNase之间，产生活性上显著差异的结构基础不明显。当在杂种蛋白质模型的结构上叠加与五核苷酸(Fontecilla-Camps J.C.,deLorens R.,leDu M.H.,Cuchillo C.M.,(1994),生物学化学杂志269,21526-21531)复合的高度同源的RNase A的结构时，观察到所述核苷酸也远离突变区。但是，在不同RNase中多核苷酸链的排列并不一定吻合。在EDN的结构中，除在活性位点中的外，还发现了第二个硫离子(Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,重组嗜酸性粒细胞产生的神经毒素在1.83A分辨率下的X-射线晶体学结构，分子生物学杂志)。所述第二个硫可能取代来自被裂解核苷酸的磷，但在RNase A-五核苷酸复合物中的等同位置上，没有磷离子。此外，该复合物中的一个磷酸与Lys-66(在Onc没有配对物的一个氨基)形成一个盐键，因为它位于在这两个分子中有不同拓扑结构的环中。因此，无论在嵌合体中，Asp和Gly突变体之间的酶活性差异是否与同底物的结合亲和性方面的变化有关仍是未解决的问题。
尽管尚不清楚两个EDN-Onc杂种活性方面差异的结构基础，但rEDN(1-21)OncG26杂种类似EDN的行为可能是由于N末端区的构型造成的，因为在nOnc中的焦谷氨酸和rEDN中的Lys-1均位于活性位点区(Mosiann S.C.,Ardelt W.,James M.N.g.,(1994),P-30蛋白质，一种具有抗肿瘤活性的两栖动物核糖核酸酶的精细的1.7A X-射线晶体学结构(分子生物学杂志236,1141-1153；Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,X-ray重组嗜酸性粒细胞产生的神经毒素在1.83A分辨率下的X-射线晶体学结构，分子生物学杂志)。另外，在[Met-(-1)]rOnc中导入Gly并没有显著影响酶活性。在RNase A的B1亚位点中U优于C是与特定残基(Asp-83)的存在有关(DelCardayre S.B.,Raines R.T.,(1995),残基-残基氢键介导核糖核酸酶A的核苷酸特异性，分子生物学杂志252,328-336)。在nOnc中的相应残基也是天冬氨酸(Asp-67)，而在EDN的该位置由组氨酸占据(His-82)。EDN对poly(A,C)更有活性，这表明它在B1亚位点中“优选”C，可能是因为它含有与nOnc和RNase A中的天冬氨酸相反的组氨酸残基。综合考虑，这可以解释相对于rEDN，含Gly的杂种的活性降低，因为根据所述假设，rOnc序列中Asp残基的存在比C更有利于U的结合。就PRI抑制作用的差异而言，在EDN-Onc和RNase A之间叠加表明EDN-Onc嵌合体中的Asp-26在与RNase A Asp-27等同的位置，已经报道Asp-27与PRI接触(KobeB.,Deisenhofer J.,(1995),自然374,183-186)。另外，两个嵌合体中的Asp-24与该区很接近。因此，该区负电荷的积累可能抑制了抑制剂的结合。如果是这样的话，Gly取代Asp减少了负电荷并保留了结合能力。
实施例Ⅱ rOnc-抗体融合蛋白
已经生产了其他的rOnc-抗体和配体蛋白并且有高活性。E6FB[Met-(-1)]SerrOnc是一个rOnc分子，含有SEQ ID NO:40所列的核酸序列和SEQ ID NO:41所列的氨基酸序列并包括来自抗体E6，一种抗运铁蛋白受体抗体的Fv序列。E6的序列在SEQ ID NO:41中的氨基酸位置1-237。“FB”指用于连接抗体和所述分子rOnc部分的接头，见SEQ ID NO:40中的核酸位置712-750。该分子包括在氨基酸位置252代替Glu的Ser。E6FB[Met-(-1)]Glu rOnc指SEQ ID NO:40中的序列。还制备了相似的杂种分子。Met-NLS(信号肽)-Gln-rOncFBE6的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:42和43。将另一E6/rOnc分子命名为Met-Ser-rOncA87FBE6并可见于SEQ ID NO:44和45。“A87”指在氨基酸位置87的Ala。
Met-Ser-rOnc-Ang-FBE6列于SEQ ID NO:46和47。
E6FB Met-Ser-rOnc列于SEQ ID NO:48和49。
Met-Glu-rOnc FBE6列于SEQ ID NO:50和51。
Met-Ser-rOnc FBE6列于SEQ ID NO:50和51。
除丝氨酸取代在氨基酸位置2的Glu外。
MOC31和MOC162指抗17-1-Apancarinoma抗原的抗结肠癌抗体，所述抗原是从Hennie Hoogenboom博士处得到的。将这些抗体的Fv区与rOnc融合。MetSerrOnc A87 FBMOC31的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:52和53。MOC31FB MetSerrOnc的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:54和55。MetSerrOnc FBMOC162的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:56和57。
将配体IL2(白细胞介素2)也与rOnc重组融合。IL2 FBMetSerrOnc见SEQ ID NO:58和59。MetSerrOncFB IL2见SEQ ID NO:60和61。
按上述测量在SF539细胞(它携带运铁蛋白受体)中，[Met-(-1)Ser]rOnc、E6FB[Met-(-1)Ser]rOnc；[Met-(-1)Set]rOnc-AngFBE6和[Met-(-1)Glu]rOncFBE6构建体的蛋白质合成的抑制作用，并与nOnc进行比较。结果列于表3。具体地说，三个E6构建体具有很高水平的活性——相对于两个非E6分子的差异高达45倍。也见图5。制备相应于SEQ IDNO:47氨基酸1-107的MetSerrOncAng分子。
表3修饰的rOnc和修饰的rOncFv对蛋白质合成的活性Rnase IC50(nM)差异倍数nOnc 10 1[Met-(-1)Ser]rOnc 8 NSDE6FB[Met-(-1)Ser]rOnc 0.2245[Met-(-1)Ser]rOnc-AngFBE6 0.2737[Met-(-1)Glu]rOncFBE6 0.5020
表中所示浓度为在SF539人神经胶质瘤细胞中对蛋白质合成的抑制达到50％所需的浓度。NSD，没有显著差异。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人苏姗娜·M·雷巴克；黛安娜·L·牛顿；刘易斯·博克；亚历山大·沃达韦尔(ⅱ)发明名称重组的核糖核酸酶蛋白(ⅲ)序列数39(ⅳ)通讯地址(A)收信人汤森和汤森和克鲁(Townsend and Townsend and Crew)(B)街道One Marker Plaza,Stenart Street Tower(C)城市旧金山(D)洲加利福尼亚(E)国家美国(F)邮编94105-1492(ⅴ)计算机可讯形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)当前申请资料(A)申请号美国尚未给出(B)申请日尚未给定(C)分类号(ⅷ)代理人信息(A)姓名Weber,Ellen Lauver(B)登记号32,762(C)案卷/卷宗号015280-244000(ⅸ)电讯信息(A)电话(415)543-9600(B)电传(415)543-5043(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度104个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..104(D)其它信息/标记=nOnc/注=“来自美洲豹蛙的天然ONCONASE(注册商标)”(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注=“Xaa=焦谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Xaa Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp1 5 10 15Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp
20 25 30Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys
35 40 45Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr
50 55 60Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys65 70 75 80Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val
85 90 95His Phe val Gly Val Gly Ser Cys
100(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度83个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1.83(D)其它信息/注=“来自美洲豹蛙基因组DNA的Rana克隆9的肽”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys1 5 10 15Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
20 25 30Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
35 40 45Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu
50 55 60Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro65 70 75 80Val His Phe
(2)SEQ ID NO:3的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度28个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1..28
(D)其它信息/注=“nOnc的N-末端序列，在1位由Glu取代了焦谷氨酸”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe
20 25
(2)SEQ ID NO:4的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度34个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1..34
(D)其它信息/注=“重组嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(rEDN)的N-末端序列”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Gln Cys Thr Asn Ala Met Gln Val Ile Asn Asn
20 25 30
Tyr Gln
(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度28个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1..28
(D)其它信息/注=“[Met-(-1)]rOncG20的N-末端序列，在[Met-(-1)]rOnc的20位含有Gly取代Asp的取代，并且没有来自大肠杆菌表达系统的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe
20 25
(2)SEQ ID NO:6的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度34个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1.34
(D)其它信息/注=“rEDN1-21rOnc的N-末端序列，没有来自大肠杆菌表达系统的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn
20 25 30
Leu Phe
(2)SEQ ID NO:7的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度34个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1..34
(D)其它信息/注=“rEDN1-21rOncG26的N-末端序列，在rEDN1-21rOncG26的26位含有Gly取代Asp的取代，并且没有来自大肠杆菌表达系统的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr Asn
20 25 30
Leu Phe
(2)SEQ ID NO:8的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度111个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词肽
(B)位置1..111
(D)其它信息/注=“来自Rana catesbeiana的青蛙凝集素”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
Glu Asn Trp Ala Thr Phe Gln Gln Lys His Ile Ile Asn Thr Pro Ile
1 5 10 15
Ile Asn Cys Asn Thr Ile Met Asp Asn Asn Ile Tyr Ile Val Gly Gly
20 25 30
Gln Cys Lys Arg Val Asn Thr Phe Ile Ile Ser Ser Ala Thr Thr Val
35 40 45
Lys Ala Ile Cys Thr Gly Val Ile Asn Met Asn Val Leu Ser Thr Thr
50 55 60
Arg Phe Gln Leu Asn Thr Cys Thr Arg Thr Ser Ile Thr Pro Arg Pro
65 70 75 80
Cys Pro Tyr Ser Ser Arg Thr Glu Thr Asn Tyr Ile Cys Val Lys Cys
85 90 95
Glu Asn Gln Tyr Pro Val His Phe Ala Gly Ile Gly Arg Cys Pro
100 105 110
(2)SEQ ID NO9的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度134个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词蛋白质
(B)位置1..134
(D)其它信息/注=“人嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(EDN)”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Gln Cys Thr Asn Ala Met Gln Val Ile Asn Asn
20 25 30
Tyr Gln Arg Arg Cys Lys Asn Glu Asn Thr Phe Leu Leu Thr Thr Phe
35 40 45
Ala Asn Val Val Asn Val Cys Gly Asn Pro Asn Met Thr Cys Pro Ser
50 55 60
Asn Lys Thr Arg Lys Asn Cys His His Ser Gly Ser Gln Val Pro Leu
65 70 75 80
Ile His Cys Asn Leu Thr Thr Pro Ser Pro Gln Asn Ile Ser Asn Cys
85 90 95
Arg Tyr Ala Gln Thr Pro Ala Asn Met Phe Tyr Ile Val Ala Cys Asp
100 105 110
Asn Arg Asp Gln Arg Arg Asp Pro Pro Gln Tyr Pro Val Val Pro Val
115 120 125
His Leu Asp Arg Ile Ile
130
(2)SEQ ID NO:10的信息
(ⅰ)序列特征
(A)长度133个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑学线形
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词蛋白质
(B)位置1..133
(D)其它信息/注=“人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白质(ECP)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Arg Pro Pro Gln Phe Thr Arg Ala Gln Trp Phe Ala Ile Gln His Ile1 5 10 15Ser Leu Asn Pro Pro Arg Cys Thr Ile Ala Met Arg Ala Ile Asn Asn
20 25 30Tyr Arg Trp Arg Cys Lys Asn Gln Asn Thr Phe Leu Arg Thr Thr Phe
35 40 45Ala Asn Val Val Asn Val Cys Gly Asn Gln Ser Ile Arg Cys Pro His
50 55 60Asn Arg Thr Leu Asn Asn Cys His Arg Ser Arg Phe Arg Val Pro Leu65 70 75 80Leu His Cys Asp Leu Ile Asn Pro Gly Ala Gln Asn Ile Ser Asn Cys
85 90 95Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Gly Arg Arg Phe Tyr Val Val Ala Cys Asp
100 105 110Asn Arg Asp Pro Arg Asp Ser Pro Arg Tyr Pro Val Val Pro Val His
115 120 125Leu Asp Thr Thr Ile
130(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度125个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..125(D)其它信息/注=“牛源血管生成素(Ang)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Ala Gln Asp Asp Tyr Arg Tyr Ile His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp1 5 10 15Ala Lys Pro Lys Gly Arg Asn Asp Glu Tyr Cys Phe His Met Met Lys
20 25 30Asn Arg Arg Leu Thr Arg Pro Cys Lys Asp Arg Asn Thr Phe Ile His
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50 55 60Pro Tyr Arg Gly Asp Leu Arg Ile Ser Lys Ser Glu Phe Gln Ile Thr65 70 75 80Ile Cys Lys His Lys Gly Gly Ser Ser Arg Pro Pro Cys Arg Tyr Gly
85 90 95Ala Thr Glu Asp Ser Arg Val Ile Val Val Gly Cys Glu Asn Gly Leu
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115 120 125(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度124个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..124(D)其它信息/注=“牛精液RNase”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Lys Glu Ser Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Gly1 5 10 15Asn Ser Pro Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Leu Met Met Cys Cys
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85 90 95Tyr Lys Thr Thr Gln Val Glu Lys His Ile Ile Val Ala Cys Gly Gly
100 105 110Lys Pro Ser Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
115 120(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度124个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..124(D)其它信息/注=“牛胰腺Rnase A”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ser1 5 10 15Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys Ser
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35 40 45Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val Ala
50 55 60Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met Ser65 70 75 80Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys Ala
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115 120(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Met Lys Xaa Pro1(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Met Lys Pro Xaa 1(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Met Asn Xaa Pro 1(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Met Xaa Lys Pro(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Met Xaa Pro Lys1(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..321(D)其它信息/注=“MetSerOnc86Ang104”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:ATC TCA GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Ile Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT CAG TCA ATT TTC CGT CGT CCG321Val His Phe Val Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro
100 105(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Ile Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
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50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro
100 105(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度333个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..333(D)其它信息/注=“EDNGlyOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:ATG AAA CCG CCG CAG TTC ACT TGG GCT CAG TGG TTC GAA ACT CAG CAT 48Met Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His 1 5 10 15ATC AAC ATG ACT TCT CAG GAT GTT GAT TGT GGT AAT ATC ATG TCA ACA 96Ile Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr
20 25 30AAC TTG TTC CAC TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT144Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro
35 40 45GAG CCA GTG AAG GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG192Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val
50 55 60TTA ACT ACC TCT GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG240Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg 65 70 75 80CCT TGC AAG TAT AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT288Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr
85 90 95TGT GAA AAT CAG GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 333Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度111个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Met Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His 1 5 10 15Ile Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr
20 25 30Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro
35 40 45Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val
50 55 60Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg 65 70 75 80Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr
85 90 95Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度315个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..315(D)其它信息/注=“MetTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:ATG TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Met Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ACT TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度105个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Met Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
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20 25 30GAC AAG AAC AGT TTT ACT TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC 144Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT 192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA 240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA 288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)长度105个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
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85 90 95Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)长度318个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..318(D)其它信息/注=“MetLysTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:ATG AAA TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA 48Met Lys Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr 1 5 10 15AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC 96Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys
20 25 30AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC 144Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala
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50 55 60TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA 240Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys 65 70 75 80TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA 288Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala
85 90 95CCA GTT CAT TTT GTT GGAGTT GGATCT TGT 318Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)长度106个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Met Lys Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr 1 5 10 15Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys
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85 90 95Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..321(D)其它信息/注=“MetAlaAlaTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:ATG GCT GCT TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC 48Met Ala Ala Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn 1 5 10 15ACA AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC 96Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His
20 25 30TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG144Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys
35 40 45GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT192Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser
50 55 60GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT240Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr 65 70 75 80AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG288Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln
85 90 95GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT321Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Met Ala Ala Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn 1 5 10 15Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His
20 25 30Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys
35 40 45Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser
50 55 60Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr 65 70 75 80Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln
85 90 95Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)长度336个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..336(D)其它信息/注=“NLSMetSerrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CCC AAG AAG AAG CGG AAG GTG ATG TCA GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA 48Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys 1 5 10 15AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA 96Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser
20 25 30ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT 144Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg
35 40 45CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT 192Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn
50 55 60GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC 240Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser 65 70 75 80AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA 288Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val
85 90 95ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 336Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)长度112个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys 1 5 10 15Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser
20 25 30Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg
35 40 45Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn
50 55 60Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser 65 70 75 80Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val
85 90 95Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=脂族氨基酸，Ala、Leu、Ile、Val或Pro”(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=脂族氨基酸，Ala、Leu、Ile、Val或Pro”(ⅸ)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Met,Cys,Ala或Gln”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33Cys Xaa Xaa Xaa1(2)SEQID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:34:Cys Val Ile Met
1(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:AGRGATGTKG ATTGYGATAA YATCATG(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:TGTGARAAYC AGGCMCCWGT KCAYTTT27(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)长度249个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词(B)位置1..249(D)其它信息/注=“Rana 9”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:GATGTTGATT GTGATAATAT CATGTCAACA AACTTGTTCC ACTGCAAGGA CAAGAACACT 60TTTATCTATT CACGTCCTGA GCCAGTGAAG GCCATCTGTA AAGGAATTAT AGCCTCCAAA 120AATGTGTTAA CTACCTCTGA GTTTTATCTC TCTGATTGCA ATGTAACAAG CAGGCCTTGC 180AAGTATAAAT TAAAGAAATC AACTAATAAA TTTTGTGTAA CTTGTGAAAA TCAGGCACCA 240GTTCATTTT 249(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)长度315个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..315(D)其它信息/注=“[Met-(-1)]rOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:ATG GAG GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Met Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)长度105个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Met Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105
SEQ ID NOS:40,41
SEQ ID NOS:42,43
SEQ ID NOS:44,45
SEQ ID NOS:46,47
SEQ ID NOS:48,49
SEQ ID NOS:50,51
SEQ ID NOS:52,53
SEQ ID NOS:54,55
SEQ ID NOS:56,57
SEQ ID NOS:58,59
SEQ ID NOS:60,61
SEQ ID NOS:62,6权利要求
1．一种核糖核酸酶分子，具有(a)可测量的核糖核酸酶活性；(b)从甲硫氨酸开始，后面可接除谷氨酸以外的任何氨基酸的氨基末端；(c)在氨基酸位置26、40、58、84、95和110的位置上为半胱氨酸，在位置41是赖氨酸，在位置119是组氨酸，所述位置是参考牛RNaseA(SEQ ID NO:13)的具体氨基酸位置确定的；和(d)自nOnc衍生的氨基酸序列。
2．权利要求1的核糖核酸酶，含有选自下列群组的氨基末端Met-Lys；Met-Tyr；Met-Ser；Met-Ala；Met-Arg和Met-Asn。
3．权利要求1的核糖核酸酶，含有选自下列群组的氨基末端
Met-Ala；
Met-Ala-Ala；
Met-Ala-Ala-Ser；
Met-Arg；
Met-(J)；
Met-Lys-(J)；
Met-Arg-(J)；
Met-Lys；
Met-Lys-Pro；
Met-Lys-(J)-Pro(SEQ ID NO:14)；
Met-Lys-Pro-(J)(SEQ ID NO:15)；
Met-Asn；
Met-Gln；
Met-Asn-(J)；
Met-Gln-(J)；
Met-Asn-(J)-Pro(SEQ ID NO:16)；
Met-(J)-Lys；
Met-(J)-Lys-Pro(SEQ ID NO:17)和
Met-(J)-Pro-Lys(SEQ ID NO:18)
其中(J)是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。
4．权利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Ala的氨基末端。
5．权利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Arg的氨基末端。
6．权利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Lys的氨基末端。
7．权利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Asn的氨基末端。
8．权利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Gln的氨基末端。
9．权利要求1的核糖核酸酶，具有选自Met-Ser；Met-Tyr或Met-Thr的氨基末端。
10．权利要求3的核糖核酸酶，其中在nOnc第2氨基酸位置(是牛RNase序列的位置4)上的天冬氨酸被缺失，或被Ala或Asn取代。
11．权利要求1的核糖核酸酶，含有由来自EDN氨基末端的序列编码的氨基末端，其后接来自rOnc的序列。
12．权利要求11的核糖核酸酶，其中所述氨基酸序列选自基本上与下式相同的序列
Met(-1)EDN(1-m)Onc(n-104)
其中Met(-1)指氨基末端残基Met；其中EDN(1-m)指长度为从EDN(SEQ ID NO:9)的氨基酸位置1开始，延续至并包括EDN第m位氨基酸的连续氨基酸序列；其中Onc(n-104)指从SEQ ID NO:1的氨基酸位置n开始，延续至并包括氨基酸位置104的连续氨基酸序列；以便:
当m是21时，n是16或17；
当m是22时，n是17；
当m是20时，n是16；
当m是19时，n是15；
当m是18时，n是14；
当m是17时，n是12或13；
当m是16时，n是11、12、13或14；
当m是15时，n是10；
当m是14时，n是9；
当m是13时，n是8；和
当m是5时，n是1。
13．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列。
14．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:22相同的氨基酸序列。
15．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列。
16．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列。
17．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列。
18．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:32相同的氨基酸序列。
19．权利要求1的核糖核酸酶，含有基本上与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列。
20．权利要求1的核糖核酸酶，含有来自血管生成素的羧基末端。
21．权利要求20的核糖核酸酶，含有基本上与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列。
22．基本上与SEQ ID NO:2所列的序列相同的氨基酸序列。
23．与配体结合部分或标记相连的权利要求1的核糖核酸酶。
24．权利要求23的核糖核酸酶分子，其中所述分子与抗体相连。
25．编码权利要求1的氨基酸序列的核酸序列。
26．一种药物组合物，含细胞毒性量的权利要求1的核糖核酸酶和可药用载体。
27．权利要求26的药物组合物，其中所述核糖核酸酶与配体结合部分相连。
28．选择性杀死细胞的方法，包括使待杀死的细胞与连接有配体结合部分的权利要求1的核糖核酸酶接触。
29．权利要求1的核糖核酸酶分子，还含有核定位信号。
30．权利要求1的核糖核酸酶分子，还含有内质滞留序列。
31．一种载体，含编码权利要求1的核糖核酸酶的核酸。
32．一种宿主细胞，含编码权利要求1的核糖核酸酶的核酸。
全文摘要
本发明涉及衍生于在美洲豹蛙的卵母细胞中发现的天然核糖核酸酶的核糖核酸酶。还描述了这些分子的各种人源化的和重组的形式以及其用途。
文档编号A61K38/00GK1212016SQ9719244
公开日1999年3月24日 申请日期1997年2月19日 优先权日1996年2月21日
发明者苏姗娜·M·雷巴克, 黛安娜·L·牛顿, 刘易斯·博克, 亚历山大·沃达韦尔 申请人:美国国有卫生与人类服务部